人前脑啡肽原基因修饰人骨髓间充质干细胞系的构建

目的 构建人前脑啡肽原(PENK)基因修饰的并可稳定分泌脑啡肽蛋白的人骨髓间充质干细胞系(hMSCs).方法 采用脂质体法将PENK基因逆转录病毒载体质粒(pBABE-PENK)转染至Phoenix-293T细胞,收集病毒上清液感染hMSCs细胞,经过嘌呤霉素筛选得到稳定表达PENK基因的hMSCs细胞株(hMSC-PENK细胞).以转染空载体细胞作为对照,即hMSC-pBABE细胞.采用RT-PCR法检测PENK mRNA的表达,免疫荧光法测定亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达,ELISA法测定细胞培养上清液LEK浓度.结果 与hMSCs细胞和hMSC-pBABE细胞比较,hMSC-PENK细胞PENK mRNA和LEK表达上调,细胞培养上清液中LEK浓度升高(P＜0.05或0.01).结论 PENK基因修饰的hMSCs可表达PENK基因并分泌脑啡肽蛋白,成功构建了稳定分泌镇痛物质的细胞系.     

神经病理性痛大鼠鞘内注射人前脑啡肽原基因修饰骨髓间充质干细胞的镇痛效果

目的 探讨神经病理性痛大鼠鞘内注射人前脑啡肽原(PENK)基因修饰人骨髓间充质干细胞(hMSC)的镇痛效果.方法 取鞘内置管成功的健康雄性SD大鼠40只,周龄6～8周,体重160～180 g,随机分为4组(n=10),A组为正常对照组;B组、C组和D组采用坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)法建立神经病理性痛模型,于CCI术后3 d鞘内给药,A组和B组鞘内注射生理盐水10μl;C组鞘内注射转染空载体的hMSC细胞(hMSC-pBABE)悬液10μl(2×108～3×108/μl);D组鞘内注射hMSC-PENK细胞悬μl液10μl(2×108～3×108个/μl).于术前、术后3、5、7、9、14 d时测定热痛阈.术后14 d痛阈测定后取新鲜脊髓组织,采用RT-PCR法测定PENK mRNA表达.结果 与术前比较,B组、C组、D组术后各时点热痛阈降低(P＜0.05).与A组比较,B组、C组、D组热痛阈降低,B组和C组PENK mRNA表达下调,D组PENK mRNA表达上调(P＜0.05).与B组和C组比较,D组热痛阈升高,PENK mRNA表达上调(P＜0.05).B组和C组各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 大鼠鞘内注射PENK基因修饰的hMSC可减轻神经病理性痛.     

携带可调控人前脑啡肽原基因逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建四环素调控的含人前脑啡肽原基因(hPPE)逆转录病毒载体。方法用PCR方法扩增目的基因hPPE,定向克隆入逆转录病毒四环素反应质粒(pRevTRE)中,酶切反应、PCR 及DNA测序鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE;在脂质体介导下分别将pRevTRE/hPPE和逆转录病毒四环素调节质粒(pRevTet-on)转入包装细胞PT67,经相应的抗生素稳定筛选得到抗性细胞克隆。RT-PCR鉴定得到阳性产病毒细胞系PT67/Tet-on和PT67/TREhPPE。用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果经限制性酶切分析、RT-PCR及DNA序列分析证实pRevTRE/hPPE中含有hPPE基因。转染有pRevTet-on的FT67细胞病毒滴度为2.6×105 CFU/ml,转染有pRevTRE/hPPE的PT67细胞病毒滴度为3.2×105 CFU/ml。结论成功构建了含有受四环素调控hPPE基因的逆转录病毒载体,建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系,为可调控细胞移植镇痛的研究奠定了实验基础。     

重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法 构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果 酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论 获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。     

