胆汁对体外细粒棘球蚴原头节的作用观察

目的探讨不同浓度的胆汁对细粒棘球蚴原头节的生长作用及形态学影响。方法将体外培养的细粒棘球蚴原头节分别加入40％、60％、80％、100％的胆汁中体外孵育。0．1％伊红染色在倒置显微镜下检测原头节的活力及形态改变,实验重复三次;透射电子显微镜下（TEM）下观察胆汁作用后原头节表面超微结构改变。结果不同浓度的胆汁对原头节均有杀伤作用,其中浓度为100％和80％的胆汁对细粒棘球蚴原头节杀伤作用最明显。倒置显微镜下观察发现,不同浓度的胆汁作用细粒棘球蚴原头节后,原头节多呈外翻型,原头节顶突上的小钩排列紊乱,部分脱落,吸盘突起,变形,活动性减弱。随着浓度的增加,变化越明显。超微结构显示40％的胆汁作用3d后,原头节纤毛出现少量缺损,合胞体带排列较紊乱,合胞体带内出现散在少量的空泡和脂滴。60％胆汁作用3d后,合胞体带内微毛出现融合,腔内出现空泡和脂滴,数量多且大。结论胆汁作用后,可导致体外细粒棘球蚴原头节的形态发生不同程度的改变并有有抑制作用,然而关于胆汁在体内的疗效有待于进一步研究。     

棘球蚴原头节细胞凋亡的观察

目的观察棘球蚴原头节自身是否存在细胞凋亡现象。方法采集羊肝/肺棘球蚴中自然状态原头节直接用显微镜观察形态结构。过氧化物酶标记链酶卵白素（SP）染色免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）表达。原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术（TUNEL法）检测凋亡细胞。透射电镜观察原头节超微结构。结果在自然状态的原头节中,显微镜下见到一些原头节虫体枯萎、结构模糊。这些原头节中的caspase-1、caspase-3呈强阳性表达。TUNEL法检测显示这些原头节中凋亡细胞密布。透射电镜见到典型细胞凋亡形态改变。结论棘球蚴原头节自身存在细胞凋亡现象。     

抗包虫药物的实验研究——Ⅰ.吡喹酮体外抗细粒棘球蚴原头节的作用

在20％小牛血清-RPMI1640中,吡喹酮对体外培养的细粒棘球蚴原头节有较强的杀灭作用,主要表现为外翻、皮层肿胀、泡状物形成、破裂,以及头钩排列紊乱和脱落等,24h后即出现死亡,3天内的死亡率达90％以上。吡喹酮对培养在囊液中的原头节亦有杀灭作用,但对培养在RPMI1640和HBSS中的则无。进一步观察的结果表明,吡喹酮在体外抗原头节的作用需赖于有蛋白质的存在。此外,小鼠口服吡喹酮后,其血清有抗原头节作用,主要成份为吡喹酮原药。     

细粒棘球绦虫原头节发育成囊过程观察

经体外培养和动物接种观察,原头节发育成囊主要由原头节本身以不同方式囊化,逐渐发育形成角皮层和生发层囊壁。角皮层可在生发层形成前出现。邻接不同原头节形成的角皮层可相互融合成多囊型棘球蚴。原头节在培养基或小鼠体内均可产生后囊,但经培养74天接种50天未见后囊形成角度层。后囊壁经HE和AB、PAS染色呈PAS弱阳性,无细胞核。原头节在培养基和小鼠体内发育成囊过程基本一致。     

