HTRA1基因过表达对视网膜色素上皮细胞增殖及迁移影响

目的 研究HTRA1基因过表达对人视网膜色素上皮细胞(RPE)的增殖和迁移能力的影响,探讨HTRA1基因在老年黄斑变性(AMD)发病中的作用.方法 用携带人HTRA1基因的慢病毒感染体外培养的人RPE细胞,荧光显微镜下观察细胞的感染效率,RT-PCR和Westem Blot检测HTRAlmRNA和蛋白的表达,MTT比色法检测感染细胞毒性及细胞增殖能力,TransweH小室检测细胞迁移能力变化.结果 与空载体慢病毒感染RPE细胞相比,HTRA1基因慢病毒感染的RPE细胞HTRA1mRNA和蛋白的表达量明显增加,细胞增殖能力及迁移能力均明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 过表达HTRA1基因能抑制人视网膜色素上皮细胞的增殖及迁移,THRA1基因可能通过影响RPE细胞功能参与AMD的进程.     

大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体的构建及其对大鼠RPE细胞中Slit2基因的下调作用

背景 年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人致盲的首要原因.目前,AMD的治疗方式在取得显著疗效的同时亦有一定的不足,寻找新的有效治疗靶点是当前的研究热点. 目的 构建大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,筛选有效干扰序列以用于大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中Slit2基因沉默,为大鼠相关体内实验奠定基础.方法 设计2条大鼠Slit2基因siRNA序列,退火形成DNA,连接形成慢病毒干扰载体并进行测序鉴定.采用三质粒共转染293T细胞法收获慢病毒(Lv-rSlit2-siRNA),用药物筛选法测定病毒悬液滴度.将大鼠RPE细胞分为空白对照组、空病毒组、Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组,根据分组分别用仅有病毒的载体和不同序列的Lv-rSlit2-siRNA载体转染细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定各组细胞中Slit2 mRNA及蛋白的表达以确定Slit2基因的敲减率,筛选有效干扰序列.采用0、100、200和400μmol/L CoCl2孵育大鼠RPE细胞以制备缺氧细胞模型并转染筛选Lv-rSlit2-siRNA2干扰序列,采用实时荧光定量PCR法和ELISA法测定大鼠RPE细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)表达变化及细胞上清液中VEGFA质量浓度.结果 成功构建2条大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,病毒滴度分别为5×108 TU/ml和3×108 TU/ml,转染病毒后72 h于荧光显微镜下观察RPE细胞慢病毒转染率均在70％以上.Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2 mRNA相对表达量分别为0.67±0.09和0.23±0.11,明显低于空白对照组的1.03±0.31和空病毒组的0.92 ±0.07;Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2蛋白相对表达量分别为0.62±0.07和0.49±0.02,明显低于空白对照组的1.00±0.10和空病毒组的0.95±0.11,差异均有统计学意义(均P＜0.01).0、100、200和400 μmol/L CoCl2作用后,空白对照组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA的相对表达量明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=127.998,P＜0.01;F分组=69.663,P＜0.01),不同浓度CoCl2作用后各组大鼠RPE细胞中VEGFA蛋白相对表达量均明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=17.059,P＜0.01;F分组=91.791,P＜0.01).100、200和400 μmol/LCoCl2作用后Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA表达量及蛋白质量浓度均明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体构建成功并筛选出有效干扰重组序列,其能有效下调大鼠RPE细胞中Slit2基因的表达,并抑制缺氧环境下VEGFA在大鼠RPE细胞中的表达.     

携带sFlt-1基因片段的慢病毒载体的构建及表达

目的分别建立携带可溶性血管内皮生长因子受体-1（sFlt-1）不同基因片段的慢病毒表达质粒，为进一步研究sFlt-1不同基因片段表达的蛋白生物学功能奠定基础。方法以人新鲜胎盘组织提取的cDNA为模板，进行RT—PCR扩增，制备sFlt-1基因片段sFlt-1（2-3）和sFlt-1（2-4）。扩增片断经限制性内切酶BamH1和Sall双酶切后，插入慢病毒载体pRRL-GFP中，构建慢病毒表达质粒pRRL／sFlt．1（2-3）及pRRL／sFlt-1（2—4），与慢病毒包装载体pMDLg／pRRE、包被载体PRSV／REV、pMD2．G共转染人胚肾细胞（HEK293T），获得重组慢病毒Lenti．sFlt-1（2—3）及Lenti-sFlt-1（2-4），并感染人视网膜色素上皮（RPE）细胞，通过RT-PCR和Westernblotting验证Lenti-sFlt-1（2—3）及LentisFlt-1（2-4）在人RPE细胞的表达。结果经酶切鉴定及基因测序证实pRRL／sFlt-1（2-3）和pRRL／sFlt-1（2-4）的序列与GenBank中的序列完全一致，并且包装成病毒后能有效感染人RPE细胞。结论本实验成功构建了分别携带sFlt-1基因第2-3和第2-4免疫球蛋白样区域编码序列的慢病毒载体，包装成病毒后能有效感染人RPE细胞。     

