天然珊瑚和同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程支架的细胞相容性研究

目的 :评价天然滨珊瑚 (NC)和同种异体脱钙骨 (DBM)的细胞相容性 ,探讨其作为骨髓基质细胞的支架载体构建骨组织工程的可行性。方法 :应用体外复合骨髓基质细胞培养法 ,通过倒置显微镜和MTT比色法 ,并对测量结果进行统计学分析 ,研究生物材料对骨髓基质细胞的形态、增殖的影响。结果 :两种材料对骨髓基质细胞形态均未见不良影响 ;NC在各培养时间对骨髓细胞增殖没有明显影响 (P >0 .0 5) ,DBM对骨髓细胞增殖均起促进作用 (P <0 .0 1)。结论 :两种材料均具有良好的细胞相容性 ,可以作为骨髓基质细胞的载体和骨组织工程支架     

复合新型骨基质材料体内外成骨能力的组织工程研究

为评价一种新型无机－有机复合骨基质材料（new bone-martrix material,NBM)的体内外成骨能力，取骨髓基质干细胞来源的成骨细胞与材料进行体外复合培养，复合体再行肌内植入，通过相差显微镜，扫描电镜以及组织学观察体内外成骨情况。结果发现，体外培养时成骨细胞与材料可发生良好的粘附、增殖、并分泌大量细胞外基质成分，而细胞－材料复合体肌内植入后4周可见大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，8周仍未见新生骨组织生成。作者认为NBM的这种体内外成骨能力的差异可能与NBM具有免疫原性，引起宿主免疫反应，从而丧失体内成骨环境有关。     

天然珊瑚和同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程支架的组织相容性研究

目的：评价天然滨珊瑚(NC)和同种异体脱钙骨(DBM)的组织相容性，探讨其作为骨组织工程支架的可行性。方法：将NC和DBM直接植入动物体内，术后1、2、6周取材，通过大体观察和组织学检查观察生物材料在体内组织反应。结果：两种材料均未引起明显的炎症和排斥反应，对实验动物无不良影响。同时发现DBM组诱导出少量骨组织，NC组未见新生骨。结论：NC和DBM具有良好的组织相容性，DBM还具有鲁诱导性，两种材料可能都是比较理想的骨组织工程支架材料。     

骨髓基质成骨细胞-松质骨基质复合人工骨肌袋移植的成骨作用

成年新西兰兔骨髓细胞体外培养、诱导后 ,经混匀、接种、固化形成骨髓基质成骨细胞 藻酸盐 松质骨基质复合人工骨 ,并植回取材兔肌袋内 ,对照组分别植入藻酸盐 松质骨基质复合物和松质骨基质。植入 4、8周取材 ,行X线摄片、组织学检查 ,观察骨形成情况。结果显示 ,骨髓基质成骨细胞 松质骨基质复合人工骨肌袋内成骨效果明显优于藻酸盐 松质骨基质复合物组和松质骨基质组。复合人工骨标本兼有膜内成骨和软骨成骨 ,以膜内成骨为主 ;对照组仅见少量软骨成骨。提示 ,采用组织工程方法形成的复合人工骨肌袋内成骨作用明显 ,用该方法所形成的组织工程骨展现出良好的应用前景。     

聚羟基丁酸酯与骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

取4周龄新西兰兔骨髓，分离骨髓基质细胞，体外培养，经诱导分化为成骨细胞，接种于聚羟基丁酸酯（PHB）泡沫材料中，并植入裸鼠背部皮下，对照组单纯植入PHB。植入4、8周后行X线摄片和组织学观察，观察新骨形成情况。结果显示，PHB与3同髓基成骨细胞植入裸鼠皮下4周后，愕部形成骨组织，可见大量成内细胞，某些部位可见红色的骨基质形成；8周形成大量新生骨级,可见要反层骨。对照 组未见骨形成。     

同种骨基质明胶、脱钙骨基质、不脱钙骨肌内诱导成骨的实验研究

本实验将同种骨基质明胶（BMG）、脱钙骨基质（DBM）和不脱钙骨（UDB）植入大鼠肌肉内。结果发现，植入BMG和DBM的大鼠肌内有密度增强的X线影像，并在组织学上有成熟的新骨出现。而植XUDB的大鼠肌内仅有少量间充质细胞向软骨母细胞分化。作者讨论了肌内诱导成骨的发生机制以及三种材料的抗原差异，认为BMG的骨诱导能力最强。     