细粒棘球蚴原头节miR-71的分泌表达特征分析

目的分析在胰岛素、阿苯达唑和人工胃液刺激下,细粒棘球蚴原头节miR-71的分泌表达特征。方法从新疆屠宰场采集绵羊肝、肺细粒棘球蚴包囊,经固定、包埋及切片后,用miR-71探针进行杂交。与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗Digoxin抗体(Anti-Digoxin-FITC)作用,经4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核酸染料染色后,在荧光显微镜下观察miR-71在包囊壁和原头节中的定位,分析miR-71在原头节中的分布,确定miR-71在原头节中的表达情况。在人工胃液(人工胃液组)、胰岛素(胰岛素组)或阿苯达唑(阿苯达唑组)等不同条件下培养原头节,收集上清并用差速离心法分离外泌体,采用透射电镜观察外泌体形态结构,利用纳米粒径分析仪测定外泌体的粒径分布;利用外泌体生物标志分子烯醇化酶和14-3-3蛋白的抗体蛋白质免疫印迹(Western blotting)鉴定外泌体;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测外泌体中miR-71的丰度。结果原位杂交结果显示,miR-71在囊壁生发层和原头节中均有表达。人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组原头节分泌的外泌体粒径分别为48.9、49.7和65.4 nm,均在40~120 nm内;外泌体形态呈由膜包裹的球形。Western blotting从外泌体中检出烯醇化酶和14-3-3蛋白,表明外泌体提取成功。qPCR结果显示,人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组原头节分泌的外泌体中,miR-71的表达量分别是其对照组的1.84、1.87和2.38倍(t=12.8、26.7、29.3,均P<0.01)。结论miR-71在细粒棘球蚴囊壁和原头节中广泛表达,且可以通过外泌体进行分泌;经胰岛素、人工胃液和阿苯达唑刺激后其分泌表达水平升高。     

他克林体外抗细粒棘球蚴作用研究

目的 研究乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林体外抗细粒棘球蚴的作用效果。方法 体外分离和培养细粒棘球蚴原头节和生发层细胞,经浓度为4、8、10、20和40 μg/mL的他克林作用3 d后经0.1%亚甲基蓝染色观察,记录死活原头节的数目以计算原头节死亡率,另外用CCK-8试剂盒检测药物对生发层细胞活性的影响并计算细胞活性抑制率。同时用透射电镜和扫描电镜分别观察药物对细粒棘球蚴原头节和生发层细胞超微结构造成的影响。结果 经20 μg/mL和40 μg/mL的他克林体外作用3 d后,原头节的死亡率高达100%,其中死亡原头节的体壁出现轻微肿胀且伴随着外部轮廓的消失,同时超微结构亦发生明显改变,原头节体壁组织中出现了大量的空泡和脂肪滴。当他克林浓度为40 μg/mL时,可造成生发层细胞全部死亡。细粒棘球蚴生发层细胞粘附于培养介质的基质消失、细胞发生聚集且数目减少。扫描电镜可观察到他克林作用3 d后的细胞出现塌陷或者萎缩。结论 他克林可直接影响体外培养的细粒棘球蚴原头节和生发层细胞的活性,是潜在的包虫病治疗药物。     

塞来昔布对细粒棘球蚴原头节生长及p-ERK2表达的影响

目的探索塞来昔布对细粒棘球蚴原头节体外生长及p-ERK2表达的影响。方法实验分组为1640培养基组、DMSO组、塞来昔布溶液(50、100、150、200μmol/L)中体外孵育,在倒置焦镜下观察原头节的形态变化,同时通过0.1%伊红染色显示原头节活力。运用Western blot检测DMSO、100、150、200μmol/L塞来昔布处理细粒棘球蚴原头节48h后p-ERK2蛋白的表达量。结果体外孵育7d后,DMSO组及空白1640对照组原头节的活力几乎没有改变。塞来昔布作用1d后,100、150、200μmol/L组原头节的活力均下降;作用3d后,200μmol/L组原头节全部被杀死,150μmol/L组的原头节活力为43.9%。100μmol/L、50μmol/L组对原头节的活力也有明显下降,但不及高浓度组显著。Western blot结果显示P-ERK2的表达量随浓度增加而下降趋势明显。结论塞来昔布能够抑制细粒棘球蚴原头节生长,这可能与塞来昔布下调P-ERK2的表达进而抑制ERK2信号传导通路有关。     

