人SR-BI基因表达抑制慢病毒载体构建及其稳定细胞株的筛选

目的 建立SR-BI表达抑制的肝癌细胞系,以作为研究SR-BI基因突变对HCV感染性影响的细胞模型.方法 构建SR-BI短发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒重组质粒Lv-SR-BI-shRNA,挑取克隆进行PCR扩增和序列测定;将阳性重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染HEK2973T细胞,包装SR-BI shRNA慢病毒并进行病毒滴度测定.SR-BI shRNA慢病毒感染人肝癌细胞株Huh7和Huh7.5.1细胞,嘌呤霉素筛选,Real-time PCR和Western blot法检测SR-BI mRNA转录和蛋白表达.结果 测序结果证实Lv-SR-BI-shRNA慢病毒载体构建成功并获得HEK293T细胞中包装的慢病毒,Lv-SR-BI-shRNA重组慢病毒感染Huh7和Huh7.5.1细胞,感染组SR-BI mRNA转录降低,蛋白表达降低.结论 建立了SR-BI表达抑制的人肝癌细胞株Huh7-siSR-BI和Huh7.5.1-siSR-BI稳定细胞系.     

构建shRNA慢病毒载体抑制U937细胞株VEGFR-1基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR-1）基因的siRNA前体表达载体．鉴定其对U937细胞株VEGFR—j基因干扰效率。方法体外设计并合成针对VEGFR-1基因的慢病毒shRNA干扰载体．通过PCR及测序证实载体构建成功。将慢病毒颗粒以最适滴度转染人单核白血病细胞株U937．应用Real—TimePCR、Western印迹法检测抑制效率。结果构建的慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定,与设计序列相同。Real—TimePCR检测显示U937细胞干扰组VEGFR-1mRNA表达率下降75．98％,Western印迹法显示U937细胞干扰组VEGFR-1蛋白表达量较空白载体对照组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制U937细胞株VEGFR—1基因的表达。     

shRNA慢病毒抑制BGC823细胞株GnT-V表达的载体构建

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（GnT-V）基因的shRNA（short harpin RNA,siRNA前体）表达载体,鉴定GnT-V基因干扰效率。方法体外设计并合成针对GnT-V基因的慢病毒shRNA干扰载体,通过PCR及测序证实载体构建成功。将慢病毒颗粒以最适滴度转染人低分化胃癌细胞株BGC823,应用Real-Time PCR、Western blotting检测GnT-V抑制效率。结果构建的慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定证实与设计序列相同;Real-Time PCR检测显示干扰组BGC823细胞GnT-V mRNA表达率下降88.04%,Western blotting显示干扰组BGC823细胞表达GnT-V蛋白量较空白载体对照组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制BGC823细胞株GnT-V基因的表达。     

人notch1—shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建人notch1—shRNA慢病毒表达载体,为Notch信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pENTR／U6质粒,通过与pLenti6／BLOCK—iT—DEST载体的LR重组,构建notch1—shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导人293FT细胞,包装成慢病毒。用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SH—SY5Y细胞,RT-PCR和Westernblot法检测细胞notch1基因的表达。结果目的序列成功连接于载体并包装成较高滴度的慢病毒,细胞mRNA和蛋白质的检测均表明构建的notch1—shRNA慢病毒表达载体LR-ND-A能显著抑制SH-SY5Y细胞notch1基因的表达。结论成功构建人notch1—shRNA慢病毒表达载体。     

人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定

目的:构建人葡萄糖调节蛋白 94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Hyg中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blotting 法检测GRP94蛋白表达量。pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证。结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。HeLa细胞经慢病毒感染,药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白。结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVX-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础。     