可塑形组织工程骨体内成骨的实验研究

目的探讨用藻酸钙凝胶、成骨细胞、生物衍生颗粒骨复合构建可塑形组织工程骨及其修补兔颅骨缺损的体内成骨。方法24只日本大耳白兔,随机分为两组,用藻酸钙凝胶-成骨细胞-生物衍生颗粒骨和藻酸钙凝胶-生物衍生颗粒骨分别填补修复A组(16只)兔颅骨左右两侧直径1cm的圆形骨膜-全层颅骨缺损(左侧为A1组,右侧为A2组),B组(8只)为空白对照组。通过大体、组织学观察和图像分析、X线、钙磷含量测定评估其体内成骨状况。结果材料植入后,局部未见异常反应。(1)A1组手术后12周时颅骨缺损已基本被硬组织所修复,镜下见修复材料已大多被骨组织替代,颗粒骨被吸收,成骨面积百分比为(40.92±19.36)%,明显高于A2组(P<0.05)和B组(P<0.01)。X线片见兔颅骨缺损处有高密度骨痂影存在,布满整个缺损区。缺损修复组织的钙、磷含量分别为(7.30±0.93)mg、(3.11±0.42)mg,明显高于A2组和B组。(2)A2组手术后12周,颅骨缺损部分被硬性组织所修复,镜下见材料部分转变成骨组织和纤维组织,成骨面积百分比为(18.51±6.01)%,高于B组,但差异无统计学意义,X线片见兔颅骨缺损处高密度骨痂影主要分布在缺损区的边缘部位。缺损修复组织的钙、磷含量分别为(5.29±0.17)mg、(2.34±0.35)mg,明显高于B组。(3)B组骨缺损主要被膜样组织修复,在紧邻骨缺损处有硬组织形成,镜下见修复组织边缘有骨组织存在,中央大部为膜状致密纤维组织,成骨面积百分比为(12.72±9.46)%,X线片仅见靠近骨缺损边缘的部位存在致密骨痂影。缺损修复组织的钙、磷含量分别为(3.54±0.45)mg、(1.78±0.53)mg。结论藻酸钙凝胶-成骨细胞-生物衍生颗粒骨构建的可塑形组织工程骨可根据颅骨缺损的形态进行塑形填补,在体内有良好的成骨能力,可基本达到对兔颅骨缺损的骨性修复。     

以BMSCs为基础构建组织工程骨修复种植区骨量不足的实验研究

 目的 评价以骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)为基础构建组织工程骨修复种植体周围骨缺损的成骨效果。方法 在3只犬双侧下颌前磨牙区各植入2颗种植体,分为对照组和实验组,每组6颗种值体;在种植体远中制备骨缺损,对照组每侧骨缺损区随机植入富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和实验组成骨诱导培养BMSCs复合PRP。分别于移植后1、3个月取材,行大体、影像学及组织学观察。结果 1个月后,实验组可见较多的骨基质,较少的胶原纤维。实验组骨密度值大于对照组(101±8.99)vs(93±9.81),差异有统计学意义(P<0.05)。3个月后,实验组可见较多的哈弗系统,实验组与对照组骨密度值变化不大(100.75±12.05)vs(105±11.58),差异无统计学意义。结论 以BMSCs为基础的组织工程骨能在种植体周围较好地成骨。     

髓髓基质成骨细胞—松质骨基质复合人工骨肌袋移植的成骨作用

成年新西兰兔骨髓细胞体外培养、诱导后，经混匀、 接种、固化形成 骨髓基质成骨细胞－藻酸盐－松质骨基质复合人工骨，并植回取材兔肌袋内，对照组分别植入藻酸盐－松质骨基质复合物和松质骨基质。植入4、8周取材，行X线摄 片、组织学检查，观察骨形成情况。结果显示，骨髓基质成骨细胞－松质骨基质复合人工骨肌袋内成骨效果明显优于藻酸盐－松质骨基质复合物组和松质骨基质组。复合人工骨标本兼有膜内成骨和软骨成骨，以膜内成骨为主；对照组仅见少量软骨成骨。提示，采用组织工程方法形成的复合人工肌袋内成骨作用明显，用该方法所形成的组织工程骨展现出良好的应用前景。     