过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡的实验观察

目的 探讨过氧化氢（H₂O₂）体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。 方法 体外培养细粒棘球蚴原头节,实验分为2组,即RPMI 1640组及RPMI 1640添加谷氨酰胺组。分别用不同浓度的H₂O₂诱导,使其发生细胞凋亡。用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术（TUNEL 法）检测凋亡细胞;用过氧化物酶标记链酶卵白素（SP）染色-免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）以及FAS基因蛋白(跨膜蛋白Fas)表达情况。表达产物用二氨基联苯胺（DAB）显色,苏木素复染。TUNEL反应以细胞核黄染者为阳性细胞,caspase-1和caspase-3以细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,Fas以细胞膜和细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,无黄染者为阴性细胞。根据每个原头节中阳性细胞数所占百分比,对原头节阳性表达程度分为4个级别,即原头节中阳性细胞数＜5% 为“-”,5%～25% 为“+”,26%～50%为“++”,＞50%为“+++”。实验重复2次。各组均设空白对照组。 结果 RPMI 1640组,1 mmol/L H₂O₂诱导12 h,查见典型的TUNEL反应阳性细胞;诱导4 h,caspase-1表达86.6%为 “+ ～ ++”,caspase-3 表达77.8%为 “+ ～ ++”;诱导8 h,caspase-1表达 86.6%为 “+ ～ ++”,caspase-3表达 80.0%为 “+ ～ ++”。均比对照组明显增加（P＜0.05）。而5 mmol/L H₂O₂ 诱导4 h,caspase-1表达93.0%为 “++ ～ +++”,caspase-3表达 89.5%为 “+ ～ ++”;诱导8 h,caspase-1表达“++ ～ +++”降为53.2%,caspase-3 表达“+ ～ ++”降为48.4% 且阴性表达为46.8%,降低显著(P＜0.01)。添加谷氨酰胺（终浓度为2 mmol/L）组,5 mmol/L H₂O₂ 诱导8 h,caspase-3 100%为 “++ ～ +++” 高度阳性表达。与平行的RPMI 1640组（caspase-3 表达“++ ～ +++”为32.2%, 且阴性表达为46.8%）相比,变化明显。原头节在对照组和诱导组均可见Fas阳性表达细胞,RPMI 1640组5 mmol/L H₂O₂诱导4 h,“+ ～ ++”表达为53.0%,对照组为20.0%;RPMI 1640添加谷氨酰胺组5 mmol/L H₂O₂诱导8 h,“+ ～ ++”表达为88.7%,对照组为71.4%,诱导后均有所增加（P＜0.05）。 结论 H₂O₂可诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。     

3种药物体外抗细粒棘球蚴原头节作用的比较

目的　通过比较氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体体外抗细粒棘球蚴原头节作用 ,探讨氧苯达唑抗包虫病的作用。　方法　将氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体分别配成高、中、低浓度加入 RPMI16 4 0培养基中 ,体外培养细粒棘球蚴原头节 ,观察其每天的死亡率 ,直到对照组的头节全部死亡为止。　结果　将相同条件下 3种药物作用原头节的死亡率分别与对照组相比 ,阿苯达唑、氧苯达唑高、中、低浓度组与对照组相比 ,差异均有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;而阿苯达唑脂质体仅在高浓度时与对照组的差别有统计学意义 (P<0 .0 5 )。　结论　氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体均有显著的体外抗细粒棘球蚴原头节作用 ;氧苯达唑体外抗细粒棘球蚴原头节作用与阿苯达唑相当 ,可认为是一种新型抗包虫药 ;阿苯达唑脂质体剂型并未显示出特殊的体外抗原头节作用。     

