两种级别胶质瘤细胞系代谢基因的差异表达

目的 基因的异常表达和功能调节在胶质瘤的进展过程中扮演着重要的作用.然而,导致胶质瘤由低级向高级进展的基因通路远未阐明.本实验拟从不同级别的胶质瘤细胞系筛选代谢相关的差异表达基因,为进一步研究胶质瘤进展的机制提供实验基础.方法 以两株不同级别的胶质瘤细胞系(CHG-5,WHO Ⅱ级;SHG-44,WHO Ⅳ级)和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)为实验模型,运用cDNA微阵列技术进行研究.通过芯片杂交,分别检测CHG-5以及全反式维甲酸诱导前后SHG-44的基因表达谱,筛选差异表达基因;随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果.结果本实验发现13个与胶质瘤进展密切相关的代谢基因存在差异表达,它们涉及细胞的糖类和核苷酸代谢.其中,TPI1,BPGM,ALDOA,AKR1B1,LDHA,ADSL,RRM1和NP表达上调,而UGT287,ACAT1,IMPDH2,PRPS1和PKM2表达下调.此外,有5个基因(TPI1,BPGM,ALDOA,LDHA和RRM1)在全反式维甲酸诱导的SHG-44细胞中也出现差异表达,提示这些基因不仅存在于不同级别的胶质瘤细胞系之间,而且存在于分化诱导处理的胶质瘤细胞之间.部分差异表达基因为Northern杂交实验所验证.结论 利用cDNA微阵列技术首次发现有13个差异表达基因与胶质瘤细胞的代谢密切相关,它们可能在胶质瘤的恶性转化和进展中扮演着重要的作用.     

不同恶性程度胶质瘤细胞基因的差异表达

弄清胶质瘤基因表达谱的变化，对深入研究胶质瘤发生、发展的分子机制有重要意义。本实验用基因芯片技术，比较不同恶性程度的人胶质瘤细胞系CHG-5（WHO分级Ⅱ级）和SHG-44（WHO分级Ⅳ级）的差异表达基因，为胶质瘤分子机制的进一步研究提供基础资料，以期改善胶质瘤的诊断和治疗。     

全反式维甲酸抑制MDM2基因在胶质瘤细胞SHG-44中的表达

目的 探讨全反式维甲酸对胶质瘤细胞SHG-44中MDM2基因表达的影响,为进一步研究脑胶质瘤的进展机制及基因治疗提供依据.方法 分别利用cDNA微阵列与Western blot技术分析在10μmol/L全反式维甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)处理前后的胶质瘤SHG-44细胞MDM2基因和蛋白的差异表达应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(Streptavidin-Peroxidase,SP)法检测Ⅱ级与Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的表达.随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果.结果 应用cDNA微阵列检测发现,MDM2基因在ATRA处理与未处理的SHG-44细胞之间表达量的比值为0.37,提示ATRA可抑制MDM2基因在SHG-44中的表达.该结果进一步得Northern杂交实验结果的支持.Western blot分析结果显示10μmol/L ATRA处理前后胶质瘤SHG-44细胞之间MDM2蛋白的相对表达量分别为21.40±0.58和14.02±0.35(t=24.728,P=0.000),提示MDM2蛋白在SHG-44中的表达受到ATRA抑制.Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的阳性表达率分别为24.00%(6/25)和56.52%(13/23)(X2=5.298,P=0.021),MDM2蛋白的表达随胶质瘤恶性程度的增高而增加.结论 ATRA可抑制SHG-44胶质瘤细胞中MDM2基因的表达,MDM2基因的表达水平与胶质瘤的演进有关.     

胶质母细胞瘤基因表达谱及相关基因的聚类研究

目的探讨人脑胶质母细胞瘤发生、发展中相关基因的表达及功能.方法用含13 939种人类基因的BioStarH140S型表达谱芯片,以正常成人脑及不同级别胶质瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片;ScanArray 4000扫描芯片荧光信号,提取脑及胶质瘤组织差异基因并进行生物信息分析;用Hierarchical聚类对胶质瘤差异基因进行特征提取;用Northern杂交验证及进行初步功能研究.结果正常脑与18例不同级别胶质瘤组织间筛选出多类差异表达基因,通过生物信息学和Hierarchical聚类,发现α-连环素、微型染色体维护蛋白7、细胞周期素B2、FBX05、着丝粒蛋白F基因与胶质母细胞瘤密切相关,该类基因在低级别胶质瘤中表达差异不明显,但胶质母细胞瘤中表达明显上调.Northern杂交显示该类基因与胶质母细胞瘤密切相关,与芯片结果一致.结论基因表达谱芯片可快速、高效地筛选胶质瘤相关基因,发现的5条基因与胶质母细胞瘤侵袭性强密切相关,可成为判断胶质瘤预后的分子生物学指标.     