富血小板血浆在组织工程骨成骨中的作用研究

目的探讨自体富血小板血浆（PRP）在骨缺损部位骨组织修复面的作用。方法在新西兰大耳白兔进行自体富血小板血浆的制备,同时制造骨组织缺损创伤模型,随机分为3组：以骨组织缺损部位所加入移植材料的不同分组,A组（实验组）：PRP＋牛凝血酶＋羟基磷灰石生物陶瓷（HA）;B组（对照组）：全血＋牛凝血酶＋HA;C组（空白组）骨缺损部位不作任何处理,直接原位周围软组织缝合。分别在术后第2、4、8 w观察局部骨组织修复情况。结果术后第2 w,3组骨缺损区未见明显成骨;术后第4 w,A组和B组少量成骨,A组优于B组,C组仅见少量纤维结缔组织增生;术后第8 w,A组和B组骨缺损基本修复,C组骨缺损骨修复欠佳,A组成骨较B组成熟。结论在促进骨组织缺损修复方面,PRP能在HA作用的基础上,进一步加速局部新骨形成、分化成熟。     

血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复兔大段骨缺损的效果评价

目的 评价血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)促血管化组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损的效果.方法 选用68只新西兰大耳白兔,以数字随机法分为3组.实验组:EPCs+经成骨诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)+脱钙骨基质(decalcified bone matrix,DBM);自身对照组:BMSCs+DBM;阴性对照组:单纯DBM.将上述材料置入桡骨中段15 mm骨缺损区,术后12,16周摄X线片行骨密度、组织学光镜、骨钙素免疫组化染色及生物力学测试.结果 实验组的骨痂生长、塑形、髓腔再通、骨愈合速度及力学强度等方面均明显优于对照组.结论 EPCs促血管化组织工程骨成骨能力强,能有效促进骨愈合,是修复大段骨缺损的有效方法.     

骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓间充质干细胞移植对糖尿病大鼠骨折愈合的影响

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对糖尿病骨折愈合的影响,探讨糖尿病骨折治疗的新方法.方法 Wistar雄性成年6周龄大鼠50只,按随机数字表法分为对照组和实验组,均制成糖尿病骨折模型,体外高糖环境下腺病毒介导的BMP-2转染BMSCs,分别于骨折局部移植相应的BMSCs.术后1,2,3,4,6周行X线检查;取骨痂行HE染色,免疫组化检测骨痂中BMP-2的灰度值;ELISA法检测血清中BMP-2的浓度.结果 第4周实验组骨痂BMP-2灰度值为83±3,对照组为118±4(P＜0.01).第4周实验组血清BMP-2浓度为(203.80±8.96)ng/L,对照组为(139.15±4.19)ng/L(P＜0.01).结论 BMP-2基因转染的BMSCs移植能促进糖尿病大鼠骨折的愈合.     

带蒂筋膜瓣包裹复合自体红骨髓的组织工程骨修复四肢低毒力感染性骨缺损

目的 研究带蒂筋膜瓣包裹复合自体红骨髓组织工程骨体修复四肢低毒力感染性大段骨缺损的效果,为临床应用提供依据. 方法 本组四肢低毒力感染性骨缺损38例,取自体红骨髓(autologous red bone marrow,ARBM)与含骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)的骨诱导活性材料(osteoinductive absorbing material,OAM)复合成组织工程骨,在骨缺损邻近制备一个带有无名血管蒂所属毛细血管网的筋膜瓣,使其包裹组织工程骨并充填骨缺损.18例采用病灶清除加复合ARBM的组织工程骨植入(A组),20例采用病灶清除加带蒂筋膜瓣包裹复合ARBM的组织工程骨植入(B组),术后3,6,12,18个月时血常规、超敏C-反应蛋白(CRP)监测炎性反应,X线观察骨缺损修复情况,部分患者作组织学和细菌学检查. 结果 A组术后平均6个月时5例出现感染,经细菌学培养阳性且与术前相同,(14.0±0.5)个月时,10例组织学显示原病变区骨断端之间仍有纤维结缔组织相连,其中4例病损区为炎性纤维肉芽组织充填且有少许死骨形成及细菌学检查阳性;B组术后无感染出现,16例组织学显示原筋膜瓣形成类似骨膜样组织,原病变区成熟骨结构形成,无炎性细胞浸润,细菌培养均为阴性;其余7例外固定架(A组3例,B组4例)(12.2±0.3)个月时骨性连接、结构稳定取出,未作组织学和细菌学检查.术后各时相点无论是血常规量化总分还是超敏CRP量化总分以及X线量化评分对比,B组明显大于A组(P＜0.05). 结论 带蒂筋膜瓣包裹复合ARBM的组织工程骨是目前I期修复感染性骨缺损切实可行的较好方法,在抗感染的同时缩短骨缺损修复时间,显著提高成骨的质和量.     

