早孕蜕膜绒毛基质金属蛋白酶-9和其基质金属蛋白酶抑制物-1的表达特点及作用

目的　研究基质金属蛋白酶 -9(MMP -9)和基质金属蛋白酶抑制物 -1(TIMP -1)在早孕期蜕膜和绒毛中的表达特点。方法　选择 45例正常早孕蜕膜绒毛标本和 3 0例正常妇女分泌中期子宫内膜标本 ,作MMP -9及TIMP -1免疫组化染色 ,测定阳性表达的光密度值 ,比较早孕蜕膜绒毛MMP -9及TIMP -1的表达与分泌中期子宫内膜表达的差异。结果　早孕子宫蜕膜、绒毛MMP -9的光密度值为 0 168± 0 0 5 5 ,TIMP -1的光密度值为 ( 0 15 5± 0 0 46) ,分泌中期子宫内膜MMP的光密度值为 ( 0 13 3±0 0 2 10 ) ,TIMP -1光密度值为 0 113± 0 0 2 5 1。早孕组的表达明显强于分泌中期子宫内膜 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论　正常早孕子宫蜕膜、绒毛强表达MMP -9/TIMP -1,二者高水平上的动态平衡 ,对早孕的维持起着重要作用     

基质金属蛋白酶-8及组织抑制物-1与胎膜早破的关系

目的:探讨孕妇胎膜基质金属蛋白酶-8(MMP-8)及金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)的水平变化以及与胎膜早破的关系。方法:30例胎膜早破孕妇作为胎膜早破组,其中妊娠37～41周18例,28～36+6周12例。30例非胎膜早破孕妇作为对照组,平均妊娠34～41+2周。应用免疫组织化学SP法和图像分析法检测两组孕妇胎膜MMP-8和TIMP-1水平,比较胎膜早破组与对照组在这些指标上的差异。结果:①胎膜早破组和对照组两组孕妇胎膜MMP-8的阳性表达分别为100%和70%,胎膜早破组水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);②胎膜早破组和对照组两组孕妇胎膜TIMP-1的表达,胎膜早破组低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MMP-8水平的异常升高及TIMP-1水平的下降,可能是胎膜早破重要的发病机制,MMP-8及TIMP-1的水平检测可作为一种新的生物学标志物用于胎膜早破并绒毛膜羊膜炎感染     

基质金属蛋白酶-1及组织金属蛋白酶抑制物-1在盆腔器官脱垂患者阴道壁组织中的表达及意义

目的探讨患者阴道壁粘膜组织中基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)及组织金属蛋白酶抑制物-1(tissues inhibitor of metalloproteinase-1,)在盆腔器官脱垂患者(pelvic organ prolapse,POP)中的表达及意义,分析其与POP发生的关系。方法随机选取2011年1—12月住院手术治疗的POP患者25例作为POP组,选择同期非POP病变,其他经阴手术患者30例作为对照组。结果 MMP-1在阴道壁粘膜组织中的表达:POP组平均灰度值96.17,对照组平均灰度值85.65,比较差异有统计学意义(P<0.05)。TIMP-1在阴道壁组织中的表达:POP组平均灰度值87.17,对照组平均灰度值97.18,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 POP患者盆底支持结构的退行性改变与阴道壁粘膜组织中的胶原代谢活跃有关,联合检测MMP-1及TIMP-1对POP的诊断和治疗具有重要的临床意义。     

基质金属蛋白酶-7异常表达与子宫内膜癌发病关系的探讨

目的:探讨MMP-7与子宫内膜癌发病及转移的关系。方法:利用免疫组化的方法观察72例子宫内膜癌病变组织、64例内膜癌前病变组织和80例正常子宫内膜中MMP-7及其天然抑制物TIMP-1的表达情况。结果:在内膜癌组、内膜癌前病变组MMP-7的阳性表达分别为87.5%(63/72)、75%(48/64),明显高于正常内膜组43.8%(35/80)(P<0.01),而两组之间无显著差异。内膜癌组和癌前病变组TIMP-1的阳性表达分别为80.6%(58/72)、65.6%(42/64),也明显高于正常内膜组38.8%(31/80)(P<0.01)。随着内膜癌临床分期的增加,MMP-7的表达明显增强,Ⅱ期以上的内膜癌MMP-7表达均明显高于Ⅰ期(P<0.05)。在不同组织学分类中,组织分化程度低的内膜癌MMP-7表达明显高于组织分化程度高者。淋巴结转移阳性的内膜癌组织,MMP-7表达高于淋巴结转移阴性的内膜癌组织(P<0.01)。而TIMP-1则与上述病理学参数无显著相关性。结论:MMP-7在内膜癌发生过程中起到了重要作用,MMP-7表达增强和TIMP-1分泌相对不足,是内膜癌浸润和转移的重要促进因素。     