人eIF4E基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的设计并构建人真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因shRNA慢病毒质粒表达载体。方法设计合成人eIF4E基因RNA干扰双链DNA片段,重组到慢病毒质粒PLVTHM上,然后进行PCR鉴定和测序分析。重组质粒与3种包装质粒混合,以LipoD293TMDNA In Vitro包裹后转染293T细胞,收获病毒上清液感染宫颈癌HeLa细胞。结果经过PCR鉴定出的重组载体测序结果与目的序列一致,成功构建人eIF4E基因shRNA慢病毒质粒表达载体及获得相应慢病毒,并成功感染HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达。结论成功构建人eIF4E基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

HOTAIR过表达慢病毒载体的构建及稳定细胞株的建立

目的构建稳定过表达HOTAIR的人滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系,并验证HOTAIR的表达。方法利用PCR技术扩增HOTAIR基因全长序列,并将其克隆入LV5载体中,构建LV5-HOTAIR载体,重组质粒经双酶切鉴定及测序验证成功后,转染人胚肾细胞293T,包装过表达病毒颗粒,制备并浓缩慢病毒颗粒。将构建好的过表达HOTAIR慢病毒载体感染HTR-8/SVneo细胞,采用嘌呤霉素筛选出HOTAIR稳定表达的细胞系,荧光显微镜观察绿色荧光表达;qRT-PCR验证HOTAIR表达。结果重组质粒酶切得到的条带与预期相符,过表达HOTAIR慢病毒载体中序列与目标序列一致。荧光显微镜下过表达HOTAIR组细胞有绿色荧光表达;qRT-PCR结果表明过表达HOTAIR的HTR-8/Svneo稳定细胞株中HOTAIR表达是Control组的206.3倍(P<0.05),是NC组的232.8倍(P<0.05)。结论成功建立稳定过表达HOTAIR的HTR-8/SVneo细胞,且过表达HOTAIR的HTR-8/Svneo稳定细胞株中HOTAIR mRNA表达水平明显升高。     

人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的：构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上定其沉默效率。 方法：针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用Real-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。 结果：构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×10⁸ PU/L。shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%。 结论：成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨慢病毒介导沉默信息调节因子1（silent information regulator 1,SIRT1）基因的 shRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计、合成2对针对SIRT1基因shRNA的寡核苷酸序列,与pLentilox3.7-GFP载体连接产生重组慢病毒质粒pshSIRT1-1、pshSIRT1-2,同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照pshCont。将表达shRNA的载体plentilox3.7与pLP1、pLP2和pLP/VSVG 3种质粒共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒感染人乳腺癌细胞MCF-7,行real time-PCR和Western blot验证SIRT1基因的沉默效果,台盼蓝排斥实验和流式细胞仪分别检测其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建靶向SIRT1基因shRNA慢病毒载体并获得了相应的慢病毒。2个靶向 SIRT1的shRNA均能有效抑制SIRT1基因的表达（P=0.000 2）,并使MCF-7细胞增殖明显减慢,凋亡明显增加（P=0.006 0）。结论：靶向SIRT1基因RNA干扰能显著抑制 MCF-7 细胞的生长并促进其凋亡。     

信号转录激活子3基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建人信号转录激活子3（STAT3）基因shRNA慢病毒载体。方法：从GenBank STAT3 mRNA上寻找到3条有效靶序列,合成3对针对靶序列的siRNA oligo,通过筛选获得最佳靶序列后合成相应的shRNA模板,将合成好的两条互补的DNA单链退火形成双链DNA,经与BamH Ⅰ和Xho I酶切的pRNAT-U6.2/Lenti载体连接后产生shRNA慢病毒载体,酶切和测序鉴定。结果：酶切和测序鉴证实合成STAT3shRNA慢病毒载体寡核甘酸链插入正确。结论：成功构建人STAT3基因shRNA慢病毒载体。     

