小鼠Egr-1启动子的克隆及其辐射诱导特性的研究

目的：扩增Egr-1启动子并构建Egr-PGL重组质粒,探讨不同剂量X射线诱导被转染的NIH3T3细胞荧光素酶表达活性。方法：并利用PCR方法扩增Egr-1p与PGL3-E表达载体连接,用发光仪测定荧光素酶与底物反应的发光值,分析X射线诱导荧光素酶表达。结果：对PCR产物进行测序,序列基本正确;电泳检测重组质粒,有正确的特异性片段;重组质粒转染小鼠NIH3T3细胞鉴定Egr-1p的辐射调节特性,发现照射组发光值均高于假照组,75mGy照射组的表达量约为假照组的5倍,2、4、6、8和10Gy照射组的表达量分别约为假照组的5～7．5倍。结论：扩增得到的Egr-1启动子在不同剂量X射线照射下均具有诱导下游基因表达增强作用;低剂量照射诱导Egr-1启动子下游基因表达增强作用的发现可能在肿瘤基因治疗中更具有实用价值。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的 :克隆小鼠血管抑素 (Angiostatin)cDNA ,构建其真核表达载体pCMV -Angiostatin重组质粒 ,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法 :根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列 ,用RT -PCR方法从鼠肝脏中扩增出AngiostatincDNA ,连接 pMD18T载体测序 ,经测序证实后 ,通过中间载体 pKS ,构建pCMV -Angiostatin重组质粒。结果 :测序表明扩增的AngiostatincDNA序列与报道基本一致 ,AngiostatincDNA正确插入表达载体。 结论 :成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建     

人内皮抑素基因的克隆及其表达产物抗肿瘤活性

目的：克隆人内皮抑素（endostatin)基因并对其表达产物进行抗肿瘤活性研究。方法：从人肝cDNA文库中获得人endostatin基因，构建人载体PET15b，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，将表达产物（rhEndostatin)纯化后应用于小鼠Lewis肺癌治疗，并通过鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验。观察rhEndostatin的血管抑制作用。结果：rhEndostatin可抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成，明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长。结论：rhEndostatin具有抗肿瘤活性。且此活性可能与其抑制肿瘤新生血管形成有关。     

小鼠 Egr-1启动子的克隆及其辐射诱导特性的研究

目的 :扩增 Egr- 1启动子并构建 Egr- PGL重组质粒 ,探讨不同剂量 X射线诱导被转染的NIH3T3细胞荧光素酶表达活性。方法 :利用 PCR方法扩增 Egr- 1p与 PGL3- E表达载体连接 ,用发光仪测定荧光素酶与底物反应的发光值 ,分析 X射线诱导荧光素酶表达。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确 ;电泳检测重组质粒 ,有正确的特异性片段 ;重组质粒转染小鼠 NIH3T3细胞鉴定 Egr- 1p的辐射调节特性 ,发现照射组发光值均高于假照组 ,75m Gy照射组的表达量约为假照组的 5倍 ,2、4、6、8和 10 Gy照射组的表达量分别约为假照组的 5～ 7.5倍。结论 :扩增得到的 Egr- 1启动子在不同剂量 X射线照射下均具有诱导下游基因表达增强作用 ;低剂量照射诱导 Egr- 1启动子下游基因表达增强作用的发现可能在肿瘤基因治疗中更具有实用价值。     

缺氧对Egr-1启动子辐射诱导活性的影响及机制的初步探讨

目的　探明缺氧对早期生长反应基因 1(earlygrowthresponsegene 1,Egr 1)启动子辐射诱导活性的影响及机制。方法　利用基因重组构建Egr 1启动子调控的荧光素酶报告质粒 ,脂质体介导转染肺癌A5 49细胞 ,在 0 .1%、0 .5 %、1%、2 .5 %、5 %等氧浓度下给转染细胞以 2、4、6、8、10Gyγ 线照射 ,观察照射后荧光素酶表达水平及过氧化氢产量变化 ;观察过氧化氢浓度对Egr 1启动子转录活性的影响。结果　成功构建了Egr 1启动子报告载体 ,转染A5 49细胞 ,发现当氧浓度 <2 .5 %时 ,Egr 1启动子活性明显低于常氧对照组 (P <0 .0 1) ,并随氧浓度的下降而降低。照射后的过氧化氢产量呈现类似的变化特征 ,结果还表明Egr 1启动子的活性与过氧化氢浓度密切相关。结论　缺氧 (O2 <2 .5 % )导致Egr 1启动子辐射诱导活性下降 ,可能与氧自由基产量减少有关。     

