人类环加氧酶-2的cDNA

作者通过RT-PCR和引物延伸PCR得到了全长的人类环加氧酶-2(hcox-2)的cDNA,所推测的hcox-2多肽氨基酸顺序与hcox-1蛋白的氨基酸顺序有61％同源,而与鸡、鼠cox-2基因所编码的多肽分别有81％和88％同源。作者又将hcox-1、hcox-2cDNA的 DRFs亚克隆在真核表达载体pcDNA中,所得到的相应mRNA在~(35)S-甲硫氨酸兔网织红细胞裂解物中进行翻译,合成了70kD的多肽。然后分别把hcox-1和hcox-2 cDNA转染到COS细胞中,它们都表达了环加氧酶活性。这些资料表明hcox-2cDNA能够产生有酶活性的环加氧酶。作者进一步     

白血病染色体12p13上p27~(kipl)基因的作用及其分析

本研究旨在测定p27基因的突变与人类肿瘤的发生是否相关。采用大鼠p27 DNA探针,鉴定一个与鼠p27基因同源的序列,该cDNA含有一个594个核苷酸组成的开读框架,可编码198个氨基酸的蛋白质。使用cDNA序列的引物PCR筛选出含有完整p27编码区的两个p1克隆。对p1克隆的分析表明,该基因由2个内含子组成,一个位于编码区内,     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

IL-13是一种新的能调节炎症反应及免疫应答的人类淋巴因子

本文作者运用不同的方法—筛选cDNA文库,克隆出表达于活化的t淋巴细胞的白细胞介素-13(IL-13),并将IL-13基因定位于人类第5号染色体5q23-31。 首先作者通过分化筛选的方法克隆出编码一种新的细胞因子的cDNA,此蛋白在1993年Keystore细胞因子专题讨论会上被命名为白细胞介素13(IL13),IL-13 cDNA是一个具有2个蛋氨酸起始的同源顺序CCA/GCCAUGG相连。推测出的IL-13多肽的氨基末端与其他分泌蛋白相似,亦呈疏水性,而     

人类肝脏cDNA文库的构建及hHGF基因的筛选、克隆与表达

目的构建人类肝脏的cDNA文库，从中筛选hHGF基因并进行克隆与表达。方法从人类胎儿肝脏中快速分离提取出mRNA；将已提取出的mRNA构建成cDNA文库；从中筛选出hHGF（hepatocyte growth factor）基因后，进行克隆并测序确定；构建表达质粒pBV221-hHGF后转化大肠杆菌BL21（DE3α），以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，收集菌体后提取蛋白样品并对其进行SDS-PAGE电泳及蛋白免疫印迹检测。结果成功地构建了人类肝脏的cDNA文库；经筛选得到约2200bp的hHGF基因；对其进行测序确认；成功地构建该基因的表达型质粒，并对表达蛋白进行蛋白免疫印迹检测，检测出其表达产生的蛋白质相对分子量在100000左右。结论人类肝脏cDNA文库成功地构建后可用于筛选获取完整的cDNA基因，从中筛选、克隆hHGF基因，并测序确认，进行表达蛋白质检测，结果正确，以上工作为进一步深入地进行与人类肝脏cDNA文库及hHGF相关的实验研究奠定了一定的基础。     

原生动物阴道毛滴虫的酵酶长寿保障基因LAG1同源基因克隆和序列分析

为了探讨寄生性原虫阴道毛滴虫细胞生长和衰老相关基因,作者从阴道毛滴虫的cDNA表达文库中分离出一具910碱基对的cDNA克隆,其编码框长834 bp,推测蛋白质序列有277个氨基酸.序列分析显示该克隆与酵酶长寿保障基因LAG1同源性最高,其氨基酸序列中含有LAG1及其同源基因保守的Lag1结构域和TLC结构域以及6个跨膜螺旋区和一个C-未端的内质网保留信号域.因此推测该克隆系酵酶LAG1的同源基因,该基因可能参与阴道毛滴虫的神经酰胺生物合成以及调解细胞的生命期或细胞衰老.该基因的基因组DNA与其cDNA序列一致,提示该基因序列中可能无内含子.     

