山莨菪碱对创伤性肺损伤防治作用的实验研究

目的探讨山莨菪碱（６５４－２）对创伤性急性肺损伤（ＡＬＩ）的防止作用及其可能的机制。方法观察６５４－２对创伤性ＡＬＩ兔血浆和支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）和白介素８（ＩＬ－８）含量的影响，同时进行组织病理学的光镜和电镜检查，并用原位杂交法检测肺和其他脏器组织中ＴＮＦ－α和ＩＬ－８的ｍＲＮＡ表达。结果致伤前、后给予６５４－２，可使创伤性ＡＬＩ兔血浆及ＢＡＬＦ中的ＴＮＦ－α、ＩＬ－８明显减少、肺组织损伤程度减轻；ＴＮＦ－αｍＲＮＡ和ＩＬ－８ｍＲＮＡ的基因表达主要定位在内脏组织中的Ｍ、ＰＭＮ和血管内皮细胞（ＶＥＣ）内，表达数量明显减少。。结论６５４－２可降低血浆及ＢＡＬＦ中ＴＮＦ－α、ＩＬ－８的含量，使ＴＮＦαｍＲＮＡ和ＩＬ－８ｍＲＮＡ的基因表达下调，从而减轻或在一定程度上防止创伤性ＡＬＩ的发生和发展     

肠缺血-再灌流大鼠不同组织TNFα和IL-6 mRNA表达的规律及意义

观察大鼠肠缺血－再灌流过程中小肠,肝,肺组织ＴＮＦα和ＩＬ－６ｍＲＮＡ表达的规律,发现肠缺血１ｈ小肠ＴＮＦα和ＩＬ－６ｍＲＮＡ表达开始增加,再灌流后０．５－１ｈ表达至峰值,并且与组织及血浆中蛋白水平变化趋势一致;与小肠相比,肝,肺组织ＴＮＦα和ＩＬ－６ｍＲＮＡ表达升高的时相晚,且与血浆ＴＮＦα浓度变化不一致。     

失血性休克时重要器官组织内某些细胞因子表达,释放及其作用探讨

目的：探讨休克后重要器官内几种主要细胞因子的变化规律、产生机制及其作用．方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等方法观察失血性休克时肝、肺、肾、肠组织内ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６ｍＲＮＡ表达，ＴＮＦα释放，器官功能损害及内毒素组织移位等变化．结果：（１）失血性休克及复苏后，组织内ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６ｍＲＮＡ可相继表达增加，以ＴＮＦα表达最早，ＩＬ－６虽表达较晚，但持续时间较长；（２）休克及复苏后，肝、肺、肾组织及循环内ＴＮＦα水平均有不同程度升高，其中组织内ＴＮＦα水平在数量和持续时间上大于循环内ＴＮＦα水平；（３）失血性休克时肝、肺、肾功能均有不同程度受损；（４）休克后肝、肺、肾组织内毒素水平先后明显升高，且与休克后组织内细胞因子基因表达、ＴＮＦα释放有一定内在联系．结论：休克后组织内细胞因子表达、释放在局部器官损害中起一定作用，其产生与休克后内毒素的组织移位有关．     

大鼠油酸肺损伤早期肺组织一氧化氮合成酶活性变化、基因表达及其细胞定位

目的观察油酸肺损伤早期肺组织一氧化氮合成酶（ＮＯＳ）活性变化、诱导型一氧化氮合成酶（ｉＮＯＳ）基因表达变化及其细胞定位。方法３Ｈ－胍氨酸测定法测定ＮＯＳ活性；应用３２Ｐ标记核酸探针狭线杂交技术和地高辛标记核酸探针原位杂交技术检测油酸肺损伤大鼠肺组织。结果正常肺组织ＮＯＳ活性很低且无ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达；急性肺损伤后ｉＮＯＳ活性升高且与ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达相一致；硝基左旋精氨酸（ＬＮＮＡ）可抑制ｉＮＯＳ活性并下调ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达；伤后表达ｉＮＯＳｍＲＮＡ的阳性细胞可能为肺泡巨噬细胞、粒细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、平滑肌细胞、内皮细胞。结论急性肺损伤后肺组织ｉＮＯＳｍＲＮＡ的表达是一个突然启动的主动合成过程；ＬＮＮＡ抑制ＮＯ产生可能与其下调ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达有关；肺组织表达ｉＮＯＳｍＲＮＡ阳性细胞的多样性可能与ＮＯ损伤肺组织的复杂性有关。     