Screening of differentially expressed genes related to differentiation and proliferation by gene expression profiling of different grade astrocytoma cell lines*☆

BACKGROUND： The detection of differential gene expression in brain is possible by cDNA microarray technology, and the screening of differentially expressed genes might provide a biological basis for gene-targeted therapy for tumors. OBJECTIVE： To detect the differential expression of genes among astrocytoma SHG-44 （WHO grade Ⅳ）, CHG-5 （WHO grade Ⅱ）, and ATRA-treated SHG-44 cell lines by cDNA microarray. DESIGN： Laboratory experiments in vitro. SETTING： Department of Neurobiology, the Third Military Medical University. MATERIALS： The experiment was performed at the Department of Neurobiology in the Third Military Medical University of the Chinese PLA from January to October 2007. The SHG-44 cell line （WHO grade Ⅳ） was established by Prof. Ziwei Du, and the CHG-5 cell line （WHO grade Ⅱ） was set up by Prof. Xiuwu Bian from the Third Military Medical University of the Chinese PLA. The cDNA microarray containing 9182 known genes was prepared and provided by Dr. Yang Zhong at the City University of Hong Kong. METHODS： To screen differentially expressed genes from the gene expression profiles detected by cDNA microarray comparisons were made between CHG-5 and SHG-44 cells and between SHG-44 cells with or without treatment with 10 μmol/L ATRA. Some differentially expressed genes were selected randomly for Northern Blot analysis to confirm the results of the microarray. The determination criteria for differential gene expression were as follows. ① The ratio of Cy5 signal to Cy3 was greater than 2.0 or less than 0.5. ② The results of the triplicate microarray hybridizations showed the same trend in three experiments. ③ A gene appeared at least two times on the triplicate microarray hybridizations, and the 3^rd value did not show a contradictory trend. A normalized ratio of Cy5 intensity to Cy3 greater than 2.0 or less than 0.5 was considered to represent up-regulated or down-regulated gene expression, respectively. MAIN OUTCOME MEASURES： The identification of genes that were sim     

精神分裂症患者外周血白细胞基因差异表达的基因芯片研究

目的 研究健康人及精神分裂症患者外周血白细胞基因表达谱，分析精神分裂症患者基因表达水平的变化。方法 取6例精神分裂症患者和6名健康人的外周血白细胞，提取总。RNA，在反转录cDNA时，分别用Cy3、cy5两种激发波长荧光标记，获得两组样本cDNA探针。将两组探针混合后与含8464条人类基因表达谱芯片杂交，扫描、分析杂交结果。结果 当Cy5与Cy3比值大于2或小于0．5时，在6对样本7次试验中有13条基因在精神分裂症患者中均下调表达。当Cy5与Cy3比值大于1．5或小于0．7时，在6对样本7次试验共同出现差异的基因有31条，其中2条基因在精神分裂症患者中上调表达，29条下调表达。结论 精神分裂症患者的一些基因表达水平与正常人存在差异，这些基因主要与免疫、神经细胞发育、神经传递、髓鞘形成有关。     

诺帝诱导人胶质瘤细胞系CHG-5分化的蛋白质表达图谱的建立及差异蛋白质组分析

目的建立诺帝诱导人胶质瘤细胞系CHG-5分化的蛋白质表达图谱并比较其表达差异。方法分别用100μmol/L、200μmol/L诺帝诱导CHG-5细胞分化,观察处理后24h、48h、72h细胞的形态改变;分别提取200μmol/L诺帝处理后的CHG-5细胞和对照组细胞总蛋白,进行双向电泳,所获蛋白表达图谱用PDquest 7.1软件比较其蛋白质表达差异,选取部分高表达的差异蛋白进行质谱分析。结果100pμmol/L和200μmol/L诺帝处理后均可明显诱导CHG-5细胞分化,以72h时细胞分化最为明显。双向电泳发现诱导分化后细胞出现了18个差异蛋白点,其中9个蛋白点表达上调,9个蛋白点表达下调,并获得差异蛋白的分子量、等电点等信息。对其中部分高表达的差异蛋白点成功地进行了质谱鉴定。结论诺帝诱导人胶质瘤细胞系CHG-5分化时蛋白质组改变涉及到细胞增殖、凋亡、基因转录、蛋白表达调控等各个方面。     

125I对体外培养的胶质瘤细胞C-myc、p53基因表达及细胞增殖的影响

目的探讨125I对体外培养的胶质瘤细胞SHG-44C-myc、p53基因表达及细胞增殖的影响。方法利用免疫组化技术检测经125粒子放射处理3d后,SHG-44细胞的C-myc蛋白表达与p53蛋白表达水平。结果经1粒、3粒125粒子放射处理3d后,SHG-44细胞C-myc蛋白表达明显减弱,而p53蛋白表达显著增强。二者呈负相关。结论125I可以通过影响C-myc基因与p53基因的表达抑制人脑恶性胶质瘤细胞株SHG-44增殖,从而抑制胶质瘤的生长。     