重组人神经生长因子腺相关病毒载体的构建及病毒滴度的测定

目的克隆人神经生长因子-β(nerve growth factor-β,NGF-β)基因,重组于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体,构建表达人NGF-β的重组腺相关病毒,检测滴度,为NGF-β的真核表达及临床应用提供实验基础。方法从正常人基因组中扩增出人NGF-β全长开放读框,将其克隆于pAAV-MCS载体,双酶切和测序鉴定重组病毒载体。将该质粒与腺相关病毒包装质粒(pAAV-RC)、腺相关病毒辅助质粒(pAAV-Helper)共转染AAV-293细胞,通过包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液。以pAAV-LacZ和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,重组病毒AAV-LacZ感染AAV-HT1080细胞,经对报告基因LacZ的X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度。结果PCR产物经电泳证明大小正确,重组质粒pAAV-NGF-β经双酶切和测序证实NGF-β基因正确插入载体且序列正确。通过AAV-LacZ感染AAV-HT1080细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒的滴度为10×109pfu.L-1。结论成功构建了表达人NGF-β基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究NGF-β基因治疗角膜病打下基础。     

携带 Tum5 基因的慢病毒表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

目的:构建及鉴定Tum5基因慢病毒表达载体,并观察在体外人血管内皮细胞中的表达。方法:采用PCR技术从含有tumstatin基因的质粒克隆模板pSPORT1-Sfi钓取Tum5基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Tum5,通过酶切、测序验证Tum5基因后,将pGC-FU-Tum5质粒和包装质粒pHelper1.0,pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Tum5基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-Tum5,并转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞。通过检测标志蛋白-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的蛋白Tum5进一步验证pGC-FU-Tum5在靶细胞中Tum5的表达。结果:(1)pGC-FU-Tum5中携有正确的Tum5基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-Tum5共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-Tum5;(2)目的基因Tum5能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人脐静脉血管内皮细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到Tum5蛋白在靶细胞中的表达。结论:成功构建了携带Tum5基因的重组慢病毒载体,转染人脐静脉血管内皮细胞后能够稳定表达Tum5基因,为进一步研究Tum5的功能和眼部新生血管疾病的治疗奠定基础。     

慢病毒介导的TGFβ-R2shRNA抑制人LECs细胞TGFβ—R2的表达

目的：观察转化生长因子β-R2特异性短发夹 RNA （ shRNA ）对人晶状体上皮细胞TGFβ-R2表达的影响。 方法：根据小干扰RNA （ siRNA ）的设计原则,针对转化生长因子β-受体2基因序列特征构建特异性 shRNA （ RNAi ）载体,与TGFβ-R2过表达载体共转染293 T细胞,经Western blot筛选出有效RNAi载体后,进行扩增、纯化、滴度测定,并转染培养的人LECs , qPCR 检测TGFβ-R2 siRNA慢病毒载体对TGFβ-R2 mRNA表达的影响。 结果：经Western blot 筛选,TGFβ-R2/GV115RNAi＃1对目的基因的表达敲减效果最明显,慢病毒包装,滴度为8E＋8 TU/mL,感染人LECs细胞后,对TGFβ-R2基因有显著的敲减效果,达到78．1％（P＜0．05）。 结论：TGFβ-R2 RNAi载体构建成功,并且能抑制人晶状体上皮细胞TGFβ-R2 mRNA的表达。     