溃疡性结肠炎患者基质金属蛋白酶-1表达测定的意义

目的检测基质金属蛋白酶-1（MMP-1）在溃疡性结肠炎（UC）患者结肠组织中的表达，探讨MMP-1在溃疡形成过程中的作用以及与病情严重程度之间的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫组织化学染色法在40例UC患者的结肠黏膜溃疡区、炎症区以及相对正常区取活组织在mRNA水平及蛋白水平上测定MMP-1表达，以10例正常人的结肠组织（正常对照组）作为对照，分析MMP-1的表达与病情严重程度之间的关系。结果在mRNA水平上，MMP-1在溃疡区、炎症区结肠组织中的表达较相对正常区明显增加（P〈0．01），较正常对照组也明显增加（P〈0．01）；在蛋白水平上，MMP-1在溃疡区、炎症区的表达较相对正常区明显增加（P〈0．05），较正常对照组也明显增加（P〈0．05）；相对正常区与正常对照组之间的表达无论在mRNA水平还是在蛋白水平差异均无统计学意义；MMP-1的表达在溃疡区、炎症区、相对正常区及正常对照组结肠组织中的阳性率分别为85％、82％、58％、40％；MMP-1与UC病情严重程度具有相关性（r=0．406，P〈0．05）。结论UC病变结肠组织中MMP-1的表达增加，并且与UC的组织损伤程度有关，MMP-1可以作为评价UC病情严重程度的生物学指标；应用外源性基质金属蛋白酶抑制剂治疗可能会成为UC治疗的新途径。     

幽门螺旋杆菌诱导基质金属蛋白酶-9表达的研究

目的 通过研究幽门螺旋杆茼对基质金属蛋白酶表达水平的影响，探讨幽门螺旋杆茼致病的分子机理。方法 ATCC49503(CagA^ )、HP30929(CagA^-)幽门螺旋杆茼分别与BGC-823共同培养后提取总RNA，用RT-PCR方法分析BGC-823细胞中MMP-9的表达水平；通过胃镜活检选取9例HP阳性胃溃疡、9例HP阴性胃溃疡患者的标本采用RT-PCR分析MMP-9的表达水平；取17例HP阳性和14例HP阴性的胃溃疡标本经切片后石蜡包埋，用免疫组化染色检测MMP-9表达并图象定量分析测量MMP-9染色阳性的面积。结果 HP能诱导MMP-9在BGC-823细胞中表达，CagA^ HP株明显强于CagA^-株；在HP阳性胃溃疡的胃黏膜上皮细胞中，MMP-9表达水平明显高于HP阴性胃溃疡。结论 HP诱导MMP-9的表达在胃溃疡、胃癌的病理过程中可能起到重要的作用。     

妊娠期高血压疾病患者血清基质金属蛋白酶-9与组织抑制因子-1的表达及作用

目的:探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在妊娠期高血压疾病发病机制中的作用。方法:采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测20例妊娠期高血压疾病患者和20例正常妊娠孕妇血清MMP-9及TIMP-1水平。结果:妊娠期高血压疾病患者血清MMP-9水平显著低于正常对照组(P<0.05);血清TIMP-1水平显著高于正常对照组(P<0.05)。结论:孕妇血清MMP-9及TIMP-1水平变化在妊娠期高血压疾病的发病机制中有重要作用。     

急性冠脉综合征患者血清基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3浓度研究

目的研究急性冠脉综合征患者血清基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、MMP-3浓度,探讨其与冠状动脉斑块不稳定性之间的关系。方法选择2012年1月—2013年3月收治的做冠状动脉造影患者80例,分为稳定型心绞痛(stable angina pectoris,SAP)组20例,不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris,UAP)组20例及急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)组20例,另选择同期不典型胸痛冠脉造影显示无冠状动脉狭窄患者20例作为对照组,采用酶联免疫吸附测定法测定血清MMP-1及MMP-3浓度。比较四组血清MMP-1及MMP-3浓度。计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果 SAP组、UAP组、AMI组血清MMP-1浓度分别为(3.84±1.05)、(5.63±1.93)、(6.42±2.61)μg/L均高于对照组的(1.34±0.47)μg/L,比较差异均有统计学意义(t=9.719、9.658、8.567,均P<0.05)。UAP组、AMI组血清MMP-1浓度均高于SAP组,差异均有统计学意义(t=3.643、4.101,均P<0.05)。SAP组、UAP组、AMI组血清MMP-3浓度分别为(38.73±20.45)、(55.36±26.61)、(62.49±31.04)μg/L,均高于对照组的(24.82±17.48)μg/L,UAP组、AMI组均高于对照组,差异均有统计学意义(t=4.290、4.729,均P<0.05),UAP组、AMI组血清MMP-3浓度均高于SAP组,差异均有统计学意义(t=2.216、2.859,均P<0.05)。结论 UAP和AMI患者两种MMP水平均明显高于SAP组和对照组,血清MMP水平可作为急性冠脉综合征患者斑块不稳定性的标志物。     

