敏感性PCR检测猪肉弓形虫方法的建立与应用

目的建立一种敏感快速的猪肉弓形虫PCR检测方法,并用来检测市售猪肉弓形虫的感染情况。方法采用不同数量的弓形虫模拟感染猪肉样本,分别以529 bp重复序列、B1基因、SAG1、SAG2、SAG3作为目标检测基因,对其敏感性进行评价,在此基础上运用敏感的靶标检测100份市售猪肉样本中弓形虫的感染情况。结果 529 bp重复序列的敏感性最高,用此靶标检测合肥市售猪肉,弓形虫阳性率为17%。结论 529 bp重复序列基因是一个可用于肉制品中弓形虫PCR检测的理想靶标。     

刚地弓形虫529 bp重复序列环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立高效检测刚地弓形虫(Toxoplama gondii)的环介导等温扩增(LAMP)方法,为弓形虫病诊断提供新的技术手段。方法采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物,用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,建立LAMP扩增反应,通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和Mg SO_4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、猪等孢球虫(Isospora suis)的基因组DNA和超纯水为对照,pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100copies/ml,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的灵敏性。结果设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示,最佳反应总体系为25μl,其中,甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L,Mg SO_4最佳浓度为6 mmol/L;添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当,可使反应时间缩短30 min;最佳反应条件为63℃30 min,80℃3 min。特异性检测结果显示,所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段,对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示,LAMP方法的最低检出值达10~3 copies/ml,效率为PCR扩增(10~4 copies/ml)的10倍。结论建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法,该法具有较好的特异性和灵敏性。     

长春地区孕妇感染弓形虫株的基因分型北大核心CSCD

目的鉴定长春地区孕妇感染弓形虫株的基因型。方法采用间接ELISA法检测长春地区840名孕妇血清中抗弓形虫IgG抗体,阳性者提取全血DNA,以弓形虫529bp高度重复序列为靶基因进行PCR扩增,用多基因位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析鉴定PCR阳性标本的基因型。结果 ELISA检测80份标本IgG阳性,其中33份标本同时PCR阳性。对PCR阳性标本进行PCR-RFLP分型鉴定,有8份标本为基因Ⅱ型。结论长春地区孕妇感染的弓形虫主要为基因Ⅱ型。     

荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体

目的运用荧光定量PCR法检测异尖线虫类病原体。方法于鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫:抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫、内弯对盲囊线虫、带鱼针蛔线虫、灰海鳗对盲囊线虫和台湾海峡鱼类中一优势种对盲囊线虫。提取各虫体DNA,PCR扩增ITS-2序列,测序并进行数据库比对。依据测序结果设计特异引物,常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数均在0.998以上。重复性实验中,6种虫体对应的变异系数(cv)最小值为0.18%,最大值为2.80%,试验间平均cv最小值为0.55%,最大值为1.94%,无非特异性扩增,溶解曲线的特异性和重复性良好。灵敏度实验中,可检出的最低模板浓度为1×102拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍。结论初步建立了SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体的方法 。     

刚地弓形虫200-300拷贝529bpDNA片段的鉴定及在诊断和定量PCR中的应用[英]

病原分离是弓形虫病诊断的最可靠方法,但是该方法操作复杂,费时费力,难以在实验室中常规应用。因此有必要建立一种敏感特异的弓形虫病诊断技术。PCR被认为是检测弓形虫的敏感方法。弓形虫PCR技术研究中,35拷贝B1基因应用得最为广泛。由于PCR敏感性与扩增基因的拷贝数密切相关,因此作者扩增一段200-300拷贝529bp DNA片段,建立定量竞争PCR,并探讨该片段在弓形虫病诊断及实验感染动物脑包囊定量中的应用价值。     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

