日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T/A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列,为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物,采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法,从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T/A克隆法,将其克隆入pMD18T载体,经双酶切分析和PCR鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RTPCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带;经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18TSjPGK中含有所扩增的基因序列;脱氧核糖核酸序列测定和分析,SjPGK基因片段长为830bp,与SmPGK的核苷酸同源性为85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段,为进一步实验提供了条件。     

日本血吸虫SjPGK基因克隆和序列分析

目的　克隆日本血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sj PGK)编码基因片段 ,分析其核苷酸序列。方法　根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sm PGK) c DNA序列设计并合成一对引物 ,以日本血吸虫成虫总 RNA为模板 ,采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)特异性扩增 Sj PGK基因片段 ,将其克隆入p MD18- T载体中 ,经双酶切分析和 PCR鉴定 ,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定 ;运用BL AST程序 ,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与 NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果　 RT- PCR特异性扩增出一条长约 830 bp的条带 ;重组质粒的双酶切和以其脱氧核糖核酸为模板的 PCR均可见一条与 RT- PCR产物相同的条带 ;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明 :Sj PGK基因片段长为 830 bp,与 Sm PGK的核苷酸同源性为 85 % ,分值为 6 72 ;氨基酸同源性为 94 % ,分值为 4 73。结论　成功地克隆了 Sj PGK编码基因片段 ,为寻找日本血吸虫新的抗感染疫苗候选分子奠定基础     

日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达

目的　克隆和表达日本血吸虫大陆株原肌球蛋白 (tropomyosin ,TM)编码基因。方法　应用RT PCR方法体外扩增日本血吸虫原肌球蛋白编码基因 ,并采用T载体对该PCR产物直接进行克隆并用于核苷酸序列的测定。将目的基因亚克隆入原核表达载体pQE30 ,以IPTG诱导重组原肌球蛋白的表达。结果　PCR扩增产物约 82 3bp ,符合预计大小 ,并成功地克隆入T载体 ,对其中一克隆pGSjcTM12的插入片段的核苷酸序列分析表明 ,该序列和推测的氨基酸序列与曼氏血吸虫原肌球蛋白基因分别有 91 1%和 98 1%的同源性。该编码基因亚克隆入原核表达载体pQE30获得高效表达 ,分子量约 32kDa,并能被日本血吸虫天然原肌球蛋白免疫血清特异识别。结论　日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和原核表达成功。     

巢式RT-PCR分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)的基因5''末端序列

目的：测定日本血吸虫组织蛋白酶L1（SjCL1)基因的5'端序列。方法：从日本血吸虫成虫中提取总RNA，以该RNA为模板，进行巢式RT－PCR，扩增SjCL1基因5'端序列。将其与pMD18-T载体连接得到含SjCL1基因5' 端序列的重组质粒，并测定上述DNA插入片段的序列。结果：通过巢式RT－PCR扩增出332bp SjCL1基因5'端序列，测序后，与报道的SjCL1基因部分序列拼接后，可得到一个编码317个氨基酸的完整开放阅读框。结论：使用巢式RT－PCR技术，扩增得到SjCL1基因的5'端序列。为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因克隆和序列分析

目的克隆日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）基因,并进行序列分析。方法制备日本血吸虫成虫mRNA,反转录合成cDNA,采用聚合酶链反应（PCR）技术,从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出SjTGR基因片段。通过TA克隆技术将该基因片段克隆到pGEM-T载体中进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果采用PCR技术成功地从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出TGR基因片段,TA克隆后DNA序列分析显示该基因长度为1791bp,编码596个氨基酸残基,理论分子质量65kDa,生物信息学分析显示与曼氏血吸虫TGR氨基酸序列同源性为82%,含有吡啶核苷酸二硫化物氧化活性中心CVNVGC序列,在氨基端含有谷氧还蛋白特征性的活性位点CPFC基序。结论SjTGR基因克隆获得成功,为发展抗日本血吸虫新药及疫苗候选分子奠定了基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)20.2 kDa分子编码基因(Sj20.2)的克隆及序列分析

目的：克隆日本血吸虫中国大陆株20.2kDa分子的编码基因，方法：根据筛选到的日本血吸虫肝期童虫cDNA文库阳性克隆之一的插入片段序列，设计合成1对引物，通过PCR技术对其最大开放阅读框进行扩增，然后克隆人pGEM-T载体，并对克隆产物进行核苷酸序列测定和分析，利用在线软件推测其编码氨基酸的序列，结果：利用PCR方法从上述插入片段中扩增出1条单一的DNA条带，大小介于515bp与697bp之间，将此产物克隆入pGEM-T载体，双酶切和PCR反应结果都出现与前述结果一致的目的片段，核苷酸序列测定结果表明此开放阅读框全长564bp，在线软件分析结果表明，此片段编码187个氨基酸，编码肽段分子量大小约为20．0dDa，结论：本次实验成功扩增和克隆出目的基因片段，为下一步研究奠定了基础。     

