Smad通路参与ERK通路诱导血管平滑肌细胞增殖的过程

目的： 探讨Smad通路是否参与细胞外信号调节激酶(ERK)通路诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的过程及其可能机制。方法：将人脐动脉平滑肌细胞（hUASMCs）分为对照组、血小板源性生长因子（PDGF）组、ERK阻断剂组和PDGF+ERK阻断剂组。用MTT法测hUASMCs的增殖活性(A值)，用免疫组化法测hUASMCs内细胞核增殖抗原（PCNA）、磷酸化ERK和磷酸化Smad蛋白的表达，用RT-PCR法测hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达。结果：PDGF组hUASMCs的增殖活性(A值)及hUASMCs内的PCNA、磷酸化ERK和磷酸化Smad2/3蛋白的表达都明显高于其它各组(P<0.01)；各组hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达没有差异。结论： Smad通路可在蛋白水平参与ERK通路诱导VSMCs的增殖过程。     

MEF2A与肝星状细胞活化的关系研究

目的： 观察核转录因子-肌细胞增强因子2A (MEF2A)在肝星状细胞(HSC)活化过程中的动态变化及与HSC活化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的关系,探讨MEF2A在HSC活化过程中可能作用。方法: 从SD大鼠肝脏分离HSC并培养在塑料细胞培养皿中,在体外培养过程中HSC逐步活化,分别收集新分离(0 d)和经培养(1、2、3、4、5、6、7、8 d)的HSC,采用实时荧光定量PCR检测各期细胞中MEF2A mRNA表达;Western blotting检测各期细胞中MEF2A和α-SMA的含量;凝胶阻滞实验(EMSA)方法检测MEF2A DNA结合活性。结果: 实时荧光定量PCR结果表明新分离的HSC内有少量MEF2A mRNA表达,随着HSC培养逐步活化,MEF2A mRNA表达逐步增加;Western blotting检测结果发现新分离的HSC内有少量MEF2A及α-SMA,随着HSC培养逐步活化,细胞内MEF2A及α-SMA逐步增加,二者呈正相关;EMSA结果表明MEF2A DNA结合活性逐步增高。结论: 随着HSC激活,MEF2A基因和蛋白表达量逐渐增加,且MEF2A DNA结合活性同步增高,MEF2A可能参与了HSC活化过程。     

CaN-NFAT信号通路参与苯肾上腺素介导的血管平滑肌细胞增殖

目的 研究钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子(CaN-NFAT)信号通路对苯肾上腺素诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的调节作用。方法：组织贴块法原代培养SD大鼠血管平滑肌细胞,MTT法和细胞计数法测定VSMCs增殖,间接免疫荧光法测定NFATc1细胞定位,Western blot测定CaN蛋白表达,定磷法检测CaN活性。结果：苯肾上腺素(PE,α1-受体激动剂)促进VSMCs增殖,哌唑嗪(prazosin,α1-受体抑制剂)和环胞霉素A(CsA,CaN抑制剂)降低PE诱发的VSMCs增殖,白屈菜红碱(chelerythrine,蛋白激酶C抑制剂)预处理VSMCs后,PE诱发的VSMCs吸光度和细胞数被抑制, 并且这种抑制作用可以被CsA进一步加强。CsA抑制PE诱发的CaN表达与活性。PE促进NFATc1从胞质易位入核,CsA抑制NFATc1核转位。结论：CaN-NFATc1信号通路参与调节苯肾上腺素诱导的VSMCs增生肥大。     

NO/PKG介导Ca2+/Calcineurin信号通路调控血管平滑肌细胞增殖

目的研究NO/PKG介导Ca2 /钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的调控。方法植块法原代培养W istar大鼠VSMCs。W estern blot测定CaN表达,定磷法测定CaN活性。MTT法测定VSMCs的增殖,丫啶橙/溴化乙锭荧光染色法测定VSMCs的活性。结果SNAP和Sp-8-pCPT-cGMPS使苯肾上腺素(PE)诱发的VSMCs吸光度分别降低,而Rp-8-pCPT-cGMPS则可使吸光度增加。维拉帕米预处理VSMCs后,PE诱发的VSMCs吸光度降低,并且上述吸光度可以被SNAP或Sp-8-pCPT-cGMPS进一步抑制,但可被Rp-8-pCPT-cGMPS轻微升高。环胞素A预处理VSMCs后,PE诱发的VSMC吸光度降低,但是这一数值不能被SNAP、Sp-8-pCPT-cGMPS或Rp-8-pCPT-cGMPS进一步抑制或升高。SNAP和Sp-8-pCPT-cGMPS抑制PE诱发的CaN表达与活性。结论NO/PKG抑制血管SMCs增殖,但并不影响SMCs存活率;NO/PKG这一作用是介导SMCs内游离钙/CaN信号通路实现的。     