弓形虫SYBR-Green1荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立SYBR-Green1荧光定量PCR检测弓形虫的方法,并进行实验室方法学评价。方法常规PCR扩增弓形虫RH株高度保守的B1基因部分序列,经TA克隆后转化入大肠埃希菌JM109中。提取重组质粒,PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green1荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验,对桂弓、B36虫株及恶性疟原虫、血吸虫基因组DNA、30份孕产妇标本1、221份无偿献血者标本进行检测。结果用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数0.997,平均试验间变异系数0.81%,检测桂弓、B36虫株均为阳性,而检测血吸虫、恶性疟原虫基因组DNA均为阴性;孕产妇检测阳性率16.7%,平均拷贝数为1.19×105cop-ies/μl;无偿献血者阳性率为0.74%,平均拷贝数为1.17×105copies/μl。结论成功建立了检测弓形虫B1基因的SYBR-Green1荧光定量PCR方法,较常规PCR技术更快捷、敏感、准确,适合临床实验室及无偿献血者的筛查使用。     

应用SYBR GreenⅠ荧光聚合酶链反应检测人类白细胞抗原-B27

目的 采用SYBR GreenⅠ荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测人类白细胞抗原一B27(HLA-B27)。方法 对56例风湿科门诊及住院怀疑为强直性脊柱炎(AS)的患者，以HLA-B27的特异引物和内对照β-Globin引物对标本DNA分别进行常规PCR和SYBRGreen Ⅰ荧光PCR检测，并对HLA-B27阳性DNA进行不同倍数稀释后用两种方法进行检测比较。结果 常规PCR检测HLA-B27阳性的样本上具有136bp的条带，所有的阴性和阳性样本都有268bp的β-Globin条带，共有30例患者HLA-B27阳性。SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测结果显示，阴性标本的熔解曲线图上(86．3 0．5)℃处有B-Globin的Tm峰．HLA-B27阳性的样本在熔解曲线上有(90．2 0．6)℃HLA-B27的Tm峰。两种方法结果符合率达100％。即使1：100稀释的。DNA也可用SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测出结果，而常规PCR只有用原倍DNA才能检测出结果。结论 SYBR Green Ⅰ荧光：PCR法快速、准确、敏感、实时、简单和环保的特点是常规PCR法所没有的，完全能够替代常规PCR法，成为检测HLA-B27的新手段。     

铜绿假单胞菌quiP基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的：制备用于铜绿假单胞菌PAO1 quiP基因（PA1032）实时荧光定量PCR检测的质粒标准品pMD18-quiP。方法：通过PCR扩增出目的片断,纯化后连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆,通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确,大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,并进行荧光定量PCR检测分析。结果：quiP基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示,循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论：成功构建了quiP基因实时荧光定量PCR质粒标准品。     

人KIM-1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的制备用于人KIM-1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒。方法通过PCR扩增出目的片断,纯化PCR产物与p MD18-T载体连接,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确。提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立KIM-1质粒标准品。结果 KIM-1基因目的片段成功重组至p MD18-T载体上,扩增目的片段长度为131 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库KIM-1序列性一致。结论成功构建KIM-1基因实时荧光定量PCR标准品质粒。     

贵州省抑郁症患者刚地弓形虫感染状况调查及其基因型鉴定

目的了解贵州省抑郁症患者弓形虫感染状况及弓形虫基因型。方法 ELISA检测141例抑郁症患者和150例健康对照外周血弓形虫特异性抗体(IgG、IgM)和循环抗原(CAg),PCR扩增血样弓形虫高重复DNA片段(529 bp),多重-巢式PCR-限制性片段长度多态性(Mn-PCR-RFLP)方法鉴定弓形虫529 bp阳性样本的基因型。结果 ELISA检测结果显示,抑郁症患者组和健康对照组弓形虫抗体阳性率分别为21.3%(30/141)和7.3%(11/150),两者间差异有统计学意义(χ~2=11.674,P0.05);抑郁症患者组的IgG、IgM、CAg阳性率分别为18.4%(26/141)、1.4%(2/141)、1.4%(2/141);健康对照组IgG阳性率为7.3%(11/150),与抑郁症患者组间差异有统计学意义(P0.05),未检测到IgM和CAg。PCR结果显示,抑郁症患者组检测出1例弓形虫核酸阳性,经Mn-PCR-RFLP方法鉴定其基因型,结果为非典型Toxo DB#9(Chinese 1型)。结论贵州省抑郁症患者弓形虫抗体阳性率高于健康人群,1例抑郁症患者感染的弓形虫基因型为Chinese 1型。     