HTLV-1 Tax 基因真核表达载体的构建及对 RPE 细胞的影响

目的构建人T淋巴细胞白血病病毒-1(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)Tax基因真核表达载体,在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达Tax蛋白,观察其对细胞的影响。方法应用基因重组技术构建重组载体PIRES2-EGFP-Tax(PT),鉴定后将重组载体转染入RPE细胞,应用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测细胞内Tax基因和蛋白的表达;通过MTT和流式细胞仪检测质粒(空白载体、PT和Green-Tax)转染RPE细胞24h和48h后对RPE细胞生长活力及细胞周期的影响。结果经双酶切鉴定和测序分析证实成功地构建了HTLV-1Tax真核表达载体;通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测到转染Tax重组载体的RPE细胞中有Tax基因和蛋白的表达。质粒转染RPE细胞后,细胞生长活力受到抑制,G1期减少而S期增加。但转染Tax质粒和空白载体,对RPE细胞的生长活力和细胞周期产生相似影响。结论成功构建了HTLV-1Tax基因真核表达载体,并在RPE细胞中表达Tax蛋白;Tax质粒对RPE细胞的影响不排除是转染试剂所致。     

靶向Slug基因腺相关病毒载体的构建及其抑制视网膜母细胞瘤细胞生长的体外研究

目的 构建并制备携带目的 基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.方法 首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后回收PCR产物.酶切pSNAV2.0-LacZ-α载体质粒,并与上述产物进行连接.转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定.建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRNA并对其纯化、鉴定和滴度测定.将体外培养的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞转染rAAV-EGFP-Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体.鸡胚绒毛尿囊膜实验检测血管生成,MTT比色法检测细胞存活率,建立鸡胚绒毛尿囊移植瘤.结果 携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-SIug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确.将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-Slug-siRNA,经检测目的 片段插入成功,滴度为90.21×109 puf.Slug-siRNA有效抑制RB细胞内Slug表达后,肿瘤血管密度明显降低,血管生成被抑制,细胞存活率明显降低.实体瘤血管生成和生长受到抑制.结论 成功制备出高滴度的携带目的 基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.干扰Slug可抑制肿瘤血管生成,抑制RB细胞的生长增殖.     

慢病毒介导的TGFβ-R2 shRNA抑制人LECs细胞TGFβ-R2的表达

目的：观察转化生长因子β-R2特异性短发夹RNA(shRNA)对人晶状体上皮细胞TGFβ-R2 表达的影响。

方法：根据小干扰RNA(siRNA)的设计原则,针对转化生长因子β-受体2基因序列特征构建特异性shRNA(RNAi)载体,与TGFβ-R2过表达载体共转染293T细胞,经Western blot筛选出有效RNAi载体后,进行扩增、纯化、滴度测定,并转染培养的人LECs,qPCR检测TGFβ-R2 siRNA慢病毒载体对TGFβ-R2 mRNA表达的影响。

结果：经Western blot筛选,TGFβ-R2/GV115RNAi#1对目的基因的表达敲减效果最明显,慢病毒包装,滴度为8E+8 TU/mL,感染人LECs细胞后,对TGFβ-R2基因有显著的敲减效果,达到78.1%(P<0.05)。

结论：TGFβ-R2 RNAi载体构建成功,并且能抑制人晶状体上皮细胞TGFβ-R2 mRNA的表达。     

CD105特异性shRNA表达质粒的构建和筛选

目的:使用Pgenesil-1质粒构建CD105RNA干扰重组体,在激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型中,筛选高效抑制CD105基因表达的shRNA。方法:根据CD105基因序列信息设计了3条shRNA以及1条非特异阴性序列,利用含U6启动子的表达质粒Pgene-sil-1构建其RNA干扰重组体。采用视网膜下注射的方法使shRNA表达质粒转染大鼠视网膜和脉络膜,观察质粒所携带绿色荧光蛋白基因表达情况。根据不同的表达质粒对BN大鼠CNV模型2wk时CD105基因mRNA表达的抑制效果与空白对照及仅加转染试剂组比较分析,筛选有效的抑制序列。结果:转染后1d,在荧光显微镜下可见有明显的绿色荧光分布于实验眼视网膜全层,包括RPE层。2~3wk荧光强度比1wk增强,并持续表达4wk。空白对照眼无绿色荧光表达。构建了3条CD105shRNA和阳性对照Pgenesil-HK,基因测序证实目的序列成功插入质粒Pgenesil-1中。研究发现不同的质粒转染后对CD105在CNV高峰期的表达干预效果不同。Pgenesil-eng2和Pgenesil-eng3可明显抑制CNV模型在2wk时CD105mRNA的表达,抑制效率分别为(78±5)%(P<0.01);(52±3)%(P<0.01)。转染Pgenesil-eng1,Pgenesil-HK组及仅加转染试剂组与空白对照组相比CD105mRNA表达水平无明显变化。结论:在阳离子脂质体辅助下,Pgenesil-1质粒可以成功地将目的基因转染至大鼠视网膜各层次,且表达强度高,时间长于4wk。Pgenesil-eng2能明显抑制BN大鼠视网膜组织CD105mRNA的表达。     

靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的　构建靶向大鼠Ｇ蛋白偶联受体９１（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ-ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ９１,ＧＰＲ９１）基因的小发夹ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ,ｓｈＲＮＡ）慢病毒载体,探讨ＧＰＲ９１受体对高糖诱导下血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）释放的调节作用。方法　设计合成４对针对大鼠ＧＰＲ９１（ＮＭ＿００１００１５１８）的特异性单链寡核苷酸链,两端分别引入ＡｇｅＩ和ＥｃｏＲＩ酶切位点,退火后得到小片段带黏性末端的双链ＤＮＡ,克隆入慢病毒载体ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ,行聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）和ＤＮＡ测序鉴定重组体。将各慢病毒ｓｈＲＮＡ干扰载体和辅助包装载体共转染２９３Ｔ细胞,收集病毒颗粒并行浓缩滴度检测。将各慢病毒载体转染ＲＧＣ-５细胞后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法筛选有效的慢病毒ｓｈＲＮＡ干扰载体。使用４５ｍｍｏｌ?Ｌ－１的高糖刺激ＲＧＣ-５细胞２４ｈ,用ＥＬＩＳＡ法观察干扰ＧＰＲ９１后ＶＥＧＦ的表达情况。结果　ＰＣＲ及ＤＮＡ测序结果均显示慢病毒载体ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧＰＲ９１构建正确;包装病毒颗粒后,ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧＰＲ９１-１、２、３、４组病毒浓缩液的滴度依次为１．５×１０９ ＴＵ?ｍＬ－１、１．５×１０９ＴＵ?ｍＬ－１、３．０×１０９ＴＵ?ｍＬ－１、３．０×１０９ＴＵ?ｍＬ－１。将慢病毒颗粒感染ＲＧＣ-５细胞后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示ＮＣ组ＧＰＲ９１蛋白（０．６０±０．０８）空白组（０．６２±０．０７）的表达无明显差异（Ｆ＝４９．０３,Ｐ＞０．０５）。而与空白组相比,４个慢病毒载体组（０．４８±０．０５、０．３４±０．０６、０．３０±０．０４和０．１１±０．０６）均能不同程度沉默ＧＰＲ９１的表达,差异有统计学意义（Ｆ＝４９．０３,Ｐ＜００１）,其中ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧＰＲ９１-３干扰效率最高。ＥＬＩＳＡ结果显示空白组、高糖组、高糖＋ＮＣ组、高糖＋ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧ-ＰＲ９１-３组ＶＥＧＦ蛋白表达分别为（２５．６３±４．５２）ｐｇ?ｍＬ－１、（７２．７４±８．２４）ｐｇ?ｍＬ－１、（７１．６８±８．３１）ｐｇ?ｍＬ－１和（４６．７７±６２１）ｐｇ?ｍＬ－１,表明ＧＰＲ９１病毒干扰载体可显著降低高糖引起的ＶＥＧＦ分泌,差异有统计学意义（Ｆ＝３０．８５２,Ｐ＜０．０１）。结论　本实验成功构建了靶向大鼠ＧＰＲ９１的ｓｈＲＮＡ慢病毒载体并进行病毒颗粒包装。所构建的慢病毒载体能够降低高糖作用下的ＶＥＧＦ表达,为进一步研究ＧＰＲ９１基因在糖尿病视网膜病变中的作用机制和动物基因治疗奠定基础。     