溃疡性结肠炎患者基质金属蛋白酶-1表达测定的意义

目的 检测基质金属蛋白酶-1(MMP-1)在溃疡性结肠炎(UC)患者结肠组织中的表达,探讨MMP-l在溃疡形成过程中的作用以及与病情严重程度之间的关系.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色法在40例UC患者的结肠黏膜溃疡区、炎症区以及相对正常区取活组织在mRNA水平及蛋白水平上测定MMP-1表达,以10例正常人的结肠组织(正常对照组)作为对照,分析MMP-1的表达与病情严重程度之间的关系.结果 在mRNA水平上,MMP-1在溃疡区、炎症区结肠组织中的表达较相对正常区明显增加(P＜0.01).较正常对照组也明显增加(P＜O.01);在蛋白水平上,MMP-1在溃疡区、炎症区的表达较相对正常区明显增加(P＜0.05),较正常对照组也明显增加(P＜0.05);相对正常区与正常对照组之间的表达无论在mRNA水平还是在蛋白水平差异均无统计学意义;MMP-1的表达在溃疡区、炎症区、相对正常区及正常对照组结肠组织中的阳性率分别为85%、82%、58%、40%;MMP-1与UC病情严重程度具有相关性(r=0.406,P＜O.05).结论 UC病变结肠组织中MMP-1的表达增加,并且与UC的组织损伤程度有关,MMP-l可以作为评价UC病情严重程度的生物学指标;应用外源性基质金属蛋白酶抑制剂治疗可能会成为UC治疗的新途径.     

肝癌中基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的临床意义

目的研究肝癌组织基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TI MP-1)的表达,探讨其与肝癌的关系及其临床意义,为临床上寻找肝癌表达的新的生物学标志物提供理论依据。方法取山东省昌邑市人民医院2008年6月—2010年6月肝癌手术切除标本36例,按照Edmondson-Steiner组织学分级标准进行分级。选用3例外伤性肝破裂患者手术肝切除标本作正常对照。使用鼠抗人TI MP-1多克隆抗体,进行免疫组织化学PV-9000通用型二步法染色。染色结果根据反应强度及面积判断,评分标准按Shi mizu方法,根据两项打分之和判断。结果对照组中TI MP-1的表达为阴性。TI MP-1在肝癌中的表达阳性率为74.8%。TI MP-1的阳性表达与患者年龄、性别、甲胎蛋白(AFP)是否阳性、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是否阳性均无关(均P>0.05)。有癌栓组、无癌栓组和包膜不完整组、包膜完整组的TI MP-1在各组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。高侵袭转移组与低侵袭转移组间,TI MP-1阳性率分别为89.6%和48.3%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TI MP-1在肝癌组织中的过度表达是肝癌侵袭与转移程度的一个重要生物学标志物。     

葡萄球菌肠毒素A基因的克隆、原核表达和鉴定

目的克隆葡萄球菌肠毒索A(SEA)基因,构建其原核表达系统,鉴定重组蛋白(rSEA)免疫原性。方法采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建pET32a-SEA表达质粒,转化入E.coli BL21DE3宿主菌,通过IPTG诱导表达,分离、纯化及Western印迹法鉴定。结果PCR获得SEA基因片段,DNA测序结果与已报道的SEA基因序列(GenBank No:L22566,AP004828)一致,构建了pET32a-SEA表达质粒,并成功地诱导、纯化了rSEA蛋白,rSEA表达量约为细菌总蛋白的40%。结论成功克隆了SEA全长基因,构建了rSEA原核表达系统,为进一步研制SEA的单克隆抗体及诊断试剂盒奠定了基础。     

人肝再生增强子原核表达系统的构建与筛选

目的构建多个人肝再生增强子(hALR)的原核表达系统进行原核表达、鉴定及筛选,得出理想的系统用于进一步的研究。方法构建4个重组表达质粒pET28a( )/hALR、pET23a/hALR、pGEX-5x-1/hALR、pGEX-5x-2/hALR,分别转化3种宿主菌,诱导表达重组hALR蛋白,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westem blotting鉴定重组蛋白。结果双酶切和DNA测序证实hALR cDNA正确插入4种表达载体并成功转化宿主菌,仅pET28a( )/hALR的BL21(DE3)菌株成功表达相对分子质量为23kDa的重组蛋白。结论筛选得出人肝再生增强子的原核表达系统,成功表达并鉴定重组hALR蛋白。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及原核表达