裂谷热病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

目的根据裂谷热病毒(Rift Valley Fever Virus,RVFV)M片段的保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan探针,建立鉴定裂谷热病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。方法合成裂谷热病毒M片段基因,PCR扩增后将其连入pMD18-T载体,构建重组质粒作为阳性标准品,以10倍系列稀释的标准品进行荧光定量PCR扩增,并绘制标准曲线。结果所绘制标准曲线的相关系数为0.999,该检测方法的灵敏度达40copies/μL,特异性好,对除裂谷热病毒外其他病毒(PPRV、HFV、RV、SPPV和GIPV)检测均为阴性。该方法重复性好,批内重复和批间重复的变异系数均小于1%。结论裂谷热病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立为裂谷热病毒的快速准确诊断及流行病学调查提供了有效的手段。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1 mRNA方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类BMI-1 mRNA的方法.方法 以含有目的基因BMI-1 cDNA的质粒pEGFP-BMI-1为阳性模板,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果 该法检测的线性范围为6.4×101～6.4×107拷贝,相关系数r为-1.00,6.4×103拷贝/反应的标本批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.6%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,Tm为(80.40±0.18)℃.结论 SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测BMI-1 mRNA是快速有效、灵敏度高、特异性好的方法,可为BMI-Ⅰ的进一步研究奠定基础.     

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。     

虫种特异性基因检测小鼠无虫病理组织裂头蚴感染的可行性研究

目的研究用细胞色素C氧化酶1基因(cox1)及内转录间隔区1(ITS-1)特异性序列检测小鼠无虫病理组织中裂头蚴感染的可行性。方法 6~8周龄昆明小鼠20只,采用随机抽签法分为感染组(15只)和未感染组(5只),感染组小鼠经口感染蛇源裂头蚴(5条/只),未感染组不作任何处理。感染后第14天剖杀小鼠,取感染组小鼠皮下含裂头蚴肌肉组织(含虫组织)、去除裂头蚴肌肉组织(无虫组织)及未感染组小鼠相应部位肌肉,制作组织切片,苏木精-伊红染色法(HE)染色后观察。用改良的蛋白酶K消化法提取未染色肌肉组织切片的DNA,PCR扩增cox1(2对引物,对应cox1-1和cox1-2片段)和ITS-1序列。选取从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1进行克隆并测序,与Gen Bank中猬裂头蚴序列(KJ418421、KF990161、GQ999947)进行比对。以猪囊尾蚴感染的小鼠肌肉组织同法制作切片并提取DNA,评价cox1和ITS-1 PCR扩增的特异性。结果感染组含虫组织DNA经1次PCR即可扩增出414 bp(cox1-1)、151 bp(cox1-2)、822 bp(ITS-1)的条带。感染组无虫组织DNA第1次PCR未扩增出条带,以第1次PCR产物为模板再次PCR,扩增出相同大小的3条条带。未感染组DNA第1次和第2次PCR均未扩增出条带。序列比对结果显示,从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1序列与KJ418421、KF990161、GQ999947序列的同源性分别为98.2%、99.1%、99.1%。猪囊尾蚴感染组织DNA没有扩增出条带。结论以cox1和ITS-1序列为靶序列进行重复PCR,能鉴定小鼠无虫病理组织裂头蚴感染。     