X线照射泡球蚴原头节的体外实验研究

目的探讨X线对体外培养的泡球蚴原头节的杀伤作用。方法无菌采集子午沙鼠体内的泡球蚴中含原头节的囊液,将其加入RPMI 1640培养液中培养。原头节体外培养3 d后分装至培养瓶中,每组10瓶,每瓶约含10 000个原头节,设空白对照组、低剂量组(15 Gy和30 Gy)、中剂量组(45 Gy和60 Gy)、高剂量组(75 Gy和90 Gy)、阿苯达唑组(2 500 ng/ml)、45 Gy X线+2 500 ng/ml阿苯达唑组和75 Gy X线+2 500 ng/ml阿苯达唑组。X线照射剂量率为200 cGy/min,源皮距为100 cm。体外培养第4天开始照射,每组共照射3次,每次间隔1 d。首次照射后第1天开始每天取原头节培养液,0.1%伊红染色,光镜下计数每100个原头节中着色原头节数目,每组计算300个原头节的平均死亡率,直至实验组原头节全部死亡为止。同时光镜下观察经X线照射后原头节的变化。结果不同放射剂量组的原头节死亡率与空白对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。阿苯达唑组原头节死亡率与放射线联合阿苯达唑组间的差异均有统计学意义(P<0.05),且显著高于空白对照组(P<0.05)。其中,X线...     

甘氨鹅脱氧胆酸对体外细粒棘球蚴原头节活力及ROS影响

目的 研究甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid, GCDCA)对体外细粒棘球蚴原头节活力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的影响。方法 将细粒棘球蚴原头节分为对照组及GCDCA处理组(500、1 500、2 500 μ mol/ L),应用体外培养技术,通过伊红染色法每天定时在光学显微镜下观察原头节的活力并记录存活和死亡数目。使用试剂盒检测不同浓度GCDCA处理 24 h后各组原头节体内caspase-3酶活性变化;DCFH- DA染色法荧光显微镜观察 GCDCA作用24 h后原头节内 ROS水平变化。结果 500、1 500、2 500 μ mol/ L GCDCA处理后均可导致原头节活力减弱,且最高浓度组在第7 d时原头节全部死亡。500、1 500、2 500 μ mol/ L GCDCA组作用原头节24 h后 caspase-3酶活性与对照组相比明显升高(F=555.162, P<0.05)。500、1 500、2 500 μ mol/ L GCDCA作用原头节24 h后原头节内 ROS水平与对照组相比明显升高(F=216.901, P<0.05)。结论 GCDCA 能抑制体外原头节生长,促使原头节死亡,可能与活化caspase-3及提高原头节内ROS 水平相关,具体机制有待进一步研究。     

白黎芦醇体外对多房棘球蚴原头节和微囊的作用研究

目的 研究白藜芦醇(Resveratrol,RES)体外对多房棘球蚴原头节(Protoscoleces,PSCs)和微囊的作用效果,为多房棘球蚴病的临床用药提供新的依据.方法 PSCs体外经不同浓度(5、10、20、40、80、100、200和400 μmol/L)的RES作用7 d,采用台盼蓝染色观察其活力与形态变化...     

ERK抑制剂PD98059体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用的研究

目的探讨ERK1/2抑制剂PD98059体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用。方法体外培养细粒棘球绦虫原头蚴,分组后分别加入100、50、25、12.5μmol/L的PD98059后继续培养7d,利用伊红染色方法在倒置显微镜下观察原头蚴的活力,实验重复3次,绘制原头蚴活力曲线;扫描电子显微镜(SEM)下观察不同浓度PD98059组原头节表面结构改变。结果 PD98059作用1d对细粒棘球蚴原头节具有杀伤作用,第7d100μmol/L PD98059组原头节的活力仅为(12.4±0.9)%。超微结构显示原头节顶突外翻、变形,顶突界面缺损,吸盘变形,甚至出现虫蛀样损害。结论 PD98059在体外有显著的抗细粒棘球蚴原头节的作用,可认为是一种新型的抗包虫药物。     