AAV介导的EPO基因下调对CNV的抑制作用

研究腺相关病毒（AAV）介导的促红细胞生成素（EPO）shRNA靶向视网膜色素上皮（RPE）的EPO表达水平下调对脉络膜新生血管（CNV）进展的影响，以期发现潜在的湿性年龄相关性黄斑变性（nAMD）的治疗靶点。方法：实验研究。在HEK293T细胞内对包含EPOshRNA片段的AAV质粒进行验证（采用Student's t检验）。选用2个月龄C57/B6J小鼠10只，右眼作为实验组，视网膜下注射AAV1-sCBA-GFP-EPO-shRNA；左眼作为对照组，视网膜下注射AAV1-sCBA-GFP。注射后3周，进行激光诱导的CNV造模，造模后拍摄眼底照片确认病毒转染及造模情况，造模后15 d RPE铺片以 测算CNV面积大小，并用Student's t检验方法进行组间比较。结果：EPO shRNA在HEK293T细胞内对EPO表达的下调效率为69.6%，且与对照组相比差异具有统计学意义（t=6.080，P=0.022）。眼底照片显示，注射了AAV的小鼠造模成功；视网膜有点状的绿色荧光蛋白表达，证实病毒转染成功。造模后15 d，RPE铺片显示实验组的平均CNV面积与对照组相比小44.7%（t=4.279，P=0.001）。结论：AAV介导的EPO shRNA对CNV的发生和发展起到显著的抑制作用，在未来可能作为nAMD的新治疗方法。     

疱疹性口腔炎病毒G蛋白/胸苷激酶逆转录病毒载体转移人视网膜色素上皮细胞及其表达

目的　应用新型逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpessimplexvirus thymidinekinase ,HSV TK)基因转移 ,探讨丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对HSV TK基因修饰人视网膜色素上皮细胞 (retinalpigmentepithelialcells,RPE)的杀伤抑制作用。方法　生产制备高滴度疱疹性口腔炎病毒G蛋白 (vesicularstomatitisvirus Gprotein ,VSV G) /胸苷激酶 (thymidinekinase ,TK)和VSV G/LacZ病毒 ,对NIH3T3细胞进行VSV G/TK滴度测定 ;VSV G/LacZ感染CRL2 30 2细胞后 ,以X gal染色估计感染率 ;对CRL2 30 2细胞、分离培养的RPE细胞及NIH3T3细胞感染不同病毒滴度的VSV G/TK ,结合GCV作用 ,观察 3种细胞生长抑制率。结果　VSV G/TK滴度为 1 2× 10 8克隆形成单位 /ml;VSV G/LacZ感染CRL2 30 2细胞的X gal染色蓝染细胞率为 5 8% ;当感染复数为 2 0 0时可最大的抑制细胞生长 ,抑制率为 4 5 %。结论　VSV G逆转录病毒可以介导LacZ、HSV TK基因在离体NIH3T3细胞和人RPE细胞中高效转移和表达。被HSV TK基因修饰的细胞对GCV作用敏感 ,其生长受到抑制。     

色素上皮衍生因子修饰的人脐带间充质干细胞构建方法

目的:构建携带色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor,PEDF)基因的重组慢病毒,感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs),探讨PEDF在hUCMSCs中的表达及重组慢病毒对hUCMSCs活性的影响.方法:利用pLenti-CMV-hChR2-EYFP 载体系统,构建携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP,进一步感染hUCMSCs,获得携带PEDF基因的hUCMSCs(PEDF-hUCMSCs),激光共聚焦显微镜和ELISA法检测PEDF-hUCMSCs 的PEDF蛋白表达情况,采用CCK8法检测PEDF-hUCMSCs的活性.通过观察细胞形态和流式细胞术检测验证重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染hUCMSCs后对细胞传代、细胞表型的影响.结果:成功构建携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP,高效感染hUCMSCs,获得的PEDF-hUCMSCs能有效表达PEDF蛋白,检测结果显示重组病毒感染组细胞与空白对照组细胞活性无统计学差异(P>0.05).重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染对hUCMSCs的增殖能力、细胞形态和细胞表型没有明显改变. 结论:携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP修饰的PEDF-hUCMSCs能有效表达PEDF蛋白,为进一步探索应用PEDF-hUCMSCs治疗视网膜色素变性疾病奠定了实验基础和理论依据.     