严重烧伤后内皮细胞损伤及其在早期脏器损害发病中的作用

３０％Ⅲ度烧伤兔伤后血浆渗透压下降，ＣＥＣ及ＡＣＥ活性升高，血管内皮细胞明显形态学改变，表明伤后内皮细胞受损。缺氧、烧伤血清、ＴＮＦ、内毒素、ＦＰＡＢ及活化粒细胞能损伤培养的人脐静脉内皮细胞。３０％Ⅲ度烧伤大鼠伤后血浆ＥＴ－１明显增多，ＥＴ－１、ＥＴＡ、ＥＴＢ、ｍＲＮＡ于心肺肝肾的表达，于伤后斑点杂交与原位杂交的结果，均表明其明显增强。烧伤内皮素增加，不但使血管收缩，而且增加内皮细胞透性。采用细胞     

大鼠液压脑损伤后BDNF mRNA原位杂交组织化学表达的变化

目的研究大鼠液压脑损伤后脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）ｍＲＮＡ原位杂交组织化学表达的变化规律。方法采用核酸原位杂交免疫组织化学技术（ＩＳＨＨ）检测大鼠轻、中度脑损伤大脑皮层和海马ＢＤＮＦｍＲＮＡ表达的动态变化。结果伤后皮层局灶周围、海马ＢＤＮＦｍＲＮＡ表达皆有增加，分别于伤后２、４小时达高峰，海马中以ＣＡ２区增加最明显，中度损伤时表达增加的幅度比轻度损伤时大。结论脑损伤后脑皮层和海马ＢＤＮＦｍＲＮＡ表达增加，提示机体对颅脑损伤存在自身保护机制     

内毒素致肺血管内皮细胞粘附中性粒细胞增加的机理研究

目的：为观察内毒素性急性肺损伤肺血管内皮细胞（ＶＥＣ）内皮细胞白细胞粘附分子－１（ＥＬＡＭ－１）和细胞间粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）转录水平的表达规律。方法：应用地高辛标记的ｃＲＮＡ探针原位杂交技术，检测内毒素急性肺损伤大鼠肺组织。结果：内毒素致伤后，肺小静脉、微静脉及毛细血管ＶＥＣ首先出现ＥＬＡＭ－１ｍＲＮＡ的表达，高峰在给毒后３～６小时之间，其后逐渐减弱，２４小时内基本消失，而肺ＶＥＣ在轻微背景表达基础上呈现ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ的表达增加是继ＥＬＡＭ－１ｍＲＮＡ的表达之后，增强高峰在１２～２４小时之间，其表达维持时间较长，２４小时仍无减弱倾向。结论：肺血管床ＶＥＣ这种ＥＬＡＭ－１和ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ的相继表达提示了内毒素性急性肺损伤肺血管床扣压大量中性粒细胞（ＰＭＮ）并进而导致肺组织损伤过程的重要分子基础。     

烧冲复合伤早期细胞间粘附分子—1的表达变化及意义

目的：了解烧冲复合伤早期肺组织细胞间粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达变化规律及其与多形核白细胞（ＰＭＮ）在肺内聚集的关系．方法：测定肺组织髓过氧化物酶（ＭＰＯ）以反映ＰＭＮ肺内聚集的情况；用地高辛标记ＩＣＡＭ－１ｃＤＮＡ探针进行肺组织原位杂交；用ＳＰ法进行肺组织ＩＣＡＭ－１免疫组化染色．结果：各致伤组动物伤后均有不同程度的肺组织ＭＰＯ活性增高，其中以复合伤组最明显，肺组织ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ及其蛋白质表达均较对照组显著增多，以伤后６小时最为明显．结论：烧冲复合伤早期肺ＩＣＡＭ－１增多可能与ＰＭＮ的肺内聚集有关．     

创伤内毒素血症与肿瘤坏死因子新蝶呤产生的关系及其意义

从动物实验和临床观察两个方面，对肠源性内毒素血症与肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、新蝶呤的相互关系及其在创伤后脓毒症发病中的作用进行了探讨。动物实验发现，失血性休克、烧伤早期门、体循环血浆内毒素水平即显著升高，其变化趋势与血中ＴＮＦ、肝组织ＴＮＦｍＲＮＡ表达一致，但峰值早于ＴＮＦ。应用多粘菌素Ｂ、抗核心脂多糖抗体及选择性肠道脱污染等内毒素血症防治措施后，可显著抑制血中ＴＮＦ水平及其ｍＲＮＡ表达峰值，血清生物蝶呤含量亦明显下降。临床资料显示，严重烧伤和创伤病人２４ｈ内血浆内毒素含量即显著上升，其升高程度与ＴＮＦ呈正相关，这一趋势以并发脓毒症者尤为明显。与之相似，内毒素血症组病人新蝶呤含量烧伤２～３周呈进行性升高，而非内毒素血症则趋于下降。作者认为，创伤后肠源性内毒素血症能激发体内炎性介质产生、释放，从而可能促进脓毒症的发病过程。     