雌激素诱导的合成型血管平滑肌细胞凋亡与p38通路激活及肌细胞增强因子-2的表达

目的 探讨雌激素诱导合成型血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的分子机制.方法 体外培养第3代的雌性大鼠VSMCs分为3组:17β-雌二醇(E2)组、p38通路阻断(SB E2)组和对照组.药物处理72h后,ELISA法检测细胞内核小体以检测VSMCs凋亡率, Western blotting检测p38总蛋白、磷酸化p38(p-p38)的变化及肌细胞增强因子-2(MEF2)的表达,免疫组织化学染色确认MEF2的定位和表达.结果 ELISA检测显示,E2组VSMCs凋亡率明显高于对照组,而SB E2组无明显变化.Western blotting显示,E2组p38、p-p38和MEF2均明显增高,而SB E2组p38表达无明显变化,p-p38和MEF2明显降低.免疫组织化学染色显示,MEF2主要定位于细胞核,各组表达水平与Western blotting结果一致.结论 雌激素可能通过激活p38通路上调MEF2的表达,诱导VSMCs凋亡.     

叶酸通过下调ERK1/2信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的:探讨叶酸(folic acid,FA)对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移的影响及其机制。方法:取SD大鼠的主动脉,采用组织贴块法培养VSMCs,随机分组进行实验。采用CCK-8和Ed U法检测叶酸对VSMCs活力和增殖能力的影响。采用划痕实验和Transwell法检测叶酸对VSMCs迁移和侵袭的影响。采用Western blot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白表达以及血小板源性生长因子受体(PDGFR)和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的磷酸化水平。结果:叶酸抑制血小板源性生长因子(PDGF)诱导的VSMCs的活力,并呈浓度依赖性(P0.05)。叶酸抑制PDGF诱导的VSMCs的迁移,并呈浓度依赖性(P0.05)。叶酸降低PCNA表达和PDGFR磷酸化水平,并抑制PDGF激活的ERK1/2信号通路。结论:叶酸降低PDGF诱导的VSMCs PCNA和p-PDGFR蛋白水平,下调ERK1/2信号通路,从而抑制VSMCs的增殖和迁移。     

Sirt3 抑制血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠血管平滑肌细胞增殖

目的 检测小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)中Sirtuin3(Sirt3)的表达,探讨Sirt3在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导小鼠VSMCs增殖中的作用.方法 用RT-PCR、Western blot法检测细胞中是否有Sirt3基因和蛋白表达;用不同浓度AngⅡ(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5 mol/L)分别刺激细胞,用RT-PCR、Western blot法检测AngⅡ对Sirt3表达的影响;用Sirt3 siRNA转染干扰Sirt3mRNA水平后5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(Edu)试剂盒检测细胞增殖水平.结果 Western blot法、RT-PCR结果均显示正常C57小鼠VSMCs中有一定量Sirt3蛋白和mRNA表达;10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5mol/L AngⅡ刺激细胞后Sirt3 mRNA水平及蛋白表达量均明显升高(P＜0.01),其中10-6 mol/L组比10-7 mol/L组和10-5mol/L组升高更明显,差异有统计学意义(P ＜0.05);Sirt3敲减组细胞增殖较对照组明显增加(P＜0.01),Sirt3沉默+AngⅡ(10-6 mol/L)组较AngⅡ组细胞增殖明显增加(P＜0.01).结论 小鼠VSMCs中有一定量的Sirt3表达,AngⅡ刺激可使Sirt3 mRNA水平和蛋白表达量明显升高;Sirt3可抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖.     