IGF-ⅠR抑制剂OSI-906体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用的研究

目的探讨胰岛素样生长因子I受体(insulin-like growth factor I receptor,IGF-ⅠR)抑制剂OSI-906体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用。方法体外培养细粒棘球绦虫原头蚴,用6个浓度梯度(100、50、25、12.5、6.25、3.125μmol/L)的OSI-906进行干预,分别于给药后1、2、3、4d用伊红染色,在倒置荧光显微镜下观察其活力(每组设置3个复孔),绘制原头蚴活力曲线;透射电镜下观察不同浓度OSI-906组原头节超微结构变化。结果 100和50μmol/L OSI-906作用不同时间原头蚴存活率与空白对照组组间和溶剂组相比差异有统计学意义(P<0.05);其余浓度组间比较原头蚴存活率差异无统计学意义(P>0.05)。第3d时100μmol/L的OSI-906组原头节存活率为(42.38±1.05)%;第4d时100μmol/L的OSI-906组原头蚴全部死亡。透射电镜观察OSI-906高浓度组原头蚴微毛结构消失,皮层细胞坏死,细胞膜严重破损,核形不规整,核仁大且边界不清,核基质密度极低,异染色质增多、边集。结论 IGF-ⅠR抑制剂OSI-906体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用显著,是一种潜在的抗包虫药物。     

多房棘球绦虫原头蚴对体外培养宿主肝细胞MAPK信号通路影响的初步研究

目的探讨多房棘球绦虫原头蚴对体外培养宿主肝细胞丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响。方法采用宿主大鼠肝细胞BRL3A和人源肝癌细胞系HepG2,分别与多房棘球绦虫原头蚴体外无血清共培养。实验组(与多房棘球绦虫原头蚴共培养)每瓶细胞接种约3×103个原头蚴;处理组(U0126)每瓶细胞先用20μmol/L U0126处理3 h,再接种约3×103个原头蚴,继续共培养,分别在12、24、48、72、96和120 h收集细胞,同时收集对照组(无血清培养基)细胞。利用免疫印迹技术(Western blot)检测p-ERK1/2、p-p38和p-JNK的变化。结果在48 h,肝细胞BRL3A共培养组p-ERK1/2表达活性与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),在12、24和48 h,p-JNK和p-p38表达活性分别有微弱升高;在72和96 h肝细胞HepG2共培养组p-ERK1/2表达活性与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),p-JNK和p-p38表达活性无明显变化;U0126处理组p-ERK1/2活性受抑制。结论多房棘球绦虫原...     

细粒棘球绦虫在人体内棘球蚴原头节、囊壁蛋白质表达谱分析

目的初步掌握流行于青海省细粒棘球绦虫幼虫棘球蚴（原头节、囊壁）在中间宿主人体内蛋白质表达情况。方法利用SDS-PAGE和western—blot分析棘球蚴原头节和囊壁蛋白质表达谱,进一步利用2DE和MALDI-TOF质谱分析技术对原头节和囊壁蛋白质构成情况进行全面的研究分析。结果在原头蚴、囊壁组织的双向电泳图中,各蛋白点通过MAL—DI—TOF—MS检测,原头蚴和囊壁分别有40个蛋白质点和8个蛋白质点得以初步鉴定,包括有：（1）细胞骨架蛋白：肌动蛋白、原肌球蛋白。（2）代谢相关酶类：苹果酸脱氢酶;磷酸丙糖异构酶;脯氨酸氧化酶;谷胱甘肽-S-转移酶;类胡萝卜脱氢酶;肽基脯氨酰顺反异构酶;（3）物质转运相关蛋白：载脂蛋白A-I;（4）应激反应蛋白（HSP70,HSP20相关蛋白）。结论初步鉴定了寄生人体细粒棘球蚴原头蚴、囊壁组织中的部分蛋白质点,其中,原头蚴中共有40个蛋白点,囊壁中有8个蛋白点。这些蛋白可能与细粒棘球蚴运动、生长、发育、代谢调控等方面有关。