辐射诱导人TRAIL和内皮抑素双基因共表达载体的构建及鉴定

目的：构建辐射敏感Egr-1启动子诱导分泌型人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和内皮抑素（endostatin）双基因共表达的载体pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES。方法：利用聚合酶链式反应（PCR）方法从pMD19T-endostatin载体上扩增得到分泌型endostatin基因,并连接到pMD19T载体上进行测序,然后利用基因重组技术构建Egr-1启动子转录调控分泌型TRAIL和endostatin双基因表达的重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES。结果：PCR扩增出的650 bp片段经测序证实其序列与预期一致,说明获得的分泌型人endostatin基因正确;对pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES及其构建过程中涉及到的多种中间载体进行PCR和酶切鉴定,结果均与预期完全一致,证实含有辐射敏感Egr-1启动子的分泌型TRAIL和endostatin双基因共表达重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES构建正确。结论：成功构建了辐射诱导表达的双基因共表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES,为探讨TRAIL和endostatin双基因-放射治疗的抗肿瘤作用及其机制奠定了实验基础。     

pshuttle-Egr-1-hSmac质粒联合X线照射对乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的抑制作用

目的:构建pshuttle-Egr-1-hSmac质粒并转染人乳腺癌MDA-MB-435细胞,观察其抑制肿瘤细胞的辐射增敏作用。方法：转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒的MDA-MB-435细胞经过2 Gy X线照射不同时间（4、8、12、24 和48 h）和0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h收集细胞,采用RT-PCR和Western blotting法检测Smac mRNA及其蛋白表达。将细胞分为对照组、pshuttle质粒组、pshuttle-Egr-1-hSmac 质粒组、2 Gy 组、pshuttle+2.0 Gy组 和pshuttle-Egr-1-hSmac+ 2.0 Gy组,MTT法检测各组细胞增殖;克隆形成实验检测细胞存活能力;Annexin Ⅴ-FITC双染法检测细胞凋亡;PI单染法检测细胞周期。结果:对照组和pshuttle质粒组MDA-MB-435细胞中Smac mRNA无表达,而pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随时间延长逐渐升高,于24和48 h时表达水平最高;经0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随照射剂量增加而逐渐增加,在2.0和5.0 Gy X线照射后Smac mRNA表达水平最高。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组4、8、12和24 h后Smac蛋白表达水平逐渐升高,24 h后表达水平最高。经过0、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy X线照射后24 h Smac蛋白表达水平逐渐升高,尤其以5.0 Gy X线照射时表达水平最高。MTT法检测时程效应,2.0 Gy、pshuttle+2.0 Gy和pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy质粒组24、48和72 h细胞A490值明显低于对照组（P<0.01）;剂量效应,pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组1.0～5.0 Gy X线照射后,MDA-MB-435细胞A490值明显低于0 Gy X线照射(P<0.05或P<0.01)。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组细胞存活分数明显低于对照组（P<0.01）。pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy组细胞凋亡率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）,G0/G1期和S期细胞百分率明显低于2.0 Gy照射组（P<0.01）,G2/M期细胞百分率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）。结论：X线照射能增加pshuttle-Egr-1-hSmac质粒转染的MDA-MB-435细胞有效表达Smac mRNA及蛋白,能抑制细胞存活,且诱导G2/M期阻滞和凋亡增加;Smac基因联合放射治疗可明显增加乳腺癌细胞的放射敏感性。     

小鼠干扰素γ基因克隆、测序及辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ的构建

目的：克隆小鼠干扰素γ（IFN-γ）编码区cDNA序列并构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。 方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法,以小鼠脾细胞mRNA为模板,扩增获得全长IFNγcDNA,与pGEMT载体连接做全自动测序,并利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。 结果：经测序证实获得的小鼠IFNγ cDNA序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。结论：成功克隆了小鼠IFNγ的cDNA序列,构建了辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。     