新基因hKCNE4的克隆、表达及功能

KCNE4是KCNE家族中的一员,编码电压依赖性钾通道的B亚基。KCNE1、KCNE2、KCNE3均在人类基因组发现,并且有重要的生理功能,而KCNE4只是在鼠文库中得到,在人类cDNA文库中没有相关报道。本研究应用生物信息学分析,通过RT-PCR和RACE方法,从人类心脏cDNA文库中获取人类hKCNE4全长cDNA序列。其全长1188bp,编码170个氨基酸,和鼠KCNE4蛋白具有90％同源性。Northern Blot结果表明该基因在心脏、骨骼肌和肾脏高度表达。通过电子PCR方法将hKCNE4基因定位在2q35—36。亚细胞定位表明该基因的编码产物定位在细胞膜上,但体外电生理实验证明HERG基因同hKCNE4没有相互作用。     

高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因筛选及其鉴定

目的:筛选高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因,探讨其分子生物学机制。方法:通过抑制性消减杂交技术获得消减产物,转化大肠杆菌DH5α,构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库;联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选含插入片段的阳性克隆,进行测序和同源性分析,并经Northern杂交技术检测基因的表达。结果:成功构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库,其中2个克隆插入片段的基因序列与小鼠磷酸甘油酸酯激酶(Pgk-1)同源。Northern杂交证实该基因在高温致畸胚胎神经管的表达较其在同龄正常胚胎神经管明显升高。结论:Pgk-1的上调表达可能与高温致神经管畸形密切相关。     

酵母双杂交技术筛选NECL1胞内区的结合蛋白

目的 筛选人源膜表面黏附分子NECL1蛋白胞内区相互作用蛋白。 方法 构建含人NECL1蛋白胞内区氨基酸编码序列的诱饵质粒pGBKT7-NECL1C,对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选。用GST pull down实验进行体外蛋白相互作用的验证。结果 酵母双杂交阳性克隆测序后显示共存在9段不同序列（存在重复克隆）。比对氨基酸序列得到5个可能相互作用蛋白。通过GST pull down 实验验证了其中两个蛋白与NECL1胞内区的相互作用。结论 应用酵母双杂交系统,获得了一些候选的NECL1胞内区相互作用蛋白。     

人类间隙连接蛋白CX58基因的克隆

目的 利用同源性分析，克隆定位新的人类间隙连接蛋白基因，并探讨该基因和遗传性耳聋的关系。方法 将小鼠Cx57基因的编码区与美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI)的表达序列标签数据库（database of expressed sequence tags,dbEST)进行BLAST（basic local alignment search tool）分析，在得到的代表人类新基因的EST序列构建重叠群上设计引物CX58F1/CX58F2和CX58R1／CX58R2，分别与cDNA文库及Ready cDNA载体臂上引物行巢式聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR)、cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE),获得cDNA后与大规模测序结果比较，定位该基因，并在常染色体显性遗传性耳聋家系中进行突变分析。结果 将利用同源性分析得到的9个人类新的EST，构建重叠群设计引物行巢式PCR、RACE，在肝、肾的Ready cDNA和胎盘cDNA文库中得到1个全长cDNA并命名为CX58。通过与大规模测序结果比较，将该基因定位于1p32.3-p34.1。12个常染色体显性遗传性耳聋家系中未检测到突变。结论 通过同源性分析，我们克隆定位了1个新的人类间隙连接蛋白基因CX58。该基因突变可能不是引起常染色体显性遗传性耳聋的常见原因或与该病无关。     