脂质体介导CD基因转染SHG-44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD重组表达质粒转染SHG-44胶质瘤细胞，体外观察5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染CD基因的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；脂质体Lipofectamine 2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选培养获取抗性细胞克隆（即SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学检测SHG-44／CD细胞的CD基因蛋白水平表达；流式细胞仪、TUNEL实验及透射电子显微镜观察5-FC对表达CD基因的SHG-44／CD细胞凋亡的诱导作用。结果含CD基因的pCMVCD质粒成功转染进入SHG-44细胞，获取了含CD基因的SHG-44／CD细胞，免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。在含5-FC的培养液中培养，SHG-44／CD细胞出现典型的凋亡形态，TUNEL显示凋亡细胞比例极高；透射电镜可见凋亡改变；流式细胞术检测凋亡率达18．6％，凋亡率呈剂量依赖性。结论建立了SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞的CD／5-FC自杀基因系统。诱导SHG-44／CD胶质瘤细胞产生凋亡可能是脑胶质瘤CD基因疗法的重要机制。     

利用基因芯片研究与胶质母细胞瘤侵袭性相关的基因

目的探讨利用基因表达谱芯片筛选人脑胶质母细胞瘤与侵袭性相关基因的表达及功能。方法用含13 939种人类基因的BioStarH140S型芯片,以成人脑及6例胶质母细胞瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片;ScanArray4 000扫描芯片荧光信号,提取脑及胶质母细胞瘤组织差异基因,并进行生物信息分析及功能研究。结果表达谱芯片筛选出胶质母细胞瘤差异基因198条(1.42％),与细胞信号和传递蛋白、细胞骨架、代谢、蛋白翻译合成、细胞周期蛋白类、癌基因和抑癌基因等多类基因密切相关;与侵袭性相关的8条细胞骨架和细胞外基质基因表达谱相似,均在胶质母细胞瘤中显著上调,生物信息分析为α-连环素基因、钙粘附素1基因、层粘连蛋白、纤连蛋白1基因、基质金属蛋白酶2、Ⅲ型胶原基因、组织金属蛋白酶抑制1基因和血小板衍生生长因子受体A基因。结论表达谱芯片是高通量筛选胶质瘤相关基因的生物高新技术,侵袭性相关基因为判断胶质母细胞瘤患者的预后提供了分子生物学指标,有助于临床诊治。     

过表达TBX2对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨TBX2表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法 采用RT-qPCR和免疫印迹法检测53例胶质瘤组织和瘤旁组织TBX2mRNA和蛋白表达水平。体外培养胶质瘤细胞（U251、U87和SHG-44）和正常星型胶质细胞（HA1800）,采用RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平。构建TBX2过表达或低表达U251细胞株,分别采用WST-1法检测胶质瘤细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 胶质瘤组织TBX2 mRNA和蛋白表达水平明显高于瘤旁组织（P<0.05）,而且,高级别胶质瘤TBX2表达水平显著高于低级别胶质瘤（P<0.05）。相比于人正常星型胶质细胞系HA1800,胶质瘤细胞系U251、U87、SHG-44细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）;而且,U251细胞TBX2表达水平显著高于U87和SHG-44细胞（P<0.05）,因此使用U251细胞进行后续实验。过表达TBX2显著增加U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）,低表达TBX2显著抑制U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）。结论 胶质瘤TBX2呈高表达,与胶质瘤增殖、侵袭能力有关。     

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染SHG-44胶质瘤细胞的实验表达研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的重组表达质粒（recombinant plasmid vector）pCMVCD转染SHG-44胶质瘤细胞，建立胶质瘤嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因治疗系统。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；改良Eagle培养基（DMEM）培养SHG-44胶质瘤细胞；脂质体lipofectamine2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选重组子；免疫细胞化学检测表达情况。结果测序证实pCMVCD质粒含有CD基因；脂质体成功介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，获取了抗性细胞克隆（定名SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。结论脂质体介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞的方法简单、高效；成功建立了胶质瘤CD／5-FC自杀基因治疗系统，为后续实验研究打下了基础。     

侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤的基因差异表达谱

目的 利用基因芯片研究侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤的基因差异表达谱.方法 应用Illumina人全基因组基因表达芯片检测6例侵袭性垂体腺瘤以及6例非侵袭性垂体腺瘤组织的基因表达谱,并选择其中差异表达的两个基因进行逆转录一聚合酶链反应RT-PCR验证.结果 基因芯片筛选出差异表达基因153条,包括63条上调表达基因和90条下调表达基因,其中部分差异表达基因是细胞粘附、癌基因、信号传导等的相关基因.对上调基因CDH12(N-cadherin 2)和下调基因KLF4 (Kruppel-like factor 4)行RT-PCR验证结果与芯片结果相符.结论 侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤的基因表达谱存在差异,其中差异表达基因SERPINE1 (serpin peptidase inhibitor,clade E,member 1)与KLF4可能通过作用于细胞生理过程在垂体腺瘤的侵袭性中发挥着一定作用.     