人前脑啡肽原基因在体细胞系细胞的表达

目的 检测人前脑啡肽原基因（ｈｐｐｅ）鼠、犬,人体细胞系细胞的表达水平,评估转脑啡肽基因细胞系用于细胞镇痛的可行性。方法 采用磷酸钙共沉淀法或脂质体包裹法,将重组质粒ｐＣＭＶｈＰＰＥ（ｐＥ）单独或与ｐＲＳＶｎｅｏ（ｐＮ）共转染导入三种哺乳动物体细胞系细胞（ＮＩＨ／３Ｔ３,ＭＤＣＫ,ＷＩＳＨ）中,用Ｇ４１８培养液筛选阳性共转染细胞,扩增培养。以放射免疫法测定细胞培养上清液中脑啡肽（ＥＮＫ）的含量。结     

大鼠鞘内注射含人前脑啡肽原基因单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的镇痛效应

目的大鼠鞘内注射含人前脑啡肽原基因（HPPE）单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-Ⅰ）扩增子载体的镇痛效应。方法60只纯种雄性SD大鼠，采用改良Yaksh法进行鞘内置管后，随机分为生理盐水组（NS组，n=18）、空白载体pHSVIRES-LacZ组（SHZ组，n=18）、重组HSV-Ⅰ扩增子载体pHSVIRES-HPPE-LacZ组（SHPZ组，n=24），大鼠鞘内分别注射生理盐水、SHZ、SHPZ，1周后分别从NS组、SHZ组和SHPZ组中取11只、11只、16只大鼠，取脊髓组织，用X-gal染色原位法测定LacZ的表达，用RT-PCR方法测定HPPE mRNA的表达，用放免法测定L-脑啡肽（L-EK）含量，并测定注射SHPZ后3d、1周、2周、3周、4周、5周时热痛阈（用后爪缩腿潜伏期表示）。结果在体转染大鼠中枢神经细胞，外源脑啡肽基因能有效表达。与基础值比较，SHPZ组注射SHPZ后1～4周时热痛阈升高，于注射SHPZ后3周时达到高峰（P〈0．05）；与NS组及SHZ组比较，SHPZ组于注射SHPZ后1～4周时热痛阈升高（P〈0．05），注射SHPZ后1周时脊髓组织L-EK含量升高。结论大鼠鞘内注射SHPZ有明显的镇痛效应。     

人肝细胞生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系的构建

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞系(MSCs).方法 采用脂质体法将hHGF基因慢病毒载体质粒(lenti-hHGF)转染至293FT细胞,收集病毒上清液感染大鼠MSCs细胞,经过G418筛选得到稳定分泌hHGF的MSCs细胞株(hHGF-MSCs细胞).以转染空载体细胞(eGFP-MSCs)、未转染慢病毒载体的MSCs细胞作为对照.采用免疫印迹法检测hHGF的表达.hHGF-MSCs细胞分别加入成骨诱导剂或成脂诱导剂培养,分别采用茜素红染色和油红O染色鉴定成骨细胞和脂肪细胞表型.结果 与未转染慢病毒载体的MSCs细胞和eGFP-MSCs细胞比较,hHGF-MSCs细胞hHGF表达上调(P＜0.01).hHGF-MSCs细胞体外诱导培养后具有明显的成骨和成脂表型,可向成骨细胞和脂肪细胞分化.结论 成功构建hHGF基因修饰大鼠MSCs.     