目的 构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的重组质粒，进行原核表达。方法 以Hela细胞的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-B-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1，以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组蛋白进行分析。结果经核苷酸序列测序和sDS—PAGE法鉴定，成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌，并表达和纯化了sTNFR-MBP融合蛋白。结论成功地构建了人sTNFR1重组质粒克隆，表达并纯化了sTNFR1-MBP融合蛋白。     

旋毛虫表皮胶原蛋白基因的原核表达

目的构建表皮胶原蛋白基因X21的原核表达载体pET28-X21ex,诱导其表达胶原蛋白。方法应用PCR技术扩增目的基因X21,纯化后将其克隆入表达载体pET28a,重组质粒经酶切鉴定后,转入大肠杆菌DE3诱导表达,利用SDS-PAGE检测胶原蛋白的表达效果。结果利用DNA重组技术构建了表皮胶原蛋白基因X21的原核表达载体pET28-X21ex,转化大肠杆菌后经诱导表达了30kDa的融合蛋白,以诱导3h的表达量最高,在35%以上。结论旋毛虫表皮胶原蛋白基因X21在大肠杆菌中能够高效表达,为进一步研究旋毛虫表皮胶原蛋白的结构与功能奠定了基础。     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化

目的通过原核表达获得普马拉病毒重组核蛋白。方法采用RT-PCR方法,从感染普马拉病毒的鼠肺标本中扩增得到编码核蛋白1-117 aa的基因片段。将截短的核蛋白基因片段插入原核表达载体PQE30构建重组质粒,转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,利用N i-NTA Agarose对表达产物进行纯化。结果重组蛋白得到了高效表达。表达产物分子量15 000,在菌体中主要以可溶性蛋白形式存在。通过亲和层析,得到了纯化的重组蛋白。结论普马拉病毒重组核蛋白基因片段得到了有效表达。     

人乳头瘤病毒18型主要衣壳蛋白原核表达系统的构建及鉴定

目的构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型(HPV18)主要衣壳蛋白,为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础. 方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板,利用PCR方法扩增HPV18L1 DNA片段,将HPV18L1 DNA与pUC 19质粒重组构建pUC19-HPV18L1重组质粒;用酶切电泳验证重组结果的正确性;并通过测序检查质粒重组后序列有无变化;再利用pQE32质粒做表达载体构建重组质粒pQE32-HPV18L1,并用酶切电泳验证;利用SDS-PAGE检测HPV18L1目的蛋白;利用Western杂交鉴定HPV18L1目的蛋白的特异性. 结果 PCR扩增DNA片段约为1.7kb,与预期结果相同;克隆重组质粒pUC19-HPV18L1酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变;表达重组质粒pQE32-HPV18L1酶切图谱亦与预期相同;SDS-PAGE显示,约63×103处可见目的蛋白带,与预期结果一致;Western 杂交鉴定,在Mr约63×103处可见目的条带,与预期结果一致. 结论成功构建原核表达重组质粒pQE32-HPV18L1并能表达HPV18主要衣核蛋白.     

新型呼肠病毒S1基因的表达鉴定

目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白的编码基因S1的重组原核表达质粒,对其在原核细胞内的表达进行研究。方法将S1基因克隆入原核表达载体pProEX HTa,构建重组原核表达载体pPLS,通过IPTG诱导,利用蛋白电泳和蛋白免疫印迹等方法对其在大肠杆菌中的表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western-blot的检测结果一致表明,诱导后1~5 h均可检测到目的蛋白的表达,其中以5 h的蛋白表达量最大,且表达的目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在。结论通过构建重组原核表达质粒,可使目的蛋白σ1得到诱导表达,为后续抗体制备及研究病毒-宿主相互作用提供实验基础。     

人防御素-5基因原核表达载体pRSET-A的构建

目的利用分子生物学技术和方法将pRSET—A质粒改建为带有人α-防御素5（HD-5α）基因的新型表达载体pRSET—HD-5α。为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础。方法PCR技术，以设计的引物P1／P2从cDNA文库中扩增人α-防御素5基因片段，并将扩增出来的目的基因和pRSET—A质粒用BamHI和EcoRI双酶切后连接构成重组质粒，然后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆。最后对PCR及酶切鉴定含有目的基因的克隆进行测序和电泳。结果获得α-防御素-5基因片断大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；电泳结果证明已将此片段克隆到pRSET—A内。结论成功构建了HD-5α基因的新型表达载体pR—SET—A／HD-5α。     

肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的特异性。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导6 h后可诱导表达得到约33 KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。结论获得特异性的EV71病毒河南分离株VP1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。