介导人血红素加氧酶-1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建含人血红素加氧酶-1(HO-1)基因的重组pcDNA3.1质粒并进行鉴定.方法:利用分子生物学技术,从人肝脏标本中提取出RNA,进行RT-PCR后,做TA克隆,成功获得pMD/19-HO-1质粒,采用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ从pMD/19-HO-1质粒中将目的基因片段切出,克隆到质粒pcDNA3.1的相应酶切位点中,构建重组质粒pcDNA3.1-HO-1,采用限制性酶切、DNA测序鉴定,将构建好的质粒瞬时转染ECV304细胞株,Western blot测定HO-1表达.结果:酶切、测序鉴定证实插入位点及方向与预期完全一致,测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致,瞬时转染细胞后HO-1蛋白表达明显增高.结论:成功构建了含人血红素加氧酶-1基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在糖尿病血管并发症中的作用奠定基础.     

FUS1基因原核表达质粒构建与诱导表达

目的 构建FUS1基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta(DE3)2 plys]中高效表达重组蛋白.方法 采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入pET-32a( ),经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta(DE3)2 plys细菌,并用IPTG诱导表达.结果 经过PCR、测序鉴定,克隆了pET32a( )-FUS1重组子;在低浓度IPTG(25μmol/L)诱导3 h,Rosetta DE3可以高效地表达重组蛋白,约占细菌总蛋白的40%.结论 成功地克隆到FUS1基因,并使其在原核系统中高效表达.     

电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响

目的 研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子，CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达。方法 利用CMV启动子，EGR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP,pcDNA3-EGR-GFP重组质粒，经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株，对脂质体转染条件进行优化，在最佳转染条件下，分别给予不同浓度H2O2，不同剂量γ射线处理转染细胞，用荧光显微镜，流式细胞仪（FAC）检测GFP的表达情况。结果 FACS检测显示氧自由基，电离辐射可诱导FGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达。而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达。结论 EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性。     

电离辐射诱导microRNA改变及其对放射性脑病的影响

放射性脑病(REP)主要发生在恶性头颈部肿瘤、动静脉畸形、肺癌脑转移等疾病患者接受放射治疗后,具有早期诊断难、预后不良且不可逆转的特点。然而,REP的发病机制尚未明晰。尽管针对不同个体采用了多种治疗策略,但其疗效并不理想。若能寻求一组可早期诊断REP的生物学标志物,可以为防治REP提供新途径。最新研究表明,微RNA(miRNA)在电离辐射后表达异常是引起REP的重要机制之一,涉及辐射敏感性及辐射旁效应。研究miRNA将为早期检测预防REP提供新策略。     

Identification of Two Novel Mitochondrial DNA Deletions Induced by Ionizing Radiation

ObjectiveWe identify ionizing radiation-induced mitochondrial DNA (mtDNA) deletions in human lymphocytes and their distribution in normal populations.MethodsLong-range polymerase chain reactions (PCR) using two pairs of primers specific for the human mitochondrial genome were used to analyze the lymphoblastoid cell line following exposure to 10 Gy ⁶⁰Co γ-rays. Limited-condition PCR, cloning and sequencing techniques were applied to verify the mtDNA deletions detected with long-range PCR. Human peripheral blood samples were irradiated with 0, 2 and 6 Gy ⁶⁰Co γ-rays, and real-time PCR analysis was performed to validate the mtDNA deletions. In order to know the distribution of mtDNA deletions in normal population, 222 healthy Chinese adults were also investigated.ResultsTwo mtDNA deletions, a 7455-bp deletion (nt475-nt7929 in heavy strand) and a 9225-bp deletion (nt7714 -nt369 in heavy strand), occurring between two 8-bp direct repeats, were identified in lymphoblastoid cells using long-range PCR, limited-condition PCR and sequencing. These results were also observed for ⁶⁰Co γ-rays irradiated human peripheral blood cells.ConclusionTwo novel mtDNA deletions, a 7455-bp deletion and a 9225-bp deletion, were induced by ionizing radiation. The rate of the mtDNA deletions within a normal population was related to the donors' age, but was independent of gender.     