前脑啡肽原基因转染对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响

目的 观察采用非病毒、非质粒微量免疫原定义的基因表达(minimalistic immunological defined gene expression,MIDGE)方法构建前脑啡肽原(preproenkephalin,PPENK)-MIDGE-核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)基因载体在缺血心肌的表达及对心肌的保护作用.方法 48只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为4组(每组12只):假手术组(C组)、缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)组(I/R组)、载体组(P组)、拮抗剂组(D组).C组仅进行开胸手术,冠状动脉左前降支(left anterior descending,LAD)挂线不结扎;I/R组开胸结扎LAD 30 min再灌注24 h;P组尾静脉注射PPENK-MIDGE-NLS基因载体24 h后建立心肌I/R模型;D组实验前24 h尾静脉注射PPENK-MIDGE-NLS基因载体,实验前30 min给予纳曲吲哚(1 g/kg).记录缺血前(T0)和缺血30 min(T1)、再灌注30 min时(T2)的MAP、HR;按Lambeth会议标准记录T1和T2心律失常情况并评分;于I/R后24 h用ELISA检测大鼠血清肌钙蛋白I(carciac troponin I,cTnI)、 氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色测量心肌梗死面积、H-E染色观察心肌形态学改变、Western blot检测心肌组织内前脑啡肽(proenkephalin,PENK)的表达.结果 PPENK-MIDGE-NLS基因载体静脉注射后可减轻心肌I/R诱导的MAP、HR下降程度,P组的cTnI低于I/R组和D组(P<0.05),P组大鼠心律失常评分[(2.0±0.9)分]分别低于I/R组[(4.1±0.6)分]和D组[(4.0±1.0)分](P<0.05),P组的心肌梗死面积较I/R组明显减少(P<0.05),H-E染色示P组大鼠心肌损伤程度明显减轻,心肌PENK蛋白表达量明显高于其他组(P<0.05).结论 PPENK-MIDGE-NLS提高心肌缺血区PENK含量,具有心肌保护作用.     

慢性炎性疼痛对新生大鼠学习记忆功能发育及海马前脑啡肽mRNA表达的影响

目的观察完全弗氏佐剂所致慢性炎性疼痛对新生大鼠空间学习记忆功能发育的影响及其机制。方法10窝新生SD大鼠,每窝6只,随机分为疼痛组和对照组,在大鼠出生后第2天,疼痛组大鼠左足底皮下注射完全弗氏佐剂20μl,对照组注射等量生理盐水。分别在大鼠出生后第10天和第21天,两组每窝各取1只幼鼠处死后取海马组织,采用逆转录聚合酶链反应技术测定海马前脑啡肽mRNA的表达。幼鼠出生后第21天开始,两组每窝各取1只幼鼠进行Morris水迷宫实验。结果隐藏平台实验中,在出生后第21天和第24天疼痛组大鼠潜伏期较对照组延长(P<0.05),在空间探索实验中,疼痛组大鼠穿过平台所在象限游泳时间与总游泳时间、路径与总路径的比例均低于对照组(P<0.05),两组大鼠可视平台实验中潜伏期比较差异无统计学意义(P>0.05);在出生后第10天和第21天,疼痛组大鼠海马前脑啡肽mRNA表达均低于对照组(P<0.05)。结论慢性炎性疼痛可影响新生大鼠海马学习记忆功能的发育,海马前脑啡肽表达的下调可能是其中的机制之一。     

突变k- ras基因修饰的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用

目的探讨腺病毒介导的突变k-ras基因修饰的树突状细胞疫苗在体内的抗肿瘤作用.方法将突变k-ras基因修饰的DC经腹腔注射免疫小鼠(5×105/只),1次/周,共2次,随后将肿瘤细胞接种于皮下,观察DC能否诱发机体的免疫保护.结果突变k-ras基因修饰的DC疫苗组Lewis肺癌(3LL)移植瘤生长明显延缓,肿瘤体积显著低于空载体组、DC组和对照组(P＜0.05),而抑瘤率显著高于空载体组、DC组和对照组(P＜0.05).突变k-ras基因修饰的DC疫苗组Lewis肺癌(3LL)移植瘤肺转移率(2/10,20%)显著低于空载体组(6/10,60%)、DC组(6/10,60%)和对照组(8/10,80%,P＜0.05);肺部转移灶数目亦显著少于空载体组、DC组和对照组(P＜0.05).结论突变k-ras基因修饰的DC疫苗能有效诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应,抑制Lewis肺癌生长和远处转移.     

