不同恶性程度胶质瘤细胞基因的差异表达

弄清胶质瘤基因表达谱的变化，对深入研究胶质瘤发生、发展的分子机制有重要意义。本实验用基因芯片技术，比较不同恶性程度的人胶质瘤细胞系CHG-5（WHO分级Ⅱ级）和SHG-44（WHO分级Ⅳ级）的差异表达基因，为胶质瘤分子机制的进一步研究提供基础资料，以期改善胶质瘤的诊断和治疗。     

两种级别胶质瘤细胞系代谢基因的差异表达

目的 基因的异常表达和功能调节在胶质瘤的进展过程中扮演着重要的作用.然而,导致胶质瘤由低级向高级进展的基因通路远未阐明.本实验拟从不同级别的胶质瘤细胞系筛选代谢相关的差异表达基因,为进一步研究胶质瘤进展的机制提供实验基础.方法 以两株不同级别的胶质瘤细胞系(CHG-5,WHO Ⅱ级;SHG-44,WHO Ⅳ级)和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)为实验模型,运用cDNA微阵列技术进行研究.通过芯片杂交,分别检测CHG-5以及全反式维甲酸诱导前后SHG-44的基因表达谱,筛选差异表达基因;随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果.结果本实验发现13个与胶质瘤进展密切相关的代谢基因存在差异表达,它们涉及细胞的糖类和核苷酸代谢.其中,TPI1,BPGM,ALDOA,AKR1B1,LDHA,ADSL,RRM1和NP表达上调,而UGT287,ACAT1,IMPDH2,PRPS1和PKM2表达下调.此外,有5个基因(TPI1,BPGM,ALDOA,LDHA和RRM1)在全反式维甲酸诱导的SHG-44细胞中也出现差异表达,提示这些基因不仅存在于不同级别的胶质瘤细胞系之间,而且存在于分化诱导处理的胶质瘤细胞之间.部分差异表达基因为Northern杂交实验所验证.结论 利用cDNA微阵列技术首次发现有13个差异表达基因与胶质瘤细胞的代谢密切相关,它们可能在胶质瘤的恶性转化和进展中扮演着重要的作用.     

神经节细胞胶质瘤恶变及其差异表达基因分析

目的探讨神经节细胞胶质瘤恶性进展的分子变化,为进一步研究分子病因奠定基础。方法取同一患者不断恶化的3次手术标本,行cDNA微阵列检测,分析在不同阶段持续存在的差异表达基因。结果初发(WHO II级)、复发(WHO III级)和再发(WHO IV级)的标本与正常脑组织相比,差异表达基因共19条,其中下调者16条,上调者3条。在下调的基因中,功能明确者有抑制RAF1/MEK/ERKs激酶通路激活的磷酸酰乙醇胺结合蛋白,抑制肿瘤血管增生、侵袭,调控细胞凋亡的碳酰还原酶;抑制c-myc基因表达的肺库否样因子;参与人DNA切除修复的多聚酶ε。结论神经节细胞胶质瘤恶变过程中持续存在的分子变化,以抑制肿瘤增殖基因表达下调为主,其中RAF激酶抑制蛋白、DNA多聚酶ε和碳酰还原酶是参与细胞信号传导和DNA损伤修复等具重要功能的基因,值得进一步研究。     

抑癌基因PTEN与胶质瘤细胞侵袭和迁移的体外实验研究

目的:研究抑癌基因PTEN对脑胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响。方法:用PTEN表达型质粒转染大鼠C6胶质瘤细胞,利用Matrigel体外侵袭实验和细胞迁移运动实验进行细胞侵袭和迁移的研究。结果:转染PTEN的大鼠C6胶质瘤细胞侵袭与迁移能力均明显下降。结论:PTEN在体外可以有效的抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移过程,其具体机制还有待进一步探讨。     