TaqMan-LNA探针多重实时荧光定量PCR检测炭疽芽胞杆菌的研究

目的设计检测多个靶基因的炭疽多重荧光定量PCR反应系统,建立快速准确的基因诊断方法,解决蜡样芽胞菌群基因诊断交叉反应问题。方法选择炭疽杆菌PX01毒素质粒基因pagA,PX02毒素质粒基因capB,以及染色体上的前噬菌体λBa03基因PL3作为靶基因,利用在线荧光定量PCR引物设计软件设计、优化多重PCR引物以及相应的TaqMan探针序列,对探针进行LNA标记并优化荧光PCR反应体系,构建多重实时荧光定量PCR反应系统。以3对引物PCR扩增并克隆靶基因的质粒标准品,倍比稀释后进行敏感度试验,以炭疽、蜡样芽胞杆菌、苏云金杆菌、蕈状杆菌以及常见肠道致病菌进行特异度试验,利用炭疽弱毒株污染土壤及奶粉进行模拟检测。结果 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR可迅速检出3个炭疽杆菌靶基因,常用的探针法荧光定量PCR反应液均适用;pagA、CapB、PL3基因克隆标准品序列正确;该方法对pagA、CapB、PL3基因的检出限分别为63、398、114copies/μl,且仅检出炭疽杆菌基因,其余4种蜡样芽胞菌扩增均阴性。土壤及奶粉样品检测均阳性,其中pagA近检出限为6.6×104/ml,PL3基因检出限为6.6×105/ml。结论 TaqMan-LNA多重实时荧光定量PCR方法具有适用性广,检测迅速,灵敏度及特异度高等特点,能够将炭疽杆菌与蜡样芽胞菌群中其他细菌相鉴别,可试用于炭疽杆菌的感染检测。     

云南大理HIV阳性者感染弓形虫表面抗原SAG1和SAG3基因位点的初步分析

目的通过分析云南大理HIV阳性者感染弓形虫表面抗原SAG1和SAG3基因位点,鉴定该地区HIV阳性者感染弓形虫的基因型。方法自云南省艾滋病防治机构收集大理HIV阳性者全血样品291份,运用巢式PCR技术对血样DNA进行弓形虫SAG1和SAG3基因的扩增,扩增产物分别用限制性内切酶Sau96Ⅰ、HaeⅡ和NciⅠ酶切,并对扩增阳性的产物序列进行测定与分析。结果291份HIV阳性者血样中,成功扩增出弓形虫SAG1基因64份,SAG3基因42份,产物分别为390 bp和225 bp。扩增产物经酶切后电泳,结果显示,64份SAG1基因均得到2个片段,分别为350 bp和50 bp,42份SAG3基因均得到约200 bp大小的条带,与弓形虫基因Ⅰ型标准株(RH株)结果一致。从酶切的标本中选择多份进行测序,结果与基因Ⅰ型标准株SAG1基因序列(登录号为GQ253073)和SAG3基因序列(登录号为JX218225.1)进行比对分析,发现序列一致性分别为99.98%~100%和99.96%~99.98%。结论云南大理HIV阳性者感染弓形虫为基因Ⅰ型。     

环介导同温DNA扩增技术快速检测弓形虫DNA的初步研究

目的 建立一种快速的弓形虫活动性感染检测方法. 方法 根据刚地弓形虫特异性基因B1的基因序列设计一套用于环介导同温DNA扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,用DNA聚合酶Bst在65 ℃水浴箱中对含有弓形虫基因组DNA的样本进行LAMP扩增,用荧光染料SYBRⅡ染色及琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色观察结果.同时进行常规PCR对照试验. 结果 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色发现LAMP扩增产物为大小不等的DNA片段,在扩增产物中加入荧光素SYBRⅡ顔色由紫红色变成绿色荧光,而阴性对照管仍保持紫红色.环介导同温DNA扩增的敏感性为103个弓形虫/ml, 高于常规PCR. 结论 LAMP扩增检测弓形虫DNA的方法已经建立,为发展弓形虫病快速诊断方法奠定了良好的基础.     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。