Rab28相关信号通路在低切应力诱导 血管平滑肌细胞迁移中的作用

目的 研究低切应力（low shear stress, LowSS）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）迁移功能异常在动脉粥样硬化血管重建病理过程中的作用及其分子机制。 方法 应用双向凝胶电泳结合质谱分析的差异蛋白质组学方法,研究1.5 Pa正常切应力（normal shear stress, NSS）与0.5 Pa LowSS条件下培养血管组织的蛋白质差异表达谱。应用血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）与VSMCs联合培养的平行平板流动腔系统,分别施加NSS和LowSS,Western blot检测ECs与VSMCs的Rab28表达水平以及VSMCs的磷酸化ERK表达水平;Transwell法检测VSMCs的迁移能力;RNA干扰和PD98059分别特异性抑制VSMCs的Rab28表达和ERK磷酸化,再观察VSMCs迁移能力变化。结果 血管差异蛋白质组学的结果发现,与NSS组相比,Rab28在LowSS组血管组织的表达水平明显升高。细胞实验结果显示,LowSS加载明显上调VSMCs的Rab28蛋白表达、VSMCs迁移和ERK磷酸化。静态条件下RNA干扰抑制单独培养VSMCs的Rab28表达,VSMCs迁移能力明显降低,但ERK磷酸化水平无明显变化;应用PD98059特异性抑制VSMCs的ERK磷酸化,VSMCs迁移能力和Rab28表达水平均明显降低。结论 LowSS可能通过上调VSMCs的ERK磷酸化水平引起Rab28表达水平增加,从而诱导VSMCs迁移。探讨Rab28及其相关信号通路在切应力调控VSMCs功能中的作用及其机制,可能为深入理解动脉粥样硬化血管重建疾病发病机制和寻找新的药物治疗靶点提供力学生物学依据。     

P38/caspase-3介导的MEF2C信号通路参与大鼠脑缺血再灌注损伤

目的观察大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区肌细胞促进因子(MEF)2C磷酸化(激活)和蛋白水平的变化规律,并探讨其可能的分子机制。方法采用SD大鼠四动脉结扎模型,用免疫印迹法检测蛋白表达,给药组大鼠在缺血前20min脑室给药。结果脑缺血再灌注可诱导MEF2C激活,6h达高峰;其蛋白表达在再灌后期(3～5d)明显下降。Caspase-3蛋白和激活的caspase-3(17ku)水平在再灌后期均显著增加;Caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO可明显阻止再灌3d的MEF2C蛋白表达降低。P38激酶抑制剂SB202190不但抑制再灌注6h的MEF2C激活,而且也降低了再灌注3d的caspase-3激活;但胞外信号调节激酶(ERK)5的反义寡核苷酸未显著影响MEF2C的磷酸化水平。结论P38/caspase-3依赖的MEF2C信号通路可能参与了大鼠脑缺血再灌注诱发的神经元凋亡过程。     

LDLR启动子区DNA甲基化调控同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖的作用机制

 摘 要：目的 探讨低密度脂蛋白受体(LDLR)在同型半胱氨酸(Hcy)致血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中的作用机制。方法 原代培养VSMCs, 用50、100、200 、500 μmol/L Hcy干预72 h; MTT法观察VSMCs增殖的活性, ELSIA法和同位素法分别检测VSMCs中ox-LDL含量和DNA甲基转移酶活性; 实时定量PCR和巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测LDLR的表达和启动子区DNA甲基化的状态。结果 随着Hcy浓度的增加, VSMCs中ox-LDL含量和DNA甲基转移酶活性明显增加, 而VSMCs增殖活性下降, 同时LDLR mRNA表达增高, 且LDLR 基因启动子区呈低甲基化状态, 与对照组比较有显著性差异(P<0.05, P<0.01)。结论 LDLR基因启动子区DNA低甲基化致LDLR表达增高可能是Hcy引起VSMCs损伤的重要机制之一。     