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因克隆

目的 :克隆日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因。方法 :用 PCR方法根据已发表日本血吸虫菲律宾株副肌球蛋白基因部分核苷酸序列扩增大陆株副肌球蛋白基因。结果 :获得一日本血吸虫大陆株 72 0 bp基因克隆。结论 :经核苷酸序列分析证实 ,本克隆基因与菲律宾株基因核苷酸同源性为 99.0 3%。     

中华按蚊抗菌肽defensinA编码基因cDNA克隆与序列分析

目的克隆中华按蚊defensin编码基因，并对其序列进行分析。方法提取中华按蚊总RNA。据文献报道合成1对引物deft、def2，RTPCR扩增中华按蚊defensin编码基因，克隆于T-载体，序列测定与分析。结果RT—PCR扩增中华按蚊cDNA获大约308bp片段，测定目的片段序列，结果显示，克隆基因cDNA序列长度为308bp，推导编码64个氨基酸，序列分析显示中华按蚊defensin编码基因与冈比亚按蚊defensin编码基因有高度同源性（95％）。分析结果显示，中华按蚊defensin编码基因为新基因，定名为中华按蚊defensinA。结论克隆出中华按蚊defensinA编码基因，为进一步研究该基因打下了基础。     

日本血吸虫14—3—3抗原编码基因的克隆及序列测定

为了寻找日本吸虫病新的诊断和候选疫苗分子,设计合成引物,以日本血吸虫成虫cDNA第一链为模板,用PCR法扩增出日本血吸虫14－3－3抗原（Sj14-3-3）基因编码序列,其大小约784bp,将其克隆入pGEM-T载体,重组质粒pGEM-T-Sj14-3-3经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为765bp的完整开放阅读框,与曼氏血吸虫14－3－3核苷酸序列有高度同源性。本实验克隆了日本血吸虫14－3－3抗原的编码基因,并进行了序列测定,为进一步研究提供了条件。     

T载体的构建及日本血吸虫肌动蛋白基因PCR产物的快速克隆

目的构建快速高效克隆PCR产物的克隆载体(T载体),并对日本血吸虫肌动蛋白全长编码基因PCR产物进行快速克隆.方法日本血吸虫肌蛋白全长编码基因的扩增采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.质粒pGEM5Zf ( )经限制性内切酶EcoR V 酶切,在仅含有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的PCR缓冲液中于70 ℃作用2 h,在每个片段的3'端加上一个脱氧胸苷(dT)碱基,构建成T载体.根据PCR扩增产物3'端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷(dA)原理,将扩增产物直接克隆入T载体并测序.结果阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析、PCR及DNA序列测定等均证实克隆获得成功,且效率很高.与曼氏血吸虫肌动蛋白比较,核苷酸和推断的氨基酸的同源性分别是92.5%和99.7%.结论构建的pGEM5Zf-T载体对日本血吸虫肌动蛋白编码基因的PCR产物直接克隆既经济、简便,又快速、高效,所构建的T载体由于在插入位点两侧具有pUC/M13测序引物序列,可直接测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列.所获得的日本血吸虫(大陆株)肌动蛋白编码基因与曼氏血吸虫有极高的同源性.     

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的：克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白（SjEP）编码基因，以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法：设计合成引物，分别以日本血吸虫雌、雄成虫cDNA第一链为模板，用PCR法从中扩增出SjEP基因编码序列，将其克隆入pGEM-T载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果：PCR法从雌虫cDNA中扩增出大小为624bp SjEP基因编码序列，重组质粒pGEM-SjEP经双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段，序列测定结果表明具有一个长度为624bp的完整开放阅读框，与日本血吸虫（菲律宾株）虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性（99．9％）。结论：本实验成功地克隆了SjEP编码基因，并进行了序列测定，为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达

目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因。方法依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物，上游和下游引物分别引入BamH I和Sal I酶切位点。以日本血吸虫大陆株（安徽株，简称Sjc-A）成虫总RNA为模板，反转录PCR (RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因。经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT，转化感受态E．coli BL21，并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcHGPRT/E．coli BL21I程菌用IPTG诱导表达，重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析。结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp，构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段，根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株（湖南株，简称Sjc-H）及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性。获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析，分子量约30 kDa，并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别。结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功，并获得了纯化重组蛋白，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础。     

大劣按蚊前酚氧化酶基因部分序列的克隆与序列分析

目的 克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)前酚氧化酶(Prophenoloxidase，PPO)基因部分序列。方法 根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物，以大劣按蚊总RNA为模板进行RT—PCR扩增，目的片段经TA克隆后测定其核酸序列，然后进行序列查询与比对。结果 大劣按蚊PPO基因(AdPPO)部分序列长598bp，编码199个氨基酸；AdPPO与冈比亚按蚊PPO5基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84．23％和88．89％。结论 成功克隆出AdPPO部分序列，其与冈比亚按蚊PPO基因序列具有很高同源性。     

猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因.方法用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆后,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,并将其亚克隆入pUC18质粒载体中,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列.测序后与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析.结果经3次筛选,从cDNA文库中克隆出一个阳性克隆,测序后其长度为546 bp,含有一个开放读码框,编码158个氨基酸.同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因(NC-9)同源性高达99%.结论本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因.     