截肢伤小鼠巨噬细胞对T细胞的直接接触抑制作用

利用小鼠截肢伤模型，观察创伤小鼠巨噬细胞对Ｔ细胞的直接接触抑制作用。结果显示：以２５μｇ／ｍｌ的丝裂霉素Ｃ处理巨噬细胞３０ｍｉｎ，可阻断巨噬细胞白介素１（ＩＬ－１）、白介素６（ＩＬ－６）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）及前列腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）的合成与分泌。创伤小鼠巨噬细胞经丝裂霉素Ｃ处理后，可明显抑制正常Ｔ淋巴细胞转化活性、白介素２（ＩＬ－２）ｍＲＮＡ及ＩＬ－２受体（ＩＬ－２Ｒα）ｍＲＮＡ水平、ＩＬ－２     

烧伤早期肺细胞间粘附分子—1的变化及意义

检测了肺组织及支气管肺泡灌洗液（BALF）中的髓过氧化酶（MPO）含量，免疫组化及原位杂交法检测了肺组织ICAM-1蛋白及其mRNA的表达，流式细胞术检测外周血PMN的CD11b/CD18表达，以了解ICAM-1在烧伤早期PMN肺内聚集过程中的作用。结果显示伤后2、6、12、24h烧伤组动物肺组织及BALF中MPO含量显著高于对照组，肺组织ICAM-1及其mRNA均表达增多，外周血PMN表面CD11b/CD18表达增多，提示烧伤早期肺内PMN的聚集很可能与烧伤早期肺血管内皮表达ICAM-1及表达CD11b/CD18增多有关。     

核因子-κB在兔急性肺损伤中的作用

 目的 探讨核因子-κB(NF-κB)在失血性休克复合内毒素打击致急性肺损伤(ALI)兔发病中的作用.方法 失血性休克复合内毒素打击法复制ALI兔模型.制模成功后1 h、4 h、8 h、24 h、48 h检测动脉血氧分压(PaO2)、肺干重/湿重比值(D/W),双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度,免疫组织化学的方法结合图像分析观察肺组织内NF-κB的变化情况,行肺组织病理学检查.结果 与对照组相比,失血性休克复合内毒素打击使动物PaO2及D/W值进行性下降,于48 h降至最低(P<0.01);血清TNF-α含量及肺组织NF-κBp65的含量升高,并均于4 h达到最高峰(P<0.01);相关分析显示1 h、4 h、8 h、24 h、48 h NF-κB活性与TNF-α含量之间的变化存在显著相关性(P<0.01).肺组织病理显示肺泡壁增厚、炎性细胞浸润、局灶出血、部分肺泡萎陷.结论 NF-κB的活化,介导TNF-α等炎症介质的大量表达,在失血性休克复合内毒素打击导致ALI的病理机制中发挥重要作用.     

烧伤后大鼠骨骼肌组织泛素及泛素化蛋白表达的变化研究

为研究烧伤大鼠骼肌组织泛素（ubiquitin)及泛素化蛋白表达的变化规律，探讨烧伤后骨骼肌蛋白降解的分子机制，采用大鼠30％Ⅲ度烫伤模型，分为伤后2、6、12和24h组，每组设正常对照组，于伤后不同时间点分别测定大鼠骨骼肌孵育液中伸趾长肌蛋白降解率以及伸趾长肌组织中泛素及泛素化蛋白的表达变化。结果发现，大鼠烧伤后伸趾长肌蛋白降解率增强，尤其是肌纤维蛋白降解增强明显（P＜0．01），伤后12h增加185％，24h增加153％；伸趾长肌泛素及泛素化蛋白的表达在烧伤后各时相点均显著增加（P＜0.01)，尤以12h和24h为明显，表达增加的泛素化蛋白主要为高分子量蛋白。提示烧伤后大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢与泛素及泛素化蛋白的高表达关系密切。     