组织工程脱细胞角膜基质联合干细胞诱导分化制备异体角膜移植材料研究

目的研究脱细胞角膜基质联合干细胞制备异体角膜移植材料的安全性和有效性。方法应用酶-深低温法对猪角膜基质进行处理,制备猪脱细胞角膜基质。采用微注射法注入骨髓间充质干细胞进行共培养,制备异体角膜移植材料,并将其植于角膜病变的新西兰大白兔,评价术后组织工程角膜的系统性功能。结果脱细胞角膜基质的显微结构显示板层结构完整,未见细胞残留。共培养后光镜观察角膜基质细胞可于脱细胞角膜基质内生长,细胞形态具有纤维细胞特征,但分布不够均匀。移植术后,组织工程角膜愈合良好,未见明显的炎症及排斥反应。结论脱细胞角膜基质联合干细胞诱导分化制备异体角膜移植材料具有免疫排斥率低,组织相容性佳的特性。     

骨髓基质细胞与钙磷陶瓷复合构建组织工程化骨组织

目的：利用组织工程学原理和方法新生骨组织,为骨组织工程选择适宜的细胞来源与细胞载体,方法：将免骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell,BMSc)进行体外培养,通过表态学观察和组织化学检测,分为生物活性玻璃陶瓷（hioactive galss ceramic,BGC)复合细胞组和单纯细胞性,进行细胞增残,碱性磷权酶检测,将两者复合后植入免自体肌袋内,分单纯材料接种组和复合材料接种组,于不同时间取材,ＨＥ染色,观察其成骨过程,结果：骨髓基质细胞在体外培养时表现出与成骨细胞相似的形态学与功能表现,ＢＧＣ利用细胞的生长繁残,对细胞的功能表现无明显影响,ＢＭＳc与ＢＧＣ复合植入体内可产生成熟骨组织,结论：利用ＢＧＣ与ＢＭＳc复合可产生组织工程化新生骨组织。     

自体骨髓间充质干细胞移植修复兔关节软骨损伤

目的用组织工程方法修复软骨损伤。方法兔骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs)体外培养扩增诱导分化，用藻酸盐载体材料负载，移植于兔关节软骨损伤区，术后6周和12周进行大体、光镜、电镜等观察。结果实验组移植6周后，软骨损伤区由透明软骨样组织填充，12周后软骨和软骨下骨修复良好，免疫组化和原位杂交证实修复组织内产生了Ⅱ型胶原，透射电镜显示细胞周围有胶原纤维产生。两对照组损伤区由纤维组织修复。结论以藻酸盐载体材料负载BMSCs移植可修复关节软骨损伤。     

三种培养条件下兔骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的 观察三种培养条件下兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化特性。方法 比较BMSCs在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养三种条件下的成骨分化特性，观察细胞的形态及碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素水平，并检测Ⅰ型胶原表达。结果 共培养及诱导培养的BMSCs同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组（P〈0．01），诱导培养最高；经过诱导培养及共培养的BMSCs，其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性；对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性，骨钙素免疫组化阴性；普通传代的BMSCs 1周及2周的Ⅰ型胶原表达条代灰度均明显低于同期共培养及诱导培养的BMSCs。结论 共培养条件及诱导培养均呈现促BMSCs向成骨方向转化的特点，诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。     