HSV-1感染对人视网膜色素上皮细胞生长的影响

目的:建立单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus,HSV-1)感染人视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmentepith elial,RPE)的体外模型,观察HSV-1感染对体外培养RPE细胞生长的影响。方法:以感染复数(MOI)为5的HSV-1(F株)感染体外培养的RPE细胞。用相差显微镜观察RPE细胞的形态变化;用MTT法、流式细胞术观察HSV-1感染对RPE细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响;用PCR和免疫荧光法验证HSV-1感染RPE细胞是否成功。结果:成功在体外建立了HSV-1感染RPE的细胞模型。HSV-1感染RPE细胞8h后出现病变,细胞形态开始变得细长和皱缩;感染24h后细胞病变更加明显,细胞间间隙增加,甚至可见多核巨细胞;感染48h后所有细胞均变圆,细胞开始出现脱落甚至死亡。MTT法显示HSV-1感染RPE后24h和48h能抑制细胞生长(P<0.01),细胞的抑制率分别为(16.37±3.28)%和(47.91±6.39)%;流式细胞仪检测发现HSV-1感染可影响RPE细胞的细胞周期,但对细胞凋亡无明显影响。结论:HSV-1能感染体外培养的RPE细胞,抑制RPE细胞的增殖,并影响RPE细胞的细胞周期。眼科学报2007;23:212-218.     

小鼠B、T淋巴细胞衰减因子真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建小鼠B、T淋巴细胞衰减因子（BTLA）的真核表达载体,并分析其在人胚肾HEK293细胞中的表达,为单纯疱疹性角膜基质炎的免疫治疗奠定基础。方法应用PCR法获得小鼠BTLA胞外功能区的cDNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得重组表达质粒pBTLA,经酶切鉴定和测序正确后转染HEK293细胞,并利用间接免疫荧光法、实时定量PCR（real-time PCR）、Western blot技术检测BTLA在细胞中的表达。结果重组质粒pBTLA经酶切鉴定和测序,确认插入序列正确,与基因文库中提供的基因序列同源性达98%～100%。Real-time PCR检测可见转染了重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA mRNA表达增强（P=0.00）,3个组间HEK293细胞内BTLA mRNA表达差异有统计学意义（F=167.83,P=0.00）;Western blot结果显示,转染重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA蛋白表达明显增强,转染后24～48 h表达最强。间接免疫荧光结果显示BTLA蛋白主要表达在HEK293细胞的细胞膜和细胞质中。结论成功构建了BTLA的真核表达载体,该重组质粒在HEK293细胞中能够表达BTLA,为后续研究BTLA在抗病毒免疫中的作用奠定基础。     

细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体及体外表达

目的: 构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子 p52(LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测 LEDGFp52 重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法: 将 LEDGFp52 基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack- CMV上构建腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV-LEDGFp52,将腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV- LEDGFp52 与5 型腺病毒骨架质粒 pAdeasy- 1 共转染 BJ5183 细菌, 经细菌内同源重组产生携带 LEDGFp52 基因的重组腺病毒载体 pAd- LEDGFp52, 将 pAd- LEDGFp52 经脂质体法转化293 细胞包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 将 Ad-LEDGFp52 体外转染 293 细胞, CPE 法及 westernblot 观察目的基因的表达。结果: 构建了表达 LEDGFp52 基因的重组腺病毒质粒, E.coli 内成功同源重组腺病毒, 在 293 细胞内包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 滴度可达 5×1012 pfu/L。在真核细胞中有效表达目的基因 LEDGFp52, 出现显著的 CPE 效应。结论: 成功构建表达 LEDGFp52 的重组腺病毒载体, 为进一步进行 LEDGF p52 基因功能的研究提供了实验基础。     

Bax过表达诱导培养的人视网膜色素 上皮细胞凋亡观察

目的研究外源性促凋亡基因bax过表达对培养人的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium ,RPE）细胞凋亡的影响。 方法通过脂质体Lipofectin介导法用含人全长bax 基因片段的真核表达载体P^MDNA3-hbax质粒转化体外培养的RPE细胞,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,提取实验组细胞DNA进行DNA梯度电泳。结果Zn^2+可诱导P^MDNA3-hbax转化组RPE细胞出现明显的凋亡峰 ,凋亡峰位于单倍体和二倍体之间,凋亡率为36%,DNA电泳可见DNA梯状条带,P^MDNA3空载体组及未转染组RPE细胞未见亚二倍峰和DNA梯状条带出现。结论外源性促凋亡基因bax过表达可诱导RPE细胞凋亡。(中华眼底病杂志,2001,17:132-134)