全反式维甲酸抑制MDM2基因在胶质瘤细胞SHG-44中的表达

目的 探讨全反式维甲酸对胶质瘤细胞SHG-44中MDM2基因表达的影响,为进一步研究脑胶质瘤的进展机制及基因治疗提供依据.方法 分别利用cDNA微阵列与Western blot技术分析在10μmol/L全反式维甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)处理前后的胶质瘤SHG-44细胞MDM2基因和蛋白的差异表达应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(Streptavidin-Peroxidase,SP)法检测Ⅱ级与Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的表达.随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果.结果 应用cDNA微阵列检测发现,MDM2基因在ATRA处理与未处理的SHG-44细胞之间表达量的比值为0.37,提示ATRA可抑制MDM2基因在SHG-44中的表达.该结果进一步得Northern杂交实验结果的支持.Western blot分析结果显示10μmol/L ATRA处理前后胶质瘤SHG-44细胞之间MDM2蛋白的相对表达量分别为21.40±0.58和14.02±0.35(t=24.728,P=0.000),提示MDM2蛋白在SHG-44中的表达受到ATRA抑制.Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的阳性表达率分别为24.00%(6/25)和56.52%(13/23)(X2=5.298,P=0.021),MDM2蛋白的表达随胶质瘤恶性程度的增高而增加.结论 ATRA可抑制SHG-44胶质瘤细胞中MDM2基因的表达,MDM2基因的表达水平与胶质瘤的演进有关.     

脑胶质瘤侵袭性相关因素

脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,呈侵袭性生长,临床预后较差。其侵袭过程是一个复杂的多步骤连续过程,涉及到粘附分子、酶类、细胞因子、基因调控等多方面的因素。对其侵袭性的研究将对临床治疗产生积极的影响。本文就脑、胶质瘤侵袭过程及相关因素的研究现状作一综述。     

恶性星形胶质瘤中转录因子的表达异常

目的研究人类星形胶质瘤中转录因子(TF)的表达异常.方法用cDNA微阵列方法研究人类正常大脑和星形胶质瘤中转录因子的表达.共3个标本标本1混合了3例三级星形胶质瘤,标本2混合了2例四级星形胶质瘤(胶质母细胞瘤,GBM),标本3为对照,混合了4例正常大脑组织.33p标记的cDNA与带有14 000个cDNA片断的微阵列膜杂交,通过比较肿瘤标本和对照标本的光密度来分析各基因,相差2倍以上被认为表达有差异.结果普查了109个转录因子.GBM标本中转录因子的表达高于三级胶质瘤(表达比率为1.33±0.28和1.10±0.16,P＜0.001).在2个肿瘤标本中共有13个异常表达的转录因子.在三级胶质瘤中有4个上调基因和1个下调基因,在GBM中有6个上调基因和5个下调基因.转录因子ⅡB在2个标本中均下调(三级胶质瘤中为0.21倍,GBM中为0.28倍).有2个因子在2个标本中均上调,它们为HMGI-C(分别为2.17倍和4.13倍),和基本转录因子2(BTF2)63kDa亚单位(分别为2.81倍和2.69倍).结论在三级胶质瘤和GBM中有转录因子的异常表达.TFⅡB、HMGI-C、BTF2 63kDa亚单位是进一步研究的目标.     

miR-221与miR-222通过靶基因TIMP3调控胶质瘤细胞侵袭能力

目的 探讨miR-221和miR-222在胶质瘤细胞侵袭过程中的作用及其机制.方法 采用反义寡核苷酸下调miR-221和miR-222表达,Transwell、Western blot、荧光素酶实验及体内实验分别检测细胞侵袭能力、体内肿瘤生长、相关基因蛋白表达变化及靶基因鉴定.结果 下调miR-221和miR-222表达能明显抑制胶质瘤细胞侵袭能力,同时相关侵袭蛋白MMP2和MMP9表达下降.miRNA靶基因预测软件分析、Western blot、荧光素酶实验证实TIMP3是miR-221和miR-222的靶基因.裸鼠皮下肿瘤模型显示下调miR-221和miR-222表达抑制体内肿瘤生长.免疫组化发现TIMP3表达上调,MMP2和MMP9表达下调.结论 在胶质瘤细胞中,侵袭相关蛋白TIMP3是miR-221和miR-222的一个新靶基因.

Abstract：

Objective To investigate the role and mechanism of miR -221 and miR -222 in glioma cell invasion. Method After reduction of miR -221 and miR -222 by antisense oligonucleotides, cell invasion,invasion related - gene expression and target identification were determined by Transwell assay, Western blot analysis and luciferase reporter assay,respectively. Moreover,the effects of miR -221 and miR -222 on xenograft tumors in nude mice were also observed. Results Down - regulation of miR - 221 and miR - 222 decreased glioma cell invasion in vitro, and inhibited glioma growth in a subcutaneous mouse model. Furthermore,down -regulation of miR -221 and miR - 222 resulted in obvious inactivation of MMP2 and MMP9. Western blot analysis and luciferase reporter assay showed that the reduction of miR - 221 and miR -222 repressed TIMP3 protein expression and TIMP3 mRNA 3'UTR existed the biding sites of miR -221 and 222. Conclusions TIMP3 is a novel target of miR -221 and miR -222 in glioma cell invasion.     