CREG调控IGF2R/IGFII内吞抑制人血管平滑肌细胞增殖

目的: 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)抑制人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的机制。方法: 应用逆转录病毒载体pLNCX₂-CREG和pSM2-siCREG分别转染VSMCs,G418和puromycin筛选得到稳定转染细胞VSMCs-CREG和VSMCs-siCREG;Western blotting检测转染前后细胞CREG的表达;BrdU和流式细胞术检测CREG表达及对VSMCs增殖的影响。Western blotting和免疫荧光染色检测细胞胰岛素样生长因子Ⅱ受体(IGF2R)的表达;ELISA和RT-PCR检测胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)的表达;Alexa 488标记重组IGFII内吞实验观察CREG表达对IGFII内吞的影响;重组IGF2R和anti-IGF2R中和抗体阻断实验观察IGF2R-IGFII内吞作用对细胞增殖的影响;Western blotting检测细胞增殖信号分子PI3K/Akt和ERK表达,抑制剂阻断研究分析上述信号分子表达变化在细胞增殖中的作用。结果: 实验分别得到VSMCs-CREG和VSMCs-siCREG的细胞克隆,VSMCs-CREG中CREG表达增加,而VSMCs-siCREG中CREG表达减少。VSMCs-CREG细胞增殖较正常对照组明显受抑,VSMCs-siCREG细胞增殖显著增加。 VSMCs-CREG细胞中IGF2R蛋白在细胞膜上的表达及分布均显著增加,而VSMCs-siCREG细胞中IGF2R在膜上分布明显下降。CREG过表达促进IGF2R对IGFII的内吞作用,抑制了IGFII的分泌。IGFII分泌增加启动了 CREG 沉默后VSMCs的增殖,PI3K/Akt和MAPK/ERK信号协同参与了IGFII对VSMCs增殖的调控作用。结论: CREG通过调控IGF2R在细胞膜的分布,加速IGFII内吞作用,抑制了体外培养VSMCs的增殖。     

Extracellular magnesium regulates intracellular free Mg2+ in vascular smooth muscle cells

Summary Regulatory effects of extracellular magnesium ions ([Mg²⁺]_o) on intracellular free ionized magnesium ([Mg²⁺]_i) were exmained in cultured vascular smooth muscle cells (VSMCs) fromrat aorta by digital imaging microscopy using the Mg²⁺ fluorescent probe, Mag-fura-2. With normal Mg²⁺(1.2 mM)-containing incubation media, [Mg²⁺]_i in VSMCs was 0.63±0.09 mM. The ratio of [Mg²⁺]_i/[Mg²⁺]_o was 0.52±0.07. Elevation of [Mg²⁺]o up to 4.8 mM induced consistent increments in [Mg²⁺]_i (to a mean values of 1.63±0.08 mM) in 5 min and lowered the ratio of [Mg²⁺]_i/[Mg²⁺]_o to 0.34±0.02. Our data suggest that [Mg²⁺]_o can regulate [Mg²⁺]_i, which may be related to its effects on intracellular Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) and tone of VSMCs.     

大鼠心肌素慢病毒RNA干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞分化的影响

目的: 构建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干扰(RNAi)重组质粒,分析该RNAi质粒的干扰效果及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法: 设计并合成3对针对大鼠myocardin的shRNA片段,退火后将双链oligo-DNA克隆入慢病毒质粒载体pGCSIL- GFP获得重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd。以pEGFP-N1 / X124G表达载体构建含Flag标签的myocardin表达质粒pEGFP-N1- Myocd。将重组干扰质粒和过表达质粒共转染293T细胞,Western blotting分析Flag标签蛋白的表达,筛选出干扰效率最好的干扰质粒并大量扩增。干扰质粒转染大鼠主动脉VSMCs,RT-PCR和Western blotting检测myocardin及分化标志物SM22α的表达。结果: 成功构建大鼠myocardin的慢病毒干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd和过表达质粒pEGFP-N1-Myocd。上述2种质粒共转染293T细胞后,1号干扰质粒转染组Flag标签蛋白表达下降最显著。将1号质粒进行大包装,获得滴度为1×10¹² TU/L的慢病毒颗粒,该病毒转染VSMCs后,myocardin表达明显下调并伴随分化标志物SM22α表达的显著下降。结论: 成功构建大鼠myocardin慢病毒重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd;抑制基因myocardin表达后伴随VSMCs分化的表达下降,提示myocardin在VSMCs分化过程中的重要性。pGCSIL- GFP-shMyocd重组质粒的成功构建为后续研究特定病理条件下(如动脉粥样硬化)VSMCs表型转变的分子机制奠定了基础。