体外重建角膜上皮组织的实验研究

利用体外培养重建同基因角膜上皮组织的新方法，为角膜化学伤后重建角膜表面提供理想的角膜上皮移植片。方法以同种或异种脱水保存的浅层角膜基质片作为载体，通过体外培养自体缘上皮细胞，并使其在体外形成复层角膜上皮组织。     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

增龄对角膜基质载体培养的角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 观察增龄对新西兰兔角膜缘干细胞在同种异体角膜基质上生长、增殖的影响.方法 用酶消化法将不同年龄新西兰兔角膜缘组织制成细胞悬液培养,以相同的细胞密度种植于不同年龄的新西兰兔的角膜基质上,观察角膜缘干细胞在角膜幕质上的生长情况.原位杂交检测ABCG2、ANp63的表达,IPP5.1软件分析图像,流式细胞术测细胞周期,运用SPSS13.0软件对析因设计资料进行方差分析.结果 角膜缘干细胞供体年龄各水平差异有统汁学意义,相同时间内角膜基质培养的青年兔角膜缘干细胞在角膜基质单位面积卜的牛长总而积均较中年和老年高,增殖期细胞所占比例大;而角膜基质供体年龄各水平差异与角膜缘干细胞和角膜基质的交互作用均无统计学意义.结论 在同种异体角膜基质载体上培养的角膜缘干细胞的增殖能力随着年龄的增加而降低.     

组织工程技术体外重建角膜上皮层的实验研究

目的 利用组织工程技术体外重建角膜上皮组织，为眼表重建提供良好的移植材料及方法。方法 以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，分别种植兔角膜缘组织块及原代培养扩增的角膜缘上皮细胞，体外培养重建角膜上皮层，并进行形态、组织学、超微结构观察及免疫细胞化学检测。结果 角膜缘上皮细胞在羊膜上粘附生长并增殖，体外培养10天左右即形成3～4层上皮细胞，复合角膜上皮组织由羊膜基底膜和复层上皮细胞组成，细胞表达特异性角蛋白CK3，与生理状态下的角膜上皮组织相近。结论 以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞可体外重建组织工程化角膜上皮组织，作为眼表重建移植材料良好的来源。     

培养角膜上皮移植的实验研究

为尝试体外培养角膜上皮组织移植的方法,以治疗角膜表层疾患,我们以脱水保存的同种或异种浅层角膜基质片作为载体,通过体外培养同基因角膜缘上皮细胞,使其在体外形成近乎生理状态下的角膜上皮组织,再将其移植于损伤的角膜上。实验结果证实体外培养的角膜上皮组织与生理状态下的角膜上皮组织相近,动物移植透明愈合,并且未出现明显的移植排斥反应。     

羊膜培养兔角膜缘上皮细胞及自体移植--角膜缘干细胞缺损的治疗

目的　探讨以人羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞及其自体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法　在8只兔右眼用正庚醇脱上皮和角膜缘环切的方法构建全角膜缘干细胞缺损模型2月。其中6只兔为实验组,活体取左眼角膜缘浅层小块,置羊膜上常规和气_液培养42天后进行自体移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损;2只兔为对照组,直接用解冻无细胞人羊膜移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损。进行细胞和术眼活体观察、组织学观察和电镜观察。结果　角膜缘上皮细胞在羊膜上生长良好,形成复层,细胞间的联结结构存在,细胞与羊膜组织粘附牢固。实验组移植手术后角膜迅速上皮化,恢复角膜表面光滑和透明,组织学观察和电镜观察呈现生理角膜上皮层的结构特点。但眼睑闭合不全可导致手术失败。对照组术后出现角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。结论　以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞后自体移植可有效地治疗角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。     

兔角膜缘干细胞两种培养方法的比较

目的对采用消化法和组织块法培养兔角膜缘干细胞进行对比,以期确定合理的角膜缘干细胞体外培养方法。方法采用3T3成纤维细胞滋养层培养体系,分别用消化法和组织块法培养兔角膜缘上皮细胞,用免疫组织化学技术检测培养的细胞中ΔNp63的表达。采用流式细胞技术分析分离的角膜缘上皮细胞悬液中间质细胞的含量,采用扫描电镜观察去除上皮的角膜缘基质表面。结果采用消化法培养,培养的细胞中ΔNp63表达较多,细胞最终可以分化为复层上皮结构。在分离的细胞悬液中,间质细胞含量小于5%,扫描电镜显示角膜缘上皮细胞能被完全消化。结论在角膜缘干细胞的培养中,在干细胞的含量方面,消化法培养要明显优于组织块法培养。     