DNA微阵矩分析人软骨细胞体外老化过程中基因表达水平的变化

目的 研究成人软骨细胞体外单层培养老化过程中基因表达水平的变化，初步探索人软骨细胞老化发生的可能机制。方法 取体外培养的第1代(P)至第4代(P4)人肋软骨细胞，观察细胞增殖率，阿利新兰(Alcian blue)法定量检测硫酸软骨素蛋白聚糖聚集体(aggrecan)中糖胺多糖(GAGs)含量，RT-PCR分析Ⅰ、Ⅱ型胶原及aggreean基因表达量，以观察人软骨细胞体外老化过程。并采用DNA微阵矩技术对P1及P4软骨细胞表达差异的基因进行比较分析，P1及P4人肋软骨细胞基因表达水平差异≥2倍时，被认为差异具有显著性。结果 P4软骨细胞从细胞增殖率，细胞中GAGs含量，Ⅱ型胶原及aggrecan基因表达量分析均明显低于P1软骨细胞(P＜0．01)。在1000点的含有原癌基因、抑癌基因、细胞凋亡、应激反应蛋白基因和免疫相关基因的芯片分析中，P1及P4间存在差异的基因共36个，其中在P4中下调的基因11个，主要为细胞外基质、生长因子转录因子等，而在P4中上升的基因共25个主要为蛋白酶类、炎症因子及凋亡相关基因等。结论 P4软骨细胞呈现老化特征，通过DNA微阵矩技术发现P4老化细胞中基质合成相关基因表达下降，而降解酶类基因表达上升，致细胞外基质减少。且细胞增殖有关基因表达的减少及凋亡因子的增加，老化细胞增殖率下降；     

鞘内移植hPPE修饰INPC对大鼠慢性神经病理性疼痛的镇痛效应

目的评价人前脑啡肽原基因(hPPE)修饰永生化大鼠神经前体细胞(INPC)对大鼠慢性神经病理性疼痛的镇痛效应。方法成年雌性Wistar大鼠40只,随机分为5组,Naive组大鼠不进行任何处理;Sham组大鼠仅暴露右侧坐骨神经分支;SNI组大鼠右侧后肢行保留性神经损伤(SNI)手术; INPC组和INPC/hPPE组大鼠分别于SNI术后1周鞘内移植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)标记的INPC或INPC/hPPE细胞。持续观察大鼠疼痛行为学,分别于SNI术前,SNI术后1周～细胞移植后8周内每周测定大鼠50%机械缩爪阈值(MWT)和热缩爪潜伏期(TWL)。于细胞移植后8周,取大鼠L_(4～6)脊髓组织,测定移植细胞5-BrdU、亮氨酸脑啡肽的表达,测定hPPE mRNA表达和亮氨酸脑啡肽的分泌。结果与Naive组比较,SNI组、INPC组SNI术后1周大鼠出现疼痛行为学改变,MWT和TWL降低,并持续到细胞移植后8周;细胞移植后1周,INPC/hPPE组大鼠痛觉异常症状明显减轻,MWT和TWL升高,到细胞移植后2周已基本恢复至正常水平。INPC组和INPC/hPPE组脊髓背角软脑膜和浅层中均可检测到5-BrdU免疫染色阳性细胞;INPC/hPPE组hPPE mRNA表达和亮氨酸脑啡肽的水平高于其它4组(P<0.05)。结论SNI诱导的慢性神经病理性疼痛大鼠鞘内移植hPPE修饰INPC后,可持续分泌高水平的亮氨酸脑啡肽,产生明显的镇痛效应。     