核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的 构建表达小鼠核糖体蛋白S3a 特异性RNA干扰重组慢病毒载体(Lenti-shmRPS3a),分析其对细胞凋亡的影响。方法 设计针对小鼠RPS3a mRNA 4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接入慢病毒载体系统 pLLU2G-eGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度。病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和Western blot检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响。结果 PCR和测序证明成功构建出Lenti-shmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为6-9×10₇TU/ml;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64%、Western Blot证明RPS3a蛋白水平表达降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a慢病毒载体的细胞凋亡率较对照组明显升高。结论 表达小鼠核糖体蛋白S3a shRNA慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡。     

TCAB1慢病毒表达载体的构建及其在人子宫内膜间质细胞中的表达

目的构建TCAB1基因的慢病毒过表达载体并验证在人子宫内膜问质细胞株（St—T1b）过表达效果。方法通过PCR获取TCAB1全长基因,进行TA克隆,进一步亚克隆构建TCAB1慢病毒表达载体,包被慢病毒后感染St—T1b细胞,通过观察荧光表达和实时定量PCR验证其表达。结果成功构建PLVX-TCAB1-IRES—ZsGreen1慢病毒表达载体并获得相应的慢病毒。荧光显微镜、实时定量PCR结果表明,TCAB1基因可在St-T1b细胞中实现过表达效果。结论成功构建人TCAB1基因特异性的重组慢病毒过表达载体,且证实包被的慢病毒可实现TCAB1基因在St—T1b细胞中的过表达,为后续人TCAB1在人子宫内膜间质细胞的功能研究奠定了基础。     

Bcl-2shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用分子克隆技术,针对人bcl-2目的基因设计3个siRNA靶点和一个阴性对照序列,构建4对shRNA重组慢病毒表达载体,并进行测序验证鉴定。方法:以设计的有效靶序列进行引物合成,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的慢病毒RNA干扰载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性转化子,采用PCR扩增和DNA测序分别鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到335bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结论:成功构建4对bcl-2shRNA重组慢病毒表达载体,为研究靶向bcl-2 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

人晶状体上皮细胞BHMT基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)基因过表达慢病毒载体,并检测其在人晶状体上皮细胞中的表达效果。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增制备目的基因片段,构建BHMT慢病毒过表达载体,转染至293T细胞。运用免疫荧光法行病毒滴度检测,并利用荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,运用RT-PCR、Western blot检测鉴定BHMT mRNA蛋白的表达水平。将构建成功的慢病毒载体BHMT-GV358感染人晶状体上皮细胞,观察目的基因表达。结果:重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光,在稳定转染的细胞中BHMT及蛋白的表达水平较未转染细胞显著增高(P<0.05),体外转染人晶状体上皮细胞,荧光显微镜下可见BHMT表达。结论:成功构建过表达BHMT的慢病毒载体,并有效感染人晶状体上皮细胞,为进一步研究BHMT在白内障发生发展中的作用提供生物学基础。     

Smad3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建Smad3基因RNAi慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的Smad3基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EcoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSmad3慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用GC-shSmad3、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,构建出了Smad3 shRNA的慢病毒载体GC-shSmad3.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×103TU/ml.结论 成功构建Smad3基因RNAi慢病毒载体.     

VHL慢病毒表达和干扰载体的构建及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响

目的构建人VHL重组慢病毒表达载体及干扰载体,建立稳定转染细胞株,观察VHL对肾癌细胞株增殖和凋亡的影响。
方法构建pZsGreen1-VHL及pLL3.7-shVHL重组慢病毒载体,与3质粒包装系统用脂质体法共同转染293T细胞,包装成病毒
颗粒,分别感染A498、Caki-1细胞,并进行RT-PCR和Western blot检验细胞中VHL的表达。用MTS法和流式细胞仪检测VHL
对肾癌细胞增殖和凋亡效应的影响。结果重组慢病毒载体及稳定转染细胞株构建成功,转染后VHL在细胞中表达明显变化;
VHL过表达细胞的增殖速度明显低于各对照组,而凋亡率明显高于各对照组;VHL干扰细胞的增殖速度明显高于各对照组,而
凋亡率明显低于各对照组（P<0.05）。结论VHL对肾癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。