培养的兔羊膜上皮细胞构建角膜表层移植片的研究

目的应用培养的兔羊膜上皮细胞（AECs）体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,探讨利用AECs重建角膜表层的可行性。方法取妊娠晚期新西兰大白兔（27～28孕周）的羊膜,制成AECs单细胞悬液,用含血清和表皮生长因子（EGF）的DMEM／F12培养液培养、传代,利用免疫组织化学单克隆抗体AE1／AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白ck3／12的表达;将体外培养的2～3代兔AECs种植在新鲜兔角膜基质上,利用气-液界面培养法使之复层化,体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,进行光学显微镜和扫描电镜观察,并进行免疫组织化学测定。结果体外培养的兔AECs呈现单克隆抗体AE1／AE3、AE5表达阳性,AECs在新鲜兔角膜基质上能形成形态类似于正常角膜上皮细胞的3～5层复层结构,且复层化后的上皮细胞单克隆抗体AE5表达阳性。结论应用培养的AECs能成功构建类似角膜表层的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,AECs可能成为重建角膜表层的一种新的细胞来源。     

不同移植手术治疗角膜缘干细胞缺损的实验研究

目的探讨以人羊膜为载体培养的角膜缘干细胞，自体及异体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法制作兔眼角膜缘干细胞完全缺损3个月的模型。实验动物随机分为自体移植组和异体移植组，前者取对侧眼角膜缘组织，后者取异体兔眼角膜缘组织，均以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，培养12d后行角膜缘干细胞羊膜移植术。术后观察3个月，以角膜上皮染色、角膜浑浊和新生血管3项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增生，体外培养12d可形成复层。自体移植组和部分异体移植组术后角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS阳性，而移植后转为阴性；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后呈现角膜上皮结构。部分异体移植组术后出现了免疫排斥反应。结论兔自体角膜缘干细胞羊膜移植术可重建眼表；免疫排斥反应仍是异体角膜缘干细胞羊膜移植术失败的主要原因。     

脱细胞角膜基质为支架构建组织工程角膜上皮组织的实验研究

目的 比较氯化钠(NaCl)-十二烷基硫酸钠(SDS)-胰蛋白酶与分散酶(Dispase)-聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)两种角膜组织脱细胞方法的效果,探讨以脱细胞角膜基质为支架构建组织工程化角膜上皮组织的可行性.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,分别用NaCl-SDS-胰蛋白酶和Dispase-Triton-X-100处理兔角膜组织,使用裂隙灯显微镜、光学显微镜及透射电镜观察经两种方法处理后的角膜基质特性和脱细胞效果.以兔角膜缘上皮细胞为种子细胞,Dispase-Triton-X-100处理的猪角膜前弹力层与基质为支架,体外重建兔角膜上皮细胞层,并进行形态学、组织病理学及免疫组织化学检测.结果 两种方法处理过的兔角膜基质大体形态相似,灰白色不透明,水肿明显,质地柔软.组织病理学和超微形态学观察显示两种方法处理的兔角膜基质胶原排列规整,NaCl-SDS-胰蛋白酶处理的角膜组织残留了部分基质细胞碎片,而Dispase-Triton-X-100处理的角膜组织未见基质细胞碎片.兔角膜缘上皮组织块接种于脱细胞猪角膜前弹力层与基质上,24 h角膜上皮细胞开始游出,3～4 d融合呈片状,7～8 d形成单细胞层.组织工程化角膜上皮细胞表达CK3.结论 Dispase-Triton-X-100处理方法的角膜组织脱细胞效果良好.以脱细胞猪角膜前弹力层与基质为支架.可在体外构建组织工程化兔角膜上皮组织.     

