鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测

目的预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白B细胞表位研究的可行性方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测。结果F1蛋白的B细胞表位可能位于第106~132和141~155等区域内。结论预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立。     

分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。     

鼠疫菌荚膜抗原和重组rV270抗原免疫小鼠后保护效果观察

目的 对小鼠血清抗体滴度检测和对小鼠的保护力观察,评价鼠疫菌荚膜抗原(F1抗原)和重组rV270抗原对鼠疫的免疫保护效果.方法 40只6～8周雌性Balb/c小鼠,按体质量随机分成4个实验组(F1-10 μg+铝佐剂、F1-20μg+铝佐剂、rV-10 μg+铝佐剂、rV-20 μg+铝佐剂)和1个对照组,每组8只.将天然F1抗原和重组rV270抗原分别吸附到25％铝佐剂中免疫实验组小鼠,对照组小鼠以免疫等量的铝佐剂.每只动物每次后腿肌肉免疫100 μ1,初次免疫后,第21天加强免疫1次.所有动物分别于第1次免疫后第8周采血,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体滴度.同时用2000倍半数致死量(LD50)的鼠疫菌141强毒株皮下攻毒,观察14d,以观察免疫后保护效果.结果 对照组未产生抗体,F1-10 μg+铝佐剂组、F1-20 μg+铝佐剂组的抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶30443.9、1∶21527.8,组间比较差异无统计学意义(t=1.1282,P＞0.05);rV-10 μg+铝佐剂组和rV-20μg+铝佐剂组的GMT分别为1∶13957.3、1∶18100.9,组间比较差异无统计学意义(t=0.9408,P＞0.05).用141强毒株皮下攻毒后,实验组小鼠全部存活,对照组8只小鼠全部死亡.结论 实验用天然F1抗原及重组rV270抗原具有较高的免疫活性,可作为鼠疫亚单位疫苗的主要组分用于鼠疫亚单位疫苗的研究.     

鼠疫耶尔森菌F1抗原免疫Balb/c小鼠方法的研究

目的 观察鼠疫耶尔森菌F1抗原(F1Ag)单克隆抗体制备过程中,F1Ag免疫Balb/c小鼠的免疫剂量和方法,探索操作性强、用时短和免疫效果好的方法.方法 7～9周龄Balb/c小鼠48只,按体质量随机分成6组:150、100、50、25μg组(第1次接种为皮下多点注射,F1Ag分别为150、100、50、25μg,第2、3次接种分别为皮下多点注射和腹腔注射,F1Ag量均为100 μg)、皮下接种组(3次F1Ag接种均采用皮下多点注射,每次100 μg)、腹腔接种组(3次F1Ag接种均采用腹腔注射,每次100 μg),每组8只.首次免疫接种F1Ag+等量弗氏完全佐剂(CFA)的乳化剂;3周后第2次接种F1Ag+等量弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂;1周后第3次接种F1Ag(不加佐剂);1周后取小鼠尾血,用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)微量法检测F1抗体.结果 不同剂量(150、100、50、25μg)组小鼠血清F1抗体效价(DAgS--ELISA法:G=12 173.87、13 440.37、15 024.19、4466.72;IHA微量法:G=19 972.32、18 089.40、23 170.47、4871.08)比较,差异有统计学意义(DAgS-ELISA法:F=3.11,P<0.05;IHA微量法:F=4.11,P<0.05).150、100、50 μg组小鼠血清F1抗体效价明显高于25μg组(DAgS-ELISA法:t值分别为2.18、2.39、2.73,P<0.05;IHA法:t值分别为2.54、2.73、3.13,P<0.05).不同接种途径条件下,皮下注射组、腹腔接种组、100μg组小鼠血清F1抗体效价呈渐次增高趋势(DAgS-ELISA法:G=8933.44、9986.16、13 440.37:IHA微量法:G=13 777.25、16 384.00、18 089.40),但差异无统计学意义(F值分别为0.66、0.25,P>0.05).结论 F1Ag免疫小鼠首次皮下多点注射50μg,加强免疫(腹腔注射)100μg,可以缩短整个免疫周期,免疫效果良好,抗体水平较高.     

利用分子生物学技术对鼠疫耶尔森菌的分类鉴定

目的 对4株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)自然分离株.方法 用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征.结果 4株菌具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖(+)、鼠李糖(-)、麦芽糖(+)、蜜二糖(-)、甘油(-)、脱氮(+),与鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV76)一致;其毒力因子为F1(+),VW(+),Pgm(-),PstⅠ(+),与鼠疫菌菌苗株(EV)特征完全一致;109个/ml可疑菌对实验动物小白鼠无致死能力.具有鼠疫标识基因;差异片段(DFR)分型结果,4株菌的24个DFR扩增,DFR谱不同于任何鼠疫菌自然分离菌株基因组型.结论 尽管4菌株具备鼠疫菌自然分离株的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌自然分离株,而是鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV菌).     