应用差异显示技术克隆胶质瘤细胞诱导分化相关基因

目的 克隆胶质瘤细胞诱导分化相关新基因。方法 应用RNA随机引物差异显示，SSCP纯化，PCR产物快速克隆，反Northern杂交及生物信息学分析等方法，观察人脑胶质瘤细胞株SHG－44－9分化过程中的基因表达变化。结果 克隆了诱导分化前后表达差异显著的15个基因，其中诱导后下调基因4个，上调基因11个。同源性分析表明，5个是已知基因，10个是未知基因。诱导后上调的DIG－1基因与c-myc内含子结合蛋白1（MIBP1）基因高度同源，此基因具有转录因子活性，表达的蛋白可抑制c-myc基因的表达。结论 克隆了15个人脑胶质瘤细胞诱导分化相关基因，其中控制c-myc基因表达的MIBP1基因诱导分化后上调提示，它可能是调控胶质瘤细胞分化基因，值得进一步研究。     

miR-125b对胶质瘤细胞侵袭能力影响的体内研究

目的探讨体内miR-125b表达对人脑胶质瘤细胞侵袭力的影响及其可能的机制。方法培养原代胶质瘤细胞,分别转染miR-125b mimics和miR-125b inhibitor慢病毒载体,上调或下调细胞中miR-125b表达水平,种植乳鼠皮下,Transwell试验评价胶质瘤细胞侵袭能力的变化,Western Blot验证侵袭相关基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及RECK和TIMP3蛋白的表达。结果转染miR-125b mimics能有效提高原代胶质瘤细胞中miR-125b的表达,miR-125b inhibitor有效降低miR-125b的表达;体内实验表明miR-125b mimics及inhibitor对胶质瘤侵袭能力无明显影响,不影响侵袭相关MMP-2、MMP-9及RECK、TIMP3蛋白的表达。结论体内miR-125b表达水平与原代胶质瘤细胞的侵袭能力无明显相关。     

胶质瘤干细胞概念下的肿瘤侵袭

胶质瘤是常见的颅内肿瘤,呈侵袭性生长,临床预后差.胶质瘤的侵袭过程是一个复杂多步骤的连续过程,主要包括黏附、降解和迁移等环节,涉及黏附分子、酶类和细胞因子等多方面因素.胶质瘤中有一部分亚群即胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC),其具有正常干细胞的特性和原始细胞的多样性,与肿瘤的启动、增殖、侵袭、复发及放化疗抵抗有关.进行GSC侵袭性的研究对揭示其生物学行为和改善胶质瘤临床治疗效果可产生积极的影响.     

反义miR-21通过RECK抑制胶质瘤细胞侵袭性生长的体内外研究

目的 探讨胶质瘤细胞LN229中RECK作为miR-21的调控靶点,在胶质瘤侵袭性生长中的作用.方法 将反义miR-21(AS-miR-21)寡核苷酸转染至人脑胶质瘤细胞LN229中.Real-time PCR检测LN229细胞中miR-21的表达量.荧光素酶实验检测miR-21对RECK的调控关系.Transwell实验评价LN229细胞侵袭能力的变化,应用Western blot检测细胞内MMP2/9和RECK蛋白水平的变化,ELISA实验检测培养基中活性MMP2/9的表达量,动物实验评价体内条件下肿瘤侵袭性的变化.结果 Real-time PCR显示转染组中miR-21的表达量与对照组相比下调60%.荧光素酶实验证明RECK是miR-21的靶点.Transwell实验证实胶质瘤细胞侵袭能力下降,Western blot和ELISA实验证实MMP2/9表达降低,动物实验及免疫荧光反映肿瘤侵袭性生长受抑制.结论 反义miR-21通过上调RECK的表达而抑制恶性胶质瘤细胞的侵袭性生长.