角膜基质诱导胚胎干细胞定向分化的初步实验研究

目的:探索角膜基质接触诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES.细胞)定向分化的可能性。方法:分别在去上皮的新西兰白兔表层角膜缘基质上、晶状体上皮细胞饲养层上培养ES-D_3细胞,裸鼠皮下移植使其形成复层细胞,一段时间后,行扫描电镜和光镜观察。结果:I.ES细胞在新鲜表层角膜缘基质上增殖缓慢,2～3周形成较大细胞集落,光镜下细胞形态单一,体积较正常ES细胞大,电镜下细胞核已演变为细长形,移植到裸鼠皮下2周形成上皮样细胞复层,电镜下可见微绒毛,而角膜基质非上皮面的ES细胞仍保持其小细胞状态不变。2.晶状体上皮细胞与ES细胞共培养只能延缓其分化时间,不能诱导其定向分化。结论:表层角膜缘基质具有诱导ES细胞定向分化的潜能,体外培养条件下可能不发生晶状体诱导的第三级胚胎诱导。眼科学报1999;15:195-198。     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

培养角膜缘上皮细胞深低温保存后异体移植实验研究

目的深低温保存培养的角膜缘上皮细胞,复苏后进行异体移植实验,为临床应用提供实验依据。方法将浅层角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存,同时制作兔角膜缘干细胞损伤模型,分别用新鲜培养的角膜缘上皮细胞和冷冻复苏后培养的细胞及角膜基质进行异体移植实验。结果角膜缘上皮细胞能成功地培养于载体上,将培养细胞保存于-196℃的液氮罐中二月,可见深低温保存前后细胞的形态结构及生物学特性无显著差异。异体移植实验显示：新鲜培养的细胞及深低温保存后的细胞异体移植后,模型兔角膜表面逐渐正常上皮化,而角膜基质组异体移植后,角膜表面仍结膜化并可见大量新生血管生长,各项检测结果与培养细胞组相比差异显著（P〈0．05）。结论以浅层角膜基质为载体培养的角膜缘上皮细胞深低温保存后仍具有上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用以进行异体移植治疗角膜缘干细胞缺陷的角膜病。     

组织工程角膜上皮移植治疗兔角膜碱烧伤的形态学观察

目的:探讨组织工程角膜上皮移植治疗角膜碱烧伤的疗效和时机。方法:1mol/LNaOH制作改良兔角膜碱烧伤模型21只42眼,分对照组和移植组,移植组分别在碱烧伤后1,3,6,9d(早)和14d(中)行自体或同种异体组织工程角膜上皮移植术,比较移植组及对照组烧伤后28d内眼表和组织病理学变化。结果:角膜碱烧伤后7d开始出现角膜上皮的大片脱落,14d角膜上皮大片脱落或溃疡发生率达72%,持续至28d,而移植组在28d时发生率仅为25%,大多获得完整的角膜上皮;烧伤后早期移植组角膜基质深层炎性细胞浸润和新生血管生长较对照组明显受到抑制,而中期移植组角膜基质层较对照组并无明显差异;28d内异体组织工程角膜上皮移植的免疫排斥反应并不大于自体移植。结论:自体或同种异体组织工程角膜上皮移植均可尽快恢复眼表完整性,且烧伤后早期移植效果明显优于中期移植。     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究

目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P<0.05,但培养5d后无显著差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。     

诱导人脐带间充质干细胞分化为角膜上皮样细胞的研究

背景眼表疾病导致的角膜盲已成为全球致盲性角膜疾病中的主要原因之一。随着组织工程技术的发展和进步,组织工程角膜为眼表疾病的治疗开辟了新的途径。目的观察体外培养的人脐带间充质干细胞（UC—MSCs）移植到兔角膜基质后的分化发育情况,探讨人UC-MSCs分化为角膜上皮细胞以及治疗兔角膜损伤的可行性。方法获取人脐带组织,采用Ⅳ型胶原酶消化法分离纯化人UC—MSCs并传代,取第3代细胞用于扩增和实验。流式细胞仪检测细胞的免疫表型及诱导成骨分化鉴定。24只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为2个组,将人UC—MSCs接种于去上皮的猪角膜基质上,培养4d后行实验组兔左眼板层角膜移植;对照组以相同的手术方法单纯移植去上皮猪角膜基质。术后对角膜定期行活体激光共焦显微镜检查,并分别于术后2、4、8周摘除各组实验眼行组织病理学和免疫荧光检查,评价移植到兔角膜基质的人UC-MSCs的存活、分化以及移植局部的反应等;应用免疫荧光技术检测移植后角膜上皮细胞中角蛋白3（CK3）、CKl2以及转运蛋白G超家族成员（ABCG2）的表达。结果消化培养的人UC—MSCs呈圆形,细胞胞体较大,贴壁后细胞呈长梭形。培养获得的人UC—MSCs的细胞表型CD105^＋／CD29^＋／CD44^＋／CD34^-／CD45^-,并可诱导分化为成骨细胞。实验组人ISC—MSCs接种到去上皮猪角膜基质后贴附良好、生长迅速,术后植片在植床上存活良好,种植了人UC-MSCs的去上皮猪角膜移植到兔眼,可见实验组受体角膜较对照组透明,未见明显新生血管,在活体共焦显微镜下可见新生的角膜上皮样细胞,未发生免疫排斥反应。免疫荧光检测可见在重建的角膜上皮层检测到CK3及CKl2的阳性表达,而未见ABCG2的表达。结论将种植了人UC—MSCs的猪角膜基质移植到损伤的兔角膜后,人UC—MSCs可以存活、增生并分化为角膜上皮样细胞,可用于修复甚至重建损伤的角膜表层。     