复合支架材料构建组织工程骨修复兔颅骨缺损

目的观察以胶原缓释重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）及珊瑚构建的组织工程骨修复颅骨缺损的能力，明确复合BMSCs的组织工程骨修复颅骨缺损后新骨的来源。方法构建三种复合支架材料：（1）rhBMP-2／珊瑚；（2）胶原/rhBMP-2／珊瑚；（3）BMSCs／胶原／rhBMP-2／珊瑚。将其分别植入兔颅骨缺损处，8周和16周后采用X线片、HE染色、Masson三色染色法、荧光显微镜等观察比较骨缺损修复的情况。通过BrdU标记BMSCs及免疫组化染色方法证实新骨的来源。结果BMSCs／胶原/rhBMP-2／珊瑚组材料修复颅骨缺损的能力最强，且与自体髂骨修复的情况相近；胶原／rhBMP-2／珊瑚组材料次之，rhBMP-2／珊瑚组材料成骨能力较弱。BMSCs参与了新骨组织的形成，新骨组织部分来源于经诱导的BMSCs。结论胶原是rhBMP-2适宜的缓释载体，胶原及BMSCs对促进复合支架材料修复骨缺损有重要意义。BMSCs／胶原／rhBMP-2／珊瑚构建的组织工程骨可成为一种良好的骨缺损修复材料．     

种子细胞双相接种技术促进组织工程骨体外成熟的研究

目的 比较观察双相接种法和静置接种法构建组织工程骨对种子细胞增殖、分化和成骨表达的影响。方法 取健康志愿者骨髓，密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增、诱导分化，然后应用双相接种法和静置接种法与脱钙骨基质（DBM）复合构建组织工程骨，体外培养3周，用倒置显微镜、扫描电镜观察细胞密度、形态及基质分泌情况，并在不同时相点测定组织块中DNA含量、碱性磷酸酶（ALP）活性及钙含量变化。结果 倒置显微镜下双相接种法构建的组织块可见大量具有一定折光性的梭形细胞存在于胶原基质中。扫描电镜见双相接种法构建的组织块切面较平坦，孔隙较小，细胞包埋在胶原中，而静置接种法构建的组织块可见细胞、细胞外基质较少。在体外培养过程中，双相接种法组织块中细胞的DNA含量、ALP活性均高于静置接种法，钙含量在培养2周后高于静置接种法。结论 双相接种法是一种高效的组织工程骨构建方法，有利于提高接种效率和促进组织工程骨的体外成熟。     

基因修饰人骨髓间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞异种移植的实验研究

目的观察人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-免疫球蛋白融合蛋白(hCTLA4-Ig)基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)作为种子细胞异种移植到F344大鼠体内是否成骨,探索获得骨组织工程异基因种子细胞的一种方法。方法应用含有目的基因hCTLA4-Ig和增强绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒感染第1代hMSCs,应用G418筛选出抗性细胞群(hMSCs-CTLA4);用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法分别检测hMSCs-CTLA4中hCTLA4-IgmRNA和蛋白质表达。用荧光激活细胞分选仪(FACS)检测hMSCs-CTLA4中表达hCTLA4-Ig蛋白的阳性率。将hMSCs-CTLA4作为种子细胞在体外构建组织工程骨并移植到F344大鼠皮下,用X线片、组织形态学、免疫组织化学方法分别观察其体内成骨状况和hCTLA4-Ig表达情况。结果分离的hMSCsCD105表达阳性,CD34表达阴性。hMSCs-CTLA4的细胞形态呈梭形,与hMSCs比较无明显改变;倒置荧光显微镜观察见绝大多数细胞呈绿色,强阳性表达EGFP。RT-PCR、免疫细胞化学结果分别证实hMSCs-CTLA4表达hCTLA4-IgmRNA和蛋白。FACS检测结果显示:hMSCs-CTLA4表达hCTLA4-Ig蛋白的阳性率为78.4%。本实验构建的组织工程骨,每克脱钙骨基质(DBM)上吸附、生长的细胞约(1～1.5)×106个。DBM/hMSCs-CTLA4组植入F344大鼠皮下术后2～12周均可检测到hCTLA4-Ig阳性表达细胞,8～12周出现人源性新生骨组织;而单纯DBM组与DBM/hMSCs组表现为DBM逐渐被吸收,代之以纤维结缔组织,没有新生骨组织出现。结论以hMSCs-CTLA4作为种子细胞构建的组织工程骨异种移植到F344大鼠皮下可以成骨。hCTLA4-Ig基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)可能作为骨组织工程异基因种子细胞的来源。