鼠疫耶尔森菌LcrV抗原B细胞表位的预测

目的预测鼠疫耶尔森菌LcrV抗原的B细胞表位,为抗LcrV单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌蛋白B细胞表位组研究的可行方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析LcrV蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测和分析。结果LcrV蛋白的B细胞表位可能位于第16～24、26～31、45～50、175～181、208～213和280～289位等氨基酸区域内或附近,其中16～24、26～31、175～181、208～213等4个短肽都与文献报道相吻合。结论预测得到的表位为后续抗LcrV抗原单克隆抗体的制备奠定了理论基础,为进一步表位分析和鉴定提供了参考依据;预测结果的准确性高,有助于利用表位预测法建立鼠疫菌蛋白B细胞表位研究的平台。     

鼠疫耶尔森氏菌荚膜抗原（F1）的几种提取方法评价

鼠疫菌荚膜Ｆ１抗原的传统提取方法费时且成本较高，本文参考不同微生物表面蛋白的制备程序，观察了６种不同实验条件下该抗原的提取效果。结果表明，鼠疫菌湿菌用ＫＣＮＳ作为解离剂提取Ｆ１抗原，和传统方法的提取效果基本一致。由于省去了丙酮制备菌粉这一烦锁步骤，从而撮程序大为减化。     

鼠疫菌pH6抗原的免疫效果观察

对实验条件下鼠疫耶尔森氏菌ｐＨ６抗原的免疫效果及其对鼠疫强毒菌再攻击的保护力进行了观察：（１）建立了鼠疫菌ｐＨ６抗原的酶联免疫吸附试验（简称ｐＨ６Ａｇ－ＥＬＩＳＡ）及间接红细胞凝集试验（简称ｐＨ６Ａｇ－ＩＨＡ）检测技术,检测敏感、特异;（２）用常规方法免疫小鼠,以ｐＨ６Ａｇ－ＥＬＩＳＡ和ｐＨ６Ａｇ－ＩＨＡ两种方法进行检测,实验动物均出现了较高滴度的免疫反应,其最高滴度分别为１：１２ ８００和１：１     

对1株疑似鼠疫耶尔森氏菌的系统鉴定

目的对1株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）。方 法用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征。结果该菌 株具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖（＋）、鼠李糖（－） 、麦芽糖（＋）、蜜二糖（－）、甘油（＋）、脱氮（+）,与典型鼠疫菌一致。毒力因子检查结果为均 为阴性;对实验动物小白鼠完全无致死能力。全基因组芯片杂交实验和PCR扩增表明55023菌株没有鼠疫菌 的三个质粒;也不具鼠疫标识基因;pgm位点代表性基因YPO1954扩增阳性,YPO1908扩增阴性,表明其pgm 位点不完整;差异片段（DFR）分型结果表明该菌株缺失了14个DFR,不符合鼠疫菌的特征;多位点序列分 型（MLST）分析结果表明该菌株与鼠疫存在16个碱基的差异,而与血清III型假结核耶尔森氏菌仅相差两 个碱基。结论尽管55023菌株具备鼠疫菌的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌,而可能是血 清III型的假结核耶尔森氏菌;噬菌体裂解结果等表型不能作为鼠疫菌鉴定的最终标准。     

四种耶尔森氏菌的抗原抗体相关性研究

目的了解鼠疫、假结核、小肠结肠炎和中间型耶尔森氏菌抗原抗体在免疫血清学中是否存在相关性?方法用四种耶尔森氏活菌分别或混合家兔耳静脉注射4次获得高效价抗血清,用鼠疫FI抗原和其他耶尔森氏菌全菌冻溶和耐热抗原,作鼠疫RIP试验和抑制试验。结果RIP仅能检出鼠疫菌单独或混合其他菌抗血清中的特异性FI抗体,FI抗原能完全抑制EV株、A2株和A2株混合其他耶尔森氏菌抗血清中的特异性抗体,假结核、小肠结肠炎、中间型耶尔森氏菌冻溶抗原对EV株抗血清抑制2~3管,对A2株混合不同耶尔森氏菌的抗血清不能抑制,假结核耐热抗原对EV株抗血清能抑制6~7管,对A2株混合其他耶尔森氏菌抗血清抑制2管。结论FI抗原对三种耶尔森氏菌抗体没有相关性,其他3种耶尔森氏菌冻溶抗原对EV株、A2株抗体有一定的相关性,而伪F2、519、520株耐热抗原对EV株抗体有较强亲缘相关性,对A2株抗体仅有一定的相关性。     

鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的生物信息学分析及抗原表位预测北大核心CSCD

目的探讨鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的组成结构及生物学功能。方法运用ProtScale,TMHMM Server,Signal P 3.0 Server,NetPhos3.0 Server,SOPMA,Swiss-mode和DNAStar等生物信息学软件分析鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的氨基酸序列组成、理化性质、亲疏水性、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二、三级结构和B、T细胞抗原表位等。结果 CAF-1是由170个氨基酸构成的富含苏氨酸的稳定亲水蛋白,相对分子质量为17.7×10~3,理论等电点为4.83,不含跨膜区且磷酸化程度较高。二级结构中β转角和无规则卷曲为主要结构原件,分别占41.18%和32.35%。同源建模显示,GMQE和QMEAN评估分值分别为0.90和0.76。抗原表位预测显示,该蛋白含有多个B细胞优势抗原表位和7个优势CTL表位。结论生物信息学预测CAF-1基因编码蛋白为稳定分泌蛋白和外膜蛋白,含有较多的B、T细胞抗原表位,具有较好的抗原性,可作为新型疫苗的潜在候选基因。     