Abstract：

Objective To investigate the regulation of miR - 21 on invasion growth of human glioma cells by RECK.Method The human glioma LN229 cells were transfected with AS - miR - 21 or scrambled sequences by Lipofectamine2000.Real time PCR was conducted to detect the expression of miR-21.Luciferase experiment was performed to detect the relationship between miR-21 and RECK.The expression of RECK was evaluated by Western blot.The invasion ability was evaluated by transwell assay and subcutaneous models.Western Blot, ELISA and immunofluorescence were used to estimate the changes of MMP2/9.Results The expression of miR - 21 in LN229 cells decreased after transfection with AS-miR-21. It was proved that RECK was a direct target of miR -21 by luciferase experiment.Meanwhile, the high expression of RECK protein in AS - miR -21 group conformed its important function in this mechanism.Transwell assay demonstrated decreased invasion capability of LN229 cell lines transfected with AS- miR- 21.Western blot, ELISA, and immunofluorescence demonstrated the levels of MMP2/9 were down -regulated in AS -miR -21 group compared with control and scrambled group.Conclusions AS - miR -21 could depress the invasion of glioma cells owing to up - regulating the level of RECK which could inhibit MMP2/9 activities both in vitro and vivo.     

U251胶质瘤细胞侵袭性原子力显微镜研究

目的探讨胶质瘤表面特化结构对其侵袭性的影响。方法应用原子力显微镜．对U251胶质瘤细胞系进行观测。结果胶质瘤细胞表面有大量伪足结构和微绒毛结构。结论原子力显微镜是研究亚细胞超微结构的有力武器。胶质瘤的微绒毛和伪足结构与其侵袭性相关。     

miR-181a和miR-181b抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭

目的 探讨miR-181a和miR-181b对胶质瘤细胞增殖和侵袭等影响.方法 通过实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181b在胶质瘤组织和细胞株中的表达情况.我们合成miR-181a和miR-181b寡聚核苷酸及构建pre-miR-181a和pre-miR-181b表达载体,转染胶质瘤细胞,通过MTT、Transwell实验、流式检测和软琼脂实验,观察上调miR-181a和miR-181b表达后对胶质瘤细胞增殖、侵袭、转化能力和细胞凋亡的影响.结果 miR-181a和miR-181b在胶质瘤组织和细胞株较正常脑组织均呈过低表达;miR-181a表达水平与胶质瘤等级呈负相关.上调miR-181a和miR-181b表达能有效抑制胶质瘤细胞生长,降低其转化和侵袭能力,诱导凋亡.结论 胶质瘤中异常低表达的miR-181a和miR-181b可能发挥着肿瘤抑制因子作用.     

Syndecan-1基因沉默抑制胶质瘤A172细胞增殖和侵袭

目的探讨多配体蛋白多糖-1(Syndecan-1,SDC1)在不同胶质瘤细胞株中的表达水平及其沉默对A172细胞的增殖和侵袭的影响。方法通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western Blotting分析SDC1在不同胶质瘤细胞株中的表达水平;将携带SDC1 sh RNA的慢病毒载体感染A172细胞,稳定沉默的细胞株为干扰组,未转染为阴性对照组,转染scramble序列为空白对照组;采用MTT法、台盼蓝拒然法和流式细胞术检测细胞增殖能力,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭力;q RT-PCR和Western Blotting检测相关蛋白变化。结果SDC1在不同的胶质瘤细胞株中表达强度不同,差异具有统计学意义(P0.05)。成功构建稳定沉默SDC1的A172细胞株;与阴性对照组和空白对照组相比,干扰组细胞增殖受到抑制(P0.05),迁移力(58.40±5.24 vs.255.8±16.09、226.5±22.84,F=126.4,P0.05)和侵袭力(61.67±16.26 vs.233.70±17.24、244.30±28.15,F=69.87,P0.05)明显抑制;SDC1、PCNA和MMP-9 m RNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论沉默SDC1基因的表达可抑制胶质瘤A172细胞的增殖、迁移和侵袭,提示SDC1可能成为胶质瘤生物治疗的新靶点。     