小鼠GV卵中母源基因的克隆和其中一个基因在植入前胚表达的研究

目的 克隆和筛选小鼠生发泡完整卵母细胞(GV卵)中母源基因，并检测其中一个基因在植入前不同发育阶段胚中的表达，初步了解该基因在卵母细胞发育成熟及早期胚发育中的作用。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)，以生发泡完整的卵母细胞为检测子(tester)，8-细胞胚为驱赶子(driver)，建立GV卵中母源基因的cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选GV卵中母源基因的cDNA文库，对阳性克隆进行序列测定和同源性分析；并采用RT-PCR方法观察其中1个阳性克隆的基因在着床前胚的表达。结果 克隆得到18个基因的cDNA序列和8个同源EST序列在GV卵中特异表达，包括PeroxiredoxinⅡ基因。RT-PCR显示PeroxiredoxinⅡ基因呈阶段性差异表达，在GV卵、MⅡ卵、1-胞胚和2-细胞胚有表达，但从MⅡ卵开始表达下降。而在4-细胞胚、8-细胞胚、桑椹胚和囊胚中不表达。结论 PeroxiredoxinⅡ基因是GV卵中母源基因cDNA文库中的一个基因，提示该基因在卵母细胞发育成熟和合子基因激活中起一定作用。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因。方法将重组诱饵质粒pGBKT7eAg转化酵母细胞AH109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析。结果配合后筛选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xα半乳糖(Xαgal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株。完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,最终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因。结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索。     

人类心脏发育相关基因的初步筛选

从人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库，通过差减杂交，筛选心脏发育相关基因。方法：①用23周和27周的人胚胎心脏组织构建2个cDNA文库，分别命名为LibF和LibS，用成人心脏组织构建了1个cDNA文库，命名为LibA。②探针的合成、纯化和比放射活性测定。③差减杂交和特异性探针的富集。④菌落原位杂交。⑤差减阳性克隆的斑点杂交。结果：①所构建的人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库的容量LibF为1×109，LibS为3.7×108，LibA为2×108，重组子的片段大小为0．9~4．6kb。②经差减杂交和原位杂交，获得有差异克隆48个。结论：构建高质量的人胎儿心脏cDNA文库和成人心脏cDNA文库为筛选心脏发育相关基因奠定可靠的基础，并初步说明随着发育过程的推移，整体基因的表达有逐步减少的趋势。     

低密度脂蛋白诱导下调的新基因cDNA的克隆及组织表达

用改进的mRNA差异显示．PCR技术分析ECV304在低密度脂蛋白的诱导下表达水平明显差异的cDNA。获得-差异表达的265bp新EST；以该EST为探针，从人主动脉cDNA文库中筛选到一个1726bp的cDNA克隆，其748-1266bp之间的519个碱基构成一个完整的开放阅读框架，编码172个氨基酸组成的蛋白质。其羧基端94-172区间氨基酸序列中含有三个重复的C2H2型锌指蛋白基序CX2CX3FX5LX2HX3H，Northen Blot证实两组ECV304中均出现一条1．7kb的区带，LDL诱导后其表达降低了2．2倍。与差异显示-PCR的结果一致，该基因被定名为LRZFG。LRZFG是多组织表达的基因，其在动脉粥样硬化早期病理反应的作用有待于进一步研究。     

小鼠MBL-A基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠甘露聚糖结合凝集素-A(MBLA)基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT-PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中，分离出MBL-A基因cDNA片段，克隆入pUC-T载体，测序并进行分析。结果：扩增得到的小鼠MBL-A基因cDNA全长720bp，编码240个氨基酸残基，包含了完整的富含半胱氨酸区、胶原区、颈区和糖识别域。分析表明，与Genbank中发表的序列具有99.9％的同源性。结论：获得小鼠MBL-A基因的克隆，为进一步研究MBL-A分子在体内的生物学功能奠定了一定基础。     

肺腺癌同源正常组织中差异表达基因的克隆

目的 从与肺腺癌同源的正常组织中筛选差异表达基因，以期从分子水平阐明机体抑制肿瘤发生的机制。方法 利用抑制性消减杂交分别肺癌组织及肺腺癌同源正常组织cDNA片段，并建立相应的cDNA文库。用肺腺癌组织及与其同源的正常组织cDNA片段作为探针，分别进行逆向和正向斑点杂交，筛选与同源正常组织探针杂交而不与肺腺癌组织探针杂交的阳性克隆并测序，测序结果与GenBank中的序列进行同源性分析。结果 在肺腺癌同源正常组织中，获得12个差异表达基因片段，其中4个与细胞凋亡相关基因有较高的同源性；8个与人类不同染色体的不同区域有较高的同源性，功能不详。结论 推测肺腺癌同源正常组织中存在凋亡相关基因等，它们可能通过多种途径促进细胞凋亡而抑制细胞异常增殖，从而达到抑制肿瘤发生的目的。     