烧伤血清和痂下水肿液对中性粒细胞凋亡的影响

为了解严重烧伤后中性粒细胞（PMN）凋亡情况及烧伤血清和痂下水肿液（STF）对中性粒细胞凋亡的影响。将24只健康大鼠随机分为烫伤组（30%Ⅲ度烫伤）和对照组,分离伤后0、12、24hPMN,继续培养16h,碘化丙啶（propdiium oddide,PI)染色,流式细胞仪检测凋亡百分率,并用烧伤血清和痂下水肿液分别刺激对照组大鼠PMN,检测凋亡百分率,结果发现：烫伤组大鼠PMN凋亡百分率较对照组大鼠降低,烧伤血清和痂下水肿液均抑制PMN凋亡并呈剂量依赖关系。说明严重烧伤后PMN凋亡延迟,烧伤血清和痂下水肿液在其中可能起重要作用。     

Toll样受体5在鞭毛蛋白致大鼠急性肺损伤中的表达研究

目的检测鞭毛蛋白诱导急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织中Toll样受体5（TLR5）mRNA的表达变化,初步探讨TLR5在鞭毛蛋白致大鼠Au中的作用。方法从大肠杆菌ATCC25922中分离纯化鞭毛蛋白并鉴定。108只SD大鼠随机分为正常对照组（n=36）、致伤1组（n=36）和致伤2组（n=36）。经尾静脉注射鞭毛蛋白以建立大鼠ALI模型。每组分别在6个时相点用原位杂交法检测大鼠肺组织中TLR5 mRNA的表达,并观察动脉血气分析和肺病理改变。结果从大肠杆菌ATCC25922中成功分离纯化出鞭毛蛋白,其分子量约65kD。静脉注射鞭毛蛋白成功建立了大鼠急性肺损伤模型。从致伤后1h开始,鞭毛蛋白致肺损伤大鼠肺组织中TLR5 mRNA表达增加,并随时间推移和鞭毛蛋白剂量增加而表达增多。各致伤组大鼠动脉血氧分压降低,肺组织出现肺间质、肺泡水肿和炎性细胞浸润等病理改变。结论静脉注射鞭毛蛋白可导致大鼠ALI;TLR5作为细胞膜上鞭毛蛋白的受体参与了鞭毛蛋白致大鼠急性肺损伤的作用过程。     

大鼠角膜缘上皮细胞的体外培养以及碱烧伤后β-连环蛋白表达的实验研究

目的探讨角膜缘上皮细胞的体外培养以及碱烧伤后β-连环蛋白(β-catenin)的表达规律。方法消化法培养大鼠角膜缘上皮细胞,并对其生物学特征[细胞形态、泛角质蛋白抗体(AE1/AE3)和细胞核增殖抗原(PCNA)]做初步鉴定;构建体外碱烧伤模型,利用实时定量聚合酶链反应和免疫荧光技术检测伤后各时相点β-catenin的表达。结果体外培养的角膜缘上皮细胞具典型的上皮细胞特点,大部分细胞分化程度较低且生活状态良好;核酸和蛋白水平均显示,伤后24小时β-catenin的表达有显著升高(P0.05),至伤后48小时达到峰值(P0.01)。结论在一定程度上可以利用角膜缘上皮细胞的研究结果来近似反映角膜干细胞的特点;Wnt经典信号途径参与了碱烧伤后的细胞修复过程。     

严重烧伤后早期大鼠肾脏细胞粘附分子1和白介素6的表达

目的:观察严重烧伤早期大鼠肾脏细胞粘附分子l(Intercellulal adhesion molecule-1,ICAM-1)、白细胞介素6(Interleukin 6,IL-6)在不同时间点的表达及早期病理变化,为阐明伤后早期肾脏损伤机制及为伤后早期损伤的防治打下基础。方法:①光镜和电镜观察大鼠在烧伤后早期(5min至72h)肾脏的病理变化;②免疫组织化学、原位杂交和图像分析技术对伤后不同时间点肾脏ICAM-1进行染色和分析;③免疫组织化学、原位杂交和图像分析技术对伤后不同时间点肾脏IL-6进行染色和分析。结果:①伤后早期主要病理变化为出血、充血和水肿;电镜显示:肾脏毛细血管内皮细胞受损;②伤后30min,免疫组化和原位杂交显示ICAM-1、IL-6表达增强,伤后2-24h明显增强,呈阳性或强阳性;伤后 72h,表达逐渐减弱。结论:伤后早期肾脏的损伤可能与内皮细胞损伤有关,ICAM-1、IL-6在伤后早期肾脏损害机制中占有重要地位。