hHGF基因修饰对MSCs移植改善重度肺动脉高压大鼠肺微血管稀薄作用的影响

目的 评价人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰对骨髓间质于细胞(MSCs)移植改善重度肺动脉高压大鼠肺微血管稀薄作用的影响.方法 将原代培养的F344大鼠MSCs转导携带HGF基因的慢病毒载体和空载体,以获得HGF-MSCs和EGFP-MSCs.7周龄近交系雄性F344大鼠,体重180 ～ 250 g,采用野百合碱复合单肺切除法建立重度肺动脉高压大鼠模型.取重度肺动脉高压大鼠66只,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=22):对照组(C组)、空载体慢病毒转导的MSCs(EGFP-MSCs)组(E组)和hHGF转导的MSCs (hHGF-MSCs)组(H组).C组经颈外静脉注射DMEM1ml,E组注射含5× 105个EGFP-MSCs的DMEM 1 ml和H组注射含5×105个hHGF-MSCs的DMEM 1ml.注射野百合碱后45 d内进行生存分析;颈外静脉注射后2周,记录平均肺动脉压(MPAP),计算有心室肥厚指数,观察肺组织MSCs分布情况,测定肺组织鼠肝细胞生长因子(rHGF)和hHGF蛋白的含量,测定Ⅷ因子的表达情况以计算肺微血管密度,并行肺动脉钡剂灌注造影.结果 C组和E组肺组织均未检测出hHGF.与C组比较,E组和H组MPAP和右心室肥厚指数降低,肺组织rHGF蛋白含量、肺微血管密度和生存率升高(P＜0.01).与E组比较,H组MPAP和右心室肥厚指数降低,肺组织rHGF蛋白含量、肺微血管密度和生存率升高(P＜0.01).E组和H组肺内均可见大量绿色荧光的MSCs分布.肺动脉钡剂灌注造影显示,H组末梢血管灌注背景明显多于E组和C组.结论 hHGF基因修饰可促进MSCs移植改善重度肺动脉高压大鼠肺微血管稀薄的作用.     

Introduction of wild-type p53 gene downregulates the expression of H-ras gene and suppresses the growth of bladder cancer cells

Retroviral vectors were used to introduce the wild-type p53 gene into human bladder cancer cell lines BIU-87 and EJ, which express endogenous wt-p53 gene and have a mutation in H-ras gene. The expression of the exogenous wt-p53 gene in cells suppresses the growth of the bladder cancer cells in standard culture and in soft agar and blocks the cell cycle progression in G1. The BIU-87 and EJ cells developed tumors with average volumes of 6.53 cm³ and 6.61 cm³ in nude mice in 9 weeks after inoculation, while the cells transduced with wt-p53 gene failed to form tumors. The expression of H-ras gene in bladder cancer cells was reduced at mRNA level. These results suggest that the overexpression of the wt-p53 gene suppresses the expression of mutant H-ras gene and inhibits the tumor cell growth in vivo and in vitro.     

稳定表达重组成人型和胎儿型乙酰胆碱受体细胞株的构建

目的 稳定表达重组成人型乙酰胆碱受体(ε-nAChR)和胎儿型乙酰胆碱受体(γ-nAChR)细胞株的构建.方法 通过亚克隆技术将含有乙酰胆碱受体亚基基因的原核细胞表达质粒pSP65a、pSP65β、pSP64γ、pSP65δ和pBssKε分别连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1构建阳性重组子pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDAN3.1γ、pcDNA3.Iδ及pcDNA3.1ε,并将含有α、β、δ、ε或α、β、δ、γ亚基基因的重组子按摩尔比2:1:1:1(质粒总量<1.5μg)转染HEK293细胞.采用G418筛选出有ε或γ亚基基因表达的阳性细胞株,再采用免疫荧光法筛选出表达ε-nAChR或γ-nAChR的细胞株,进一步采用全细胞膜片钳技术选出乙酰胆碱诱发ε-nAChR或γ-nAChR产生内向电流的细胞株.结果 酶切鉴定结果显示pSP65α、pSP65β、pSP64γ、pSP65δ和pBssKε均正确定向插入pcDNK3.1.未传代、连续传10代及冻存并复苏的表达ε-nAChR和γ-nAChR的细胞株均可呈现稳定的免疫荧光,荧光主要分布在细胞膜表面.乙酰胆碱刺激后,6株转染ε-nAChR的细胞上记录到100～400 pA内向电流,3株转染γ-nAChR的细胞上记录到200～600 pA内向电流.结论 成功构建出稳定表达ε-nAChR和γ-nAChR的细胞株.