青蒿花粉变应原Art a1基因的克隆、表达及特性鉴定

目的克隆、表达和鉴定青蒿花粉变应原Arta1。方法在成功构建青蒿花粉cDNA文库的基础上,用蒿属花粉过敏患者的阳性混合血清进行免疫学筛选,所获阳性克隆亚克隆入pET24a(+),经IPTG诱导表达后,通过Ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化,并采用Westernblot和ELISA检测其IgE结合活性。结果选用阳性血清从青蒿花粉cDNA文库中筛选到1个阳性克隆,经序列测定,该基因与GenBank中已知基因无明显同源性,含有长度为609bp的开放阅读框,编码203个氨基酸,命名为Arta1;该重组变应原在大肠杆菌中高效表达为相对分子质量(Mr)为22.7×103蛋白,进一步在Ni2+亲和层析柱得到高度纯化;免疫学分析表明重组变应原有良好的IgE结合活性。结论本研究克隆和鉴定了一个青蒿花粉主要变应原Arta1(登录号为:CK700713),为花粉过敏性疾病的诊断和免疫治疗及进一步的实验研究奠定基础。     

人源性抗汉坦病毒抗体VH基因噬菌体表面展示文库的构建与筛选

目的 构建人抗汉坦病毒（HV）抗体重链可变区（VH）基因噬菌体表面展示文库,筛选人源性抗HV单克隆抗体（mAb）。方法 从HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,用RT－PCR扩增VH基因,与噬菌粒pHEN1连接,构建VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮吸附－洗脱－扩增的亲和筛选后,用ELISA鉴定抗HV噬菌体抗体的活性。结果 HV吸附筛选的特异性人外周血B淋巴细胞中,成功扩增出VH基因,并构建了VH基因噬菌体表面展示文库。经3轮亲和筛选,获得24个具有与HV结合活性的重组噬菌粒克隆。对其中一个克隆的VH基因（VH－D10）的序列分析表明,该基因的全长为363bp,编码121个氨基酸,与EMBL和GenBank中所有已知免疫球蛋白（Ig）基因进行同源性比较,其同源序列均人为IgVH原因。结论 成功地构建了人抗HV抗体VH基因噬菌体表面展示文库,并筛选到有HV结合活性的重组噬菌体克隆,为制备人源性抗HVmAb奠定了基础。     

肺癌T7噬菌体文库中MUC1蛋白抗原模拟表位的筛选

目的利用噬菌体表面展示技术,从肺癌T7噬菌体展示文库中筛选MUC1蛋白抗原的模拟表位。方法以MUC1单克隆抗体为靶分子,对肺癌T7噬菌体文库进行淘洗筛选,得到的阳性克隆进行测序并推导其氨基酸序列,对得到的阳性噬菌体克隆进行鉴定。结果经3轮淘选,得到20个阳性克隆。测序获得AAPDFRP、SAPDDRP 2种氨基酸序列,对MUC1单抗的抑制率均在50%以上,与肺癌血清结合特异性较高,此2种蛋白序列可模拟MUC1蛋白抗原表位。结论通过噬菌体展示技术成功筛选到MUC1蛋白的模拟表位序列XAPDXRP(X为任意氨基酸),对肺癌的早期诊断有一定的参考价值。     

阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆和序列分析

Rab鸟苷三磷酸酶是细胞膜转运机制的关键调节分子,与原虫的分泌功能密切相关。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因,以便进一步探讨其功能。作者从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出2个Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆,其中1个cDNA序列长658对碱基,读码框含597对碱基,推测蛋白质序列具198个氨基酸。序列分析表明该氨基酸序列与Rab6a蛋白亚家族的同源性最高。另一cDNA序列长764对碱基,读码框含657对碱基,推测蛋白质序列具218个氨基酸。序列比对分析显示该氨基酸序列与Rab6b蛋白有较高的同源性。2个氨基酸序列都拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域、特异性RabF结构域和典型的异戊烯化结构域。进化树分析提示毛滴虫的这2个基因系Rab6家族的同源基因,在进化上更接近原虫和单细胞的酵母Rab6亚家族。序列分析还显示这2个基因都无内含子,其基因组DNA序列与其cDNA序列完全一致。