125Ⅰ诱导大鼠脑内胶质瘤凋亡实验研究

目的研究125Ⅰ诱导人脑胶质瘤细胞系SHG-44体内外凋亡的可能性及其机制.方法体外培养SHG-44细胞,采用流式细胞仪法检测125Ⅰ诱导SHG-44细胞凋亡及对细胞周期影响,采用立体定向的方法建立大鼠脑内人胶质瘤模型,1周后经MRI检测后,于肿瘤区接种125Ⅰ,2周后复查MRI检测肿瘤大小,3周后处死大鼠,取对照组及肿瘤周边组织及肿瘤组织行Bcl-2、p53免疫组织化学染色.结果SHG-44细胞接种1周,MRI示脑内形成实体瘤;125I可抑制肿瘤生长,诱导细胞凋亡,延长荷瘤鼠生长周期,抑制Bcl-2基因表达,促进p53蛋白表达.结论125Ⅰ具有体内、外抑制SHG-44细胞增殖,诱导凋亡的作用;其诱导凋亡机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达,促进p53蛋白表达有关.     

胶质瘤细胞系A172、U251、U87和SHG-44中HER2的表达及意义

目的 探讨人表皮生长因子受体2(HER2)在人神经胶质瘤细胞系A172、U251、U87和SHG-44中的表达情况.方法 采用Western blot 和流式细胞术(FCM)于蛋白质水平检测HER2在四种人胶质瘤细胞系中的表达.结果 Western blot检测出HER2在人胶质瘤细胞系A172中的表达量最高,U251次之,U87和SHG-44表达量较低.FCM检测结果显示HER2在A172、U251、U87和SHG-44中的阳性率分别为36.5%、21.5%、3.3%和3.5%.结论 人胶质瘤细胞系A172和U251中HER2的表达量较高,这两种细胞系可作为良好的细胞模型来研究HER2分子在胶质瘤中的作用机制以及以HER2为靶点的生物治疗等.     

阿尔茨海默病患者基因表达谱差异分析

目的 用基因芯片技术研究阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者与健康老人之间基因表达谱差异,筛选与AD病理过程相关联的基因。方法 分别抽AD患者和健康老人外周血白细胞的总RNA,逆转录合成cDNA,并分别以Cy5和Cy3荧光标记,作为探针,与2张含有4 096条双点人类全长基因的芯片进行杂交。扫描仪扫描芯片荧光信号图像,用软件对扫描图像进行数字化处理和分析。结果 AD患者与健康老人相比较,表达差异3倍以上共有30个基因。结论 AD患者与健康老人的基因表达存在差异,提示这些差异表达的基因可能与AD的发病及病理过程有关。     

人脑胶质瘤细胞系miRNA表达谱初步研究

目的 确定部分人脑胶质瘤细胞系miRNA表达谱的初步特征.方法 提取人脑胶质母细胞瘤细胞系U251、TJ861、TJ905、TJ899和A172以及星形细胞瘤细胞系H4细胞的miRNA,miRNA微阵列芯片杂交,扫描后分析差异表达的miRNA.选择差异表达的miR-21设计反义寡核苷酸处理U251细胞后原位杂交和Western blot检查SEPT 7的表达.结果 在胶质瘤细胞系中hsa-miR-21等8种miRNA一致表达上调;hsa-miR-1等18种miRNA一致表达下调.miR-21锁核酸修饰反义寡核苷酸处理U251细胞72h后,原位杂交发现阳性信号集中在细胞核的miR-21表达显著下降,Western blot发现U251细胞中SEPT 7的表达明显上调.结论 miRNA的差异表达可能是胶质瘤的重要分子生物学标签,并在基因表达调控中具有潜在的研究价值.     

外源性IFN—β基因稳定转染对胶质瘤细胞凋亡的影响

目的研究外源性干扰素—β(IFN-β)基因对胶质瘤细胞系SHG-44的诱导凋亡作用，探索胶质瘤基因治疗的新途径。方法利用脂质体转染方法将IFN-β真核表达载体pSV2IFNβ导入人SHG44胶质瘤细胞。应用流式细胞仪和免疫荧光法检测IFN-β基因的稳定转染及表达，利用Hoechst染色、透射电镜观察细胞凋亡情况。结果IFN-β基因成功转染SHG44胶质瘤细胞并得以表达，并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡。结论IFN-β能够诱导入SHG44胶质瘤细胞凋亡，本实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础。