A组β-溶血性链球菌DNase B基因序列的克隆与序列分析

目的　克隆A组β -溶血性链球菌 (GroupAStreptococcus,GAS)DNaseB基因序列。 方法　根据genBank中登录的多种DNA酶B的序列 ,进行同源性分析 ,设计相对保守的针对DNaseB基因的引物 ,以链球菌基因组为模板进行PCR扩增 ,目的片段经TA克隆至pMD18-T质粒后测定其核酸序列 ,然后进行序列的查询与比对。结果　成功克隆出A组链球菌DNaseB基因全长序列共 810bp ,其中包括中 12 8bp的信号肽编码区和 6 81bp的成熟肽编码区 ,以及 5’端非编码区的一个T。结论　A组 β-溶血性链球菌DNaseB基因序列的成功克隆 ,为对其深入研究打下坚实基础     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列，比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因，并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后，用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp，编码442个氨基酸。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因；序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

Mago nashi：—个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的运用免疫学方法筛选日本血吸虫(中国大陆株)童虫cDNA文库，寻找血吸虫新基因，并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Mago nashi样蛋白基因。方法用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫eDNA文库，随机挑取阳性重组克隆进行测序，以获得血吸虫基因，并通过BLAST程序进行比较及同源性分析，根据分析结果设计合成引物，用PCR法扩增出日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因(SiM)编码序列，将其克隆入pGEM—T载体和pBKCMV载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果本研究共挑取7个阳性克隆，通过测序获得了5个有表达序列标签(Expressed Sequenee Tag.EST)价值的序列，并进行了同源性分析；用PCR法扩增出大小为441bp SjM开放阅读框，重组质粒pGEM—SiM和pBKCMV-SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。结论本实验获得了5个有EST价值的序列，并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdr1、Cgl基因T—A克隆及序列分析

目的：将恶性疟原虫FCC1／HN株（CQS）Pfmdrl和Cgl全基因编码区克隆入测序载体，测定其序列，为以后研究其为疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法：利用PCR扩增技术，分3个片段从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中，特异扩增Pfmdrl全基因编码序列；分2个片段特异扩增Cgl基因编码序列。扩增产物经纯化回收后，T－A克隆入测序载体pMD18-T，转化大肠杆菌（E.coli)jm109，筛选阳性克隆，并进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果：CQS FCC1／HN株Pfmdrl基因序列与CQS Fc27株同源性高，全长4248bp，编码1415个氨基酸；测得Cgl基因全长为2820bp，编码939个氨基酸，存在串联α重复序列。结论：恶性疟原虫FCC1／HN（CQS）株Pfmdrl和Cgl全基因编码序列的测定，为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。     

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及原核表达载体构建

目的　构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (Listeriamonocytogenes,LMO)溶血素基因重组表达质粒。 方法　本文采用PCR方法扩增出LMO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin ,hly)基因 ,将其克隆到pMD18-T中 ,筛选带有插入片段的阳性质粒。经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。继而用SalⅠ和XbaⅠ双酶切阳性质粒 ,目的片段定向插入pPROEXTMHTa中进行鉴定。结果　hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6bp。核苷酸序列鉴定后 ,其核苷酸序列与国外报道的LMOF6 789株、LMOF2 36 5株同源性分别为 99 70 %和 99 39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99 82 %和 98 90 %。重组表达质粒经PCR及酶切鉴定表明为正确重组子。结论　在国内首次克隆到LMOhly全基因 ,并构建出含hly基因的原核表达载体。此项工作为进一步LMO溶血素基因的表达奠定了基础。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 为了进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能，丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因；将Sj16基因定向克隆入pcDNA3，转化感受态DHA5α菌；用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。以重组pcDNA3－Sj16质粒为模板，用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列，应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因，重组质粒中含有Sj16基因，成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3－Sj16；Sj16基因开放读码框有354碱基，编码117氨基酸，N端18个氨基酸可能为信号肽序列；Sj16与Sm16有高度同源性，只存在一个氨基酸的差异。结论 成功克隆了Sj16基因的真核表达载体，并测定、分析了Sj16基因序列，为深入研究Sj16的免疫调节功能，丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础。