Effect of Ionizing Radiation on the Expression of p16, CyclinDI and CDK4 in Mouse Thymocytes and Splenocytes

Objective To investigate the effect of ionizing radiation on the expression of p16, CyclinDl, and CDK4 in mouse thymocytes and splenocytes. Methods Fluorescent staining and flow cytometry analysis were employed for the measurement of protein expression. Results In time course experiments, it was found that the expression of p16 protein was significantly increased at 8, 24, and 48 h for thymocytes (P<0.05, P<0.01, and P<0.05, respectively) and at 24 h for splenocytes (P<0.05) after whole body irradiation (WBI) with 2.0 Gy X-rays. However, the expression of CDK4 protein was significantly decreased from 8 h to 24 h for thymocytes (P<0.05,P<0.01) and from 8 h to 72 h for splenocytes (P<0.05-P<0.01). In dose effect experiments, it was found that the expression of p16 protein in thymocytes and splenocytes was significantly increased at 24 h after WBI with 1.0, 2.0, and 4.0 Gy (P<0.05-P<0.01), whereas the expression of CDK4 protein was significantly decreased with 2.0Gy for thymocytes (P<0.05) and 0.5-6.0 Gy f     

Anti-tumor Effects of pNEgr-mlL-12 Recombinant Piasmid Induced by X-irradiation and Its Mechanisms

Objective To study the effect of gene radiotherapy combining injection of recombinant plasmid pNEgr-mIL-12 with local X-irradiation on cancer growth and to elucidate the mechanisms of tumor inhibition. Methods Alkaline lysis was used to extract the plasmid and polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) was applied for further purification of plasmids. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression of IL-12 protein. C57BL/6J mice were subcutaneously inoculated with B16 melanoma cells and the plasmid was injected directly into the tumor. Gene-radiotherapy combining pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid with X-irradiation was given three times to C57BL/6J mice bearing B16 melanoma. Changes in immunologic parameters of tumor-bearing mice were detected with relevant immunologic assays. Results Results showed a significant decrease in tumor growth rate (P<0.05-0.001) after 3 times of gene-radiotherapy with IL-12 and X-irradiation. Immunologic studies showed a significant increase in CTL and N     

Egr—1在乳腺良性病变和癌组织中的表达

目的 探讨早期生长反应基因（Ｅｇｒ－１）在乳腺良性病变和癌组织中的表达及其与乳 癌的临床理联系，方法 用免疫组织化学法７５例乳腺病变组织进行Ｅｇｒ－１检测，观察乳腺良性病变和乳腺癌的表达情况，并比较其阳性率，结果：乳腺良性病变可见相对高水平的Ｅｇｒ－１表达，而乳腺癌Ｅｇｒ－１阳性仅１９例（４２．２％），Ｅｇｒ－１表达与乳腺癌的组织学类型和淋巴结转移有关（Ｐ〈０．０５）。结论：Ｅｇｒ－１表达的减少或     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

小鼠白细胞介素-18高效真核分泌表达载体的构建及活性测定

目的克隆小鼠白细胞介素-18（mIL-18）基因，构建重组表达质粒，在结肠癌中表达重组小鼠白细胞介素-18（mIL-18），并对其生物学活性进行初步鉴定。方法利用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞（Mψ）扩增出成熟肽编码区cDNA（474bp），克隆到表达载体pSecTag2B（含有分泌信号肽Igc）中；然后转染成纤维细胞，培养上清用小鼠的IL-18 ELISA试剂盒检测分泌有活性的mIL-18。结果构建的pSecTag2B-mIL-18可在成纤维细胞中分泌表达，mIL-18可诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ。结论成功构建pSecTag2B—mIL-18表达载体，表达的IL-18刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ。     

抗肿瘤的人重组内皮抑素基因的克隆及表达

目的 克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白重组人内皮抑素(human endosbtatin,HES)。方法 从人胎盘组织中分离总RNA,用RT-PCR法扩增出570bp的DNA片段,经序列测定证实为内皮抑素基因,并成功地克隆到pUC18质粒载体中,用Xpress系统体外表达出内皮抑素蛋白并纯化成功。结果 克隆的HEScDNA其序列和国外报道一致;构建了重组HES融合蛋白表达菌株,经SDS-PAGE等分析,表达目的蛋白达细菌总蛋白的40％以上。结论 通过HES基因克隆和表达的研究与探讨,得到了HES的基因克隆和高效表达菌株,为内皮抑素在临床治疗恶性肿瘤奠定了基础。