狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization，SSH)构建狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)肾阴虚证DNA消减文库。方法：选择汉族人LN中医辨证为肾阴虚证患者以及正常人作为其对照组，用硅胶法抽提血白细胞DNA，经过酶切、接头连接、两次抑制性消减杂交及抑制、巢式PCIR后，将PCIR产物与A载体连接，经蓝白斑筛选，再用PCIR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建LN肾阴虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了LN肾阴虚证的差异DNA片段，得到581个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阳虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建LN肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆LN肾阴虚证相关基因奠定了基础，亦为寻找肾虚证相关基因提供重要线索。     

慢性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术构建汉族人慢性肾炎（chronic glomemlonephritisCGN）肾阳虚证cDNA消减文库。方法：选择汉族人CGN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA。用SMART（Switch Mechanism At 5end of RNA Template）技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及两交抑制性PCR,建立抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）,在SSH基础上进行镜像选择（mirror orientation selection,MOS）,将PCR产物与U载本连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阳虚证消减文库。结果：用SSH方法筛选出了CGN肾阳虚证的差异cDNA片段。得到了443个白色克隆,再经PcR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阳虚证的cDNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

糖尿病肾病肾阴虚证DNA消减文库的构建

在多年糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾虚证的研究中,结果发现血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme,ACE)基因多态性与肾阴虚证密切相关[1].这提示肾阴虚证存在其相关基因.目前克隆疾病的相关基因有多种方法,其中抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)对研究复杂基因组的差异基因具有一定的优越性.目的:采用抑制性消减杂交技术(suppression sub-tractive hybridization,SSH)构建汉族人糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾阴虚证DNA消减文库.方法:选择汉族DN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.用硅胶法抽提血白细胞DNA,用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建DN肾阴虚证DNA消减文库.结果:用SSH方法筛选出了DN肾阴虚证的差异DNA片段,得到586个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DN肾阴虚证的DNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DN肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DN肾阴虚证相关基因奠定了基础.     

糖尿病肾病肾阴虚证DNA消减文库的构建

在多年糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾虚证的研究中，结果发现血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ—converting enzyme．ACE)基因多态性与肾阴虚证密切相关。这提示肾阴虚证存在其相关基因。目前克隆疾病的相关基因有多种方法，其中抑制性消减杂交(suppression subtractiv ehybridization。SSH)对研究复杂基因组的差异基因具有一定的优越性。目的：采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridiration，SSH)构建汉族人糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾阴虚证DNA消减文库。方法：选择汉族DN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组，进行正向和反向消减杂交。用硅胶法抽提血白细胞DNA。用Rsa Ⅰ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接．进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建DN肾阴虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了DN肾阴虚证的差异DNA片段，得到586个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阴虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DN肾阴虚证DNA消减文库．为进一步筛选和克隆DN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

糖尿病肾病肾阳虚证DNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractire hybridization，SSH)构建汉族人糖尿病肾病(dialbetic nephropth1y，DN)肾阳虚证DNA消减文库。方法：选择汉族人DN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组，进行正向和反向消减杂交。用硅胶法抽提血白细胞DNA，用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建DN肾阳虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了DN肾阳虚证的差异DNA片段，得到600个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阳虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建。DN肾阳虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆DN肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建糖尿病肾阳虚证DNA消减文库

目的:运用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建糖尿病(Diabetic mellitus,DM)肾阳虚证DNA消减文库。方法:选择汉族中医辨证为肾阳虚证的DM患者以及正常人做对照组,进行正向和反向消减杂交。用RsaⅠ酶切用硅胶法抽提基因组DNA成大小不等的片段,分别连接两种不同的接头,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液PCR筛选出阳性重组质粒,构建DM肾阳虚证DNA消减文库。结果:用SSH方法筛选出DM肾阳虚证的差异DNA片段,经克隆及PCR筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DM肾阳虚证的DNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DM肾阳虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DM肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