圆锥角膜各期的共焦显微镜表现

目的评价共焦显微镜在圆锥角膜临床研究中的应用价值。方法应用共焦显微镜观察圆锥角膜患者32例（48眼）及正常对照组17例（28眼），分别比较早、中、晚期圆锥角膜与正常对照组的图像特点。结果早期圆锥角膜出现激活状态的角膜细胞、浅基质层的细小皱褶、深基质层的暗纹、部分内皮细胞异形性明显，中、晚期圆锥角膜出现角膜上皮细胞拉伸、细胞核皱缩；基质细胞排列紊乱、基质层暗纹；而对照组未发现上述表现。各期圆锥角膜的角膜基质层厚度、不同深度角膜基质细胞密度、内皮细胞密度与对照组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论共焦显微镜对早期圆锥角膜的发现以及圆锥角膜病理发展的研究具有重要的临床价值。     

Transplantation of tissue-engineered human corneal epithelium in limbal stem cell deficiency rabbit models

AIM: To evaluate the biological functions of tissue-engineered human corneal epithelium (TE-HCEP) by corneal transplantation in limbal stem cell deficiency (LSCD) rabbit models. METHODS: TE-HCEPs were reconstructed with DiI-labeled untransfected HCEP cells and denuded amniotic membrane (dAM) in air-liquid interface culture, and their morphology and structure were characterized by hematoxylin-eosin (HE) staining of paraffin-sections, immunohistochemistry and electron microscopy. LSCD models were established by mechanical and alcohol treatment of the left eyes of New Zealand white rabbits, and their eyes were transplanted with TE-HCEPs with dAM surface outside by lamellar keratoplasty (LKP). Corneal transparency, neovascularization, thickness, and epithelial integrality of both traumatic and post transplantation eyes were checked once a week by slit-lamp corneal microscopy, a corneal pachymeter, and periodic acid-Schiff (PAS) staining. At day 120 post surgery, the rabbits in each group were sacrificed and their corneas were examined by DiI label observation, HE staining, immunohistochemistry and electron microscopy. RESULTS: After cultured for 5 days on dAM, HCEP cells, maintaining keratin 3 expression, reconstructed a 6-7 layer TE-HCEP with normal morphology and structure. The traumatic rabbit corneas, entirely opaque, conjunctivalized and with invaded blood vessels, were used as LSCD models for TE-HCEP transplantation. After transplantation, obvious edema was not found in TE-HCEP-transplanted corneas which became more and more transparent, the invaded blood vessels reduced gradually throughout the monitoring period. The corneas decreased to normal thickness on day 25, while those of dAM eyes were over 575μm in thickness during the monitoring period. A 4-5 layer of epithelium consisting of TE-HCEP originated cells attached tightly to the anterior surface of stroma was reconstructed 120 days after TE-HCEP transplantation, which was similar to the normal control eye in morphology and structure. In contrast, intense corneal edema, turbid, invaded blood vessels were found in dAM eyes, and no multilayer epithelium was found but only a few scattered conjunctiva-like cells appeared. CONCLUSION: The TE-HCEP, with similar morphology and structure to those of innate HCEP, could reconstruct a multilayer corneal epithelium with normal functions in restoring corneal transparency and thickness of LSCD rabbits after transplantation. It may be a promising HCEP equivalent for clinical therapy of corneal epithelial disorders.