2种致病性耶尔森氏菌与鼠疫菌EV株的相互拮抗作用

目的研究3种对人致病性耶氏菌在试管内的拮抗作用,以探讨目前雷州半岛的鼠疫疫源性。方法分别将小肠结肠炎菌、假结核菌与鼠疫菌EV株等量同时混合接种于赫金格尔溶解血肉汤,在不同时间点取样并进行菌落计数。结果小肠结肠炎菌0：3、0：9、猪盲株、假结核519株抑制了EV株,而EV株抑制了假结核277株。结论所选3种致病性耶尔森氏菌株存在相互拮抗作用。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

鼠疫耶尔森杆菌蛋白YPO1996的融合表达与鉴定

目的在比较蛋白质组结果的基础上选择并构建pET32a-ypo1996,表达鼠疫耶尔森杆菌（Yersinia pestis）特异的假想蛋白YPO1996重组蛋白（rYPO1996）,为新鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供备选抗原。方法根据鼠疫菌CO92株全基因组序列设计引物,用PCR方法扩增目的基因YPO1996,将其定向插入表达载体pET32a（＋）上,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,使重组质粒在工程菌中稳定高效地表达带组氨酸标签的融合蛋白,并亲和纯化该目的蛋白。通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析,并用Western blot分析其抗原性。结果单、双酶切鉴定及DNA测序显示,目的基因YPO1996成功连接到表达载体pET32a（＋）上,SDS-PAGE显示表达产物分子质量单位约为53.11 ku,与预期值相符。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗免疫鼠疫菌EV株血清识别。结论成功构建了pET32a-ypo1996重组基因原核表达系统,表达的重组蛋白rYPO1996具有较好的可溶性及抗原性,可作为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

对常规制备的鼠疫F1抗原、抗体组分及免疫交叉反应的观察

目的对常规方法制备的鼠疫菌F1抗原、抗体的组分进行分析,并观察其免疫交叉反应。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析抗原、抗体的组分;应用蛋白印迹观察其与相关细菌的免疫交叉反应。结果常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体组分复杂,混杂有其他多种蛋白;假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌的全膜蛋白与F1抗体存在交叉反应。结论常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体不纯,影响鼠疫免疫学诊断的特异性。     

鼠疫菌pH6抗原的提取,纯化与鉴定

使用ＫＣＮＳ解离、硫酸铵沉淀、电泳制备分离并纯化了鼠疫菌ＰＨ６抗原。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图型显示，提取物单一蛋白，参照标准，推算其分子量约１５ｋＤ。多数情况下，在其上方有一条含量较低、表征分子量约１６ｋＤ的蛋白带，用Ｆ１单克隆抗体及１５ｋＤ制备的抗血清分别进行测定，该蛋白仅能与１５ｋＤ的抗血清产生高滴度反应，从而排除了其为Ｆ１抗原的可能性，依据上述实验结果并ｉｎｄｌｅｒＬＫ等的资料分析，该蛋白与提纯抗     

两种培养基分离鼠疫耶尔森氏菌的效果比较

上世纪80年代,美国、芬兰、日本相继报道小肠结肠炎耶尔森氏菌病的暴发流行而引起国内外医学界高度关注,各种耶尔森氏菌培养基纷纷问世,使用耶尔森氏菌选择培养基即Yersinia selective agar检验小肠结肠炎和假结核耶尔森氏菌已在国际上得到普遍认可,但分离鼠疫菌效果尚不清楚。     

PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因

目的应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验。结果该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的扩增带。结论该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验。     

鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白的分离纯化与质谱分析

目的建立一种从鼠疫耶尔森氏菌疫苗株EV76中分离纯化纤维蛋白酶原激活因子（Pla）的方法。方法采用超声破碎与硫酸铵盐析结合的方法初步提取Pla,经CHT陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化,所获取的Pla进行质谱分析及Western blot实验。结果菌悬液超声破碎后上清以0~10%饱和硫酸铵沉淀,获得含有相对分子质量（Mr）约为31 000、35 000、37 000的3条Pla蛋白带,约占蛋白总量33%;CHT柱层析后,3条带约占蛋白总量80%。经质谱分析,在Mr约为31 000、35 000的条带中含有Pla,Pla单克隆抗体能特异性地识别该蛋白。结论采用超声破碎结合硫酸铵盐析的方法可从鼠疫菌中提取Pla,CHT柱层析可达到基本纯化,获得的样品经质谱分析和Western blot实验证实为Pla蛋白。