肺癌脾虚痰湿型肿瘤相关证候差异表达基因的筛选与鉴定

目的：构建脾虚痰湿型肺癌肿瘤相关消减cDNA文库,以寻找脾虚痰湿型肺癌证候特异基因。方法：以原发性肺癌脾虚痰湿型的患者肿瘤组织及瘤旁正常组织为材料,分离Poly（A）RNA,反转录合成单链及双链cDNA,经Rsa I酶切,将肿瘤组织cDNA分成两组,分别与两种不同的接头连接,再与正常肺组织cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性PCR扩增,将第两次PCR产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行文库扩增,构建了消减cDNA文库,同法建立反向消减cDNA文库。对经反向斑点杂交验证,从cDNA文库中随机挑选的200个含差异片段的克隆,碱裂解法提取DNA,从克隆5’端进行单向测序。EST测序序列行生物信息学分析,所有基因聚类用BLASTX（E values〈10-5）和BLASTN（E values〈10-10）搜索GenBank的非冗余核酸序列数据库及蛋白质库予以注释。结果：经文库扩增,随机挑选克隆进行PCR鉴定,插入片段主要分布在250～1000bp之间,并以反向斑点杂交法进一步验证其阳性克隆,最终获得251个阳性克隆,其中正向消减文库获得165个阳性克隆,反向消减文库获得86个阳性克隆。测序发现了正向消减文库差异基因22个,反向消减文库差异基因6个。结论：成功构建脾虚痰湿型肺癌肿瘤相关消减cDNA文库,发现了那些有明确生物学功能的证候相关基因,其基因表达及分布特征初步反映了肺癌脾虚痰湿型在分子层面的证候特点。     

连作地黄cDNA消减文库的构建及分析

目的:通过构建连作地黄cDNA消减文库,探讨地黄连作障碍的分子机制.方法:利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建连作地黄的正反消减文库,通过蓝白斑筛选、PCR的方法鉴定出阳性克隆,并对其进行测序和生物信息学分析.结果:连作地黄cDNA消减文库构建成功,正向和反向消减文库均筛选了300个阳性克隆.测序结果表明:正库、反库分别获得232条、214条特异的EST序列;经NCBI数据库分析,正库、反库中分别有200,195条EST序列的基因具有蛋白功能注释;COG基因功能预测结果表明,正库、反库中分别有60,61条EST序列具有相应的的基因功能分类,涉及21个代谢途径.结论:差异表达基因的功能注释表明,连作对地黄体内的基因表达具有深刻的影响.本研究筛选地黄响应连作的关键基因,为揭示地黄连作障碍的分子机制奠定了基础.     

菌根真菌诱导的铁皮石斛根差减cDNA文库构建

 目的 构建菌根真菌共生诱导的铁皮石斛根的差减cDNA文库,从中筛选出差异表达基因。方法 采用SMARTer PCR cDNA合成方法直接以总RNA为模板合成并富集稀少cDNA,再利用抑制消减杂交（SSH）方法构建受菌根真菌共生诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库。结果 成功构建了受菌根真菌诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库,共获得1 975个阳性克隆。经检测,90%以上克隆能扩增出有效产物,其插入片段大小在150~1 000 bp之间。随机挑取了20个克隆菌液测序并进行了比对分析,大部分为植物应对环境胁迫防御性基因。结论 该技术体系所构建的差减cDNA文库质量较好,操作方便,尤其适用于珍稀濒危的植物材料。     

用抑制性差减杂交构建As2O3诱导的NB4 细胞凋亡相关基因文库

目的: 构建三氧化二砷(As_2O_3)诱导的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡相关基因文库.方法:用含4 μmol·L~(-1)As_2O_3和正常培养基培养NB4细胞24 h,抽提总RNA,经逆转录酶合成双链cDNA,分别以砷诱导凋亡组和对照组作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(supptess-ion sublxactive hybridization,SSH),筛选As_2O_3诱导的NB4细胞凋亡相关基因,将差异表达基因进行PCR扩增并与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5 α大肠杆菌,经蓝白斑筛选获得白色阳性克隆,PCR扩增出未知基因片段.结果:成功构建了分别代表在NB4细胞中表达上调和下调的基因文库.结论: 经双向抑制性差减杂交获得了NB4细胞差异表达基因文库,为克隆NB4细胞凋亡相关基因奠定了基础.     

地黄中响应连作基因的时空表达与分析

目的:前期作者利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了连作地黄的正反消减cDNA文库。该研究从两库中各选5个可能引起地黄连作障碍的基因做时空表达分析,以探讨其在地黄连作障碍中的作用。方法:应用实时荧光定量PCR技术检测这10个基因在正茬、重茬地黄中不同时期不同组织的相对表达量。结果:正库中筛选的5个编码基因(钙依赖性蛋白激酶、SAM合成酶、ACC氧酶、甲基转移酶、钙蛋白酶)在重茬地黄中有较高的表达量,在正茬地黄中几乎无表达;反库中筛选的5个编码基因(RNA依赖的RNA聚合酶、RNA复制酶、依赖于DNA的RNA聚合酶IIa、细胞周期蛋白D、RNA结合蛋白)在正茬地黄中均得到较高表达,而在重茬中却被下调或关闭。结论:参与核心生命过程的关键调控基因(如细胞周期蛋白D、依赖于DNA的RNA聚合酶IIa)在重茬地黄中被抑制或关闭,扰乱了植株正常的基因表达程序,通过钙信号传导和乙烯合成信号,干扰了地黄生长发育的重要代谢过程,从而导致连作地黄植株矮小,发育不良,引起地黄的连作障碍现象。     