胶质瘤相关基因Tob的功能研究

目的研究Tob基因在胶质瘤细胞系SHG-44中的功能,为下一步进行试验性治疗提供依据.方法按照Tob基因的GenBank登录号D38305,构建带有绿色荧光蛋白（GFP）和新型抗生素Zeocin抗性基因的pTracer-EF/V5-His A表达载体.利用脂质体将上述表达质粒转入SHG44胶质瘤细胞.在各个不同的培养时段选择2、4、8、16、24、36、48 h分别在倒置显微镜下观察,最后在48 h时取未转染和转染的细胞大约105个作细胞涂片,进行荧光显微镜摄影和GFAP免疫组化染色分析.同时作体外生长曲线和细胞周期的流式细胞术分析.结果酶切鉴定和序列分析均证实Tob基因被成功克隆,将此基因成功转染到SHG-44细胞后,荧光显微镜观察可见用4μg脂质体和2μg DNA,最后用10μg/mLZeocin筛选可以达到90%的阳性细胞数.在转染Tob基因成功的细胞中GFAP染色的阳性率也同样升高.细胞在转染了Tob基因以后生长速度明显变慢,几乎处于停滞状态.流式细胞术分析显示在体外培养24 h后转染阳性细胞G2/M期比例明显减少,而凋亡细胞比例也出现明显的升高.结论Tob基因转染后的胶质瘤细胞生长受到明显抑制,出现向正常胶质细胞的分化和凋亡现象,提示Tob基因确实是一胶质瘤细胞增殖抑制基因,值得进一步做功能研究和实验性基因治疗研究.     

γ刀照射对胶质瘤细胞基因蛋白水平表达的影响

目的观察胶质瘤C6细胞伽玛刀治疗后基因蛋白水平表达的变化.方法胶质瘤C6细胞在培养瓶中培养,接受不同剂量(5.0 Gy和6.22 Gy)的伽玛刀照射,应用免疫组化技术和图像分析研究p16基因和C-myc基因的表达.结果伽玛刀治疗显著地抑制了C-myc基因蛋白水平的表达,激活了p16基因蛋白水平的表达.实验组C6细胞C-myc基因灰度值为154.4±4.7(5.0 Gy),161.7±5.8(6.22 Gy);对照组为130.28±2.4.实验组C6细胞p16基因灰度值为155.4±2.0(5.0 Gy),124.9±7.1(6.22 Gy);对照组为167.1±6.2.结论胶质瘤C6细胞的凋亡与激活了p16基因蛋白水平的表达和抑制了C-myc基因蛋白水平的表达相关.     

一条人脑胶质瘤相关新基因的克隆与表达

目的运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因，并对其中一条与脑胶质瘤相关的新基因进行了克隆和表达的研究。方法抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针，经杂交、洗涤后，通过计算机观察二者表达谱的差异情况，对681F05克隆子进行了Northern blot，生物信息学分析和蛋白质的表达。结果通过四次基因芯片筛选，获得15条与胶质瘤相关的新基因，经northern blot证实681F05基因在人正常脑组织中低表达，而在人脑胶质瘤中高表达。BLASTn和BLASTx分析显示，它们编码蛋白与线虫Cyp-10蛋白同源性分别为52％和72％。cDNA序列分析发现这两个克隆是同一个基因[命名为cyclophilin—like gene（PPIL3）]的两个不同的剪切体（PPIL3a和PPIL3b）。并在大肠杆菌中得到了PPIL3a和PPIL3b与GST较好表达的融合蛋白。结论基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少，高质量，高速度，高敏感等特性。681F05基因可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因。     

幼年和成年大鼠C6脑干胶质瘤侵袭性差异的比较

目的探讨幼年和成年Wistar大鼠脑干胶质瘤侵袭性的差异。方法 50只幼年和成年Wistar大鼠随机分4组,A组（n=15）和C组（n=15）分别将大鼠C6胶质瘤细胞注射到幼鼠和成鼠脑桥,B组（n=10）和D组（n=10）大鼠分别注射等体积生理盐水到幼鼠和成鼠脑桥。2周后MRI观察肿瘤生长情况并测量体积,常规行苏木精-伊红染色观察肿瘤组织形态学变化,免疫组织化学染色检测细胞侵袭相关因子基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和β-catenin的表达。记录4组大鼠生存时间。结果 MRI检查结果：A、C组在脑桥均发现肿瘤,肿瘤平均体积分别为（49.63±8.34）mm3和（52.07±7.77）mm3,两者无统计学差异（P〉0.05）;B、D组无肿瘤生长。A、C组大鼠平均生存时间分别为（19.47±2.23）d和（21.47±2.23）d,统计学比较有显著性差异（P〈0.05）;B、D组大鼠至另2组大鼠全部死亡时仍存活。A、C组肿瘤形态观察及MMP-2、MMP-9、β-catenin的表达无明显差异（均P〉0.05）。结论成功建立幼年和成年大鼠脑干胶质瘤动物模型,但二者肿瘤侵袭性无明显差异。