抑制消减杂交筛选乳腺癌相关基因

目的:为了研究乳腺癌发生的分子遗传学机理,分离克隆模型鼠乳腺癌组织中特异表达的基因.方法:利用抑制消减杂交技术,结合反向cDNA斑点杂交试验,小鼠乳腺癌组织中分离出与正常乳腺组织差异表达的EST,应用生物信息学方法鉴定所得EST的小鼠同源基因,并分析其与乳腺癌发生的相关性.结果:获得20个在小鼠乳腺癌组织中高表达的,与已知的小鼠基因片段高度同源的基因,及2个与数据库中提交的假想蛋白基因高度同源的基因.结论:利用抑制消减杂交技术,可以高效高通量分析在乳腺癌中特异表达的基因,探讨乳腺癌发生的分子机制.     

铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制差减杂交文库的构建及序列分析

 目的 研究铁皮石斛（Dendrobium officinale）种子接菌共生萌发差异基因表达谱特征。方法 采用抑制差减杂交（SSH）技术,分别以接菌及未接菌培养5周的铁皮石斛种子cDNA作为检测子与驱赶子,构建铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制性消减cDNA文库。结果 对部分克隆产物测序,经GenBank中BLASTx同源比较后,进行基因功能注释,得到100个具有植物同源性的表达序列标签（EST）,主要涉及细胞与染色体结构、RNA合成、信号转导、能量与代谢、蛋白质合成与降解及细胞防御等。随机挑选5个目标基因,实时荧光定量PCR分析发现这5个基因在共生萌发的种子中均上调表达。结论 铁皮石斛种子接菌共生萌发涉及多种途径相关基因表达调控,本实验为兰科植物种子萌发分子机制研究奠定基础。     

益气活血中药复方与CVB3对乳鼠心肌细胞基因表达的影响

目的:克隆和筛选CVB3乳鼠心肌细胞感染相关基因,以期从基因水平揭示CVB3心肌炎的发病机制,同时探索益气活血中药复方治疗病毒性心肌炎的作用机制.方法:通过改良的抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),分离大鼠心肌细胞CVB3感染组和益气活血中药复方给药...     

Hsa-miR-3074在肾阳虚证中的表达差异性研究

目的探讨miR-3074-3p的表达对肾阳虚证发生的影响。方法采集14例肾阳虚证患者和10例健康者外周静脉血,取其白细胞,使用TRIzol法提取RNA并进行质量检测。将该样本的总RNA逆转录合成cDNA,通过实时定量PCR检测,分析miR-3074-3P的相对表达量。结果miR-3074-3p在肾阳虚证组中相对于健康对照组表达上调。结论miR-3074-3p在肾阳虚证患者基因表达中相对于健康人上调明显,其作用机制需进一步研究证实。     

益气活血中药复方对CVB3乳鼠心肌细胞感染模型线粒体核糖体蛋白L51表达的影响

目的 研究益气活血中药复方对CVB3乳鼠心肌细胞感染模型线粒体核糖体蛋白L51(mitochondrial ribosomal protein L51,MRPL51)表达的影响,以期从基因水平揭示CVB3心肌炎的发病机制及益气活血中药复方治疗病毒性心肌炎的作用机制,并进一步证实益气活血中药复方治疗CVB3病毒性心肌炎的有效性.方法 通过乳鼠心肌细胞培养,建立病毒组和益气活血中药复方组心肌细胞模型,以改良的抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),分离两组差异表达的基因,并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证.结果 SSH结果显示,MRPL51基因在益气活血中药复方组为低表达,而在病毒组则呈高表达状态,荧光RT-PCR结果显示益气活血中药复方组中MRRPL51基因达到阈值的循环数(Ct)明显多于病毒组,提示MRPL51在病毒组中的表达较中药组中高.结论 MRPL5基因表达上调可能是CVB3致病毒性心肌炎机制之一;益气活血中药复方通过下调MRPL5基因的表达而实现治疗病毒性心肌炎的目的 .