套式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫方法的建立及其应用研究

目的建立简便、灵敏、低成本的恶性疟原虫与间日疟原虫套式PCR检测方法,并探讨应用于间日疟原虫实验室检测的效果。方法制备抗凝静脉血的干滤纸血滴标本,采用干滤纸5%Chelex-100煮沸法提取疟原虫DNA,并进行套式PCR反应;通过比较PCR检测结果与疟原虫镜检结果,评价套式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫方法的效果。结果在42份样本中,有34份血样PCR检测结果与镜检结果一致,占81%;5份镜检结果无法判断的血样,PCR检测为阳性或阴性;2份镜检结果为阴性的血样,套式PCR检测为阳性。结论套式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫结果可靠,比镜检方法灵敏,有望在疟疾的实验室诊断中得到应用。     

军团菌PCR检测中模板制备优化

对8种常见的模板制备方法进行了探讨和改良,结果显示在军团菌PCR检测中,对临床血标本的处理以煮沸-离心法最优,它可促使军团菌PCR操作步骤简化,时间缩短,成本降低,且敏感、稳定.     

一种快速检测副溶血弧菌的PCR方法

目的建立一种简便、快速、准确检测副溶血弧菌的方法。方法根据Genbank收录的副溶血弧菌tlh基因序列设计合成引物 ,扩增tlh基因 ,用该方法检测副溶血弧菌标准株和分离株。结果用快速检测副溶血弧菌的PCR方法 ,菌液稀释到 2 .4× 10 2 cfu·mL- 1作PCR仍可扩增出目的片断 ;所有副溶血弧菌标准参考株及待检的副溶血弧菌均可扩增出一大约 130 0bp的特异条带 ;将扩增的tlh基因测序结果与Genbank中已收录的tlh基因序列比较 ,两序列的同源性达99%。结论该检测方法快捷、特异性好、敏感性高 ,可以作为副溶血弧菌的常规检测方法     

军团菌PCB检测中模板制备优化

对 8种常见的模板制备方法进行了探讨和改良 ,结果显示在军团菌PCR检测中 ,对临床血标本的处理以煮沸 -离心法最优 ,它可促使军团菌PCR操作步骤简化 ,时间缩短 ,成本降低 ,且敏感、稳定     

两种方法制备标准品的荧光定量PCR法检测细菌结果分析

目的 目前细菌定量检测提取细菌基因组多采用裂解法,此方法在提取基因组过程中部分基因组丢失。荧光定量PCR定量检测细菌常采用纯化的PCR产物制备标准品,但用这种标准品制备标准曲线没有考虑基因组提取过程中基因组丢失问题,检测结果偏低。本研究使用细菌直接计数法制备标准品,力争减少提取基因组过程中部分基因组丢失造成的误差。方法脆弱类杆菌作为试验菌株,用细菌直接计数法和纯化PCR产物制备标准品,检测用细菌计数法获得的细菌基因组,用统计学软件分析两种方法得到的检测结果。结果用两种不同的标准品作荧光定量PCR检测1000个细菌基因组μL-1的标本,细菌计数法制作标准品测得的结果是763.8个细菌基因组μL-1,普通PCR产物制作标准品测得的结果是112.9个细菌基因组μL-1,统计软件SPSS10.0分析结果表明,使用两种不同的标准品,荧光定量PCR检测结果差别显著(p<0.05)。结论使用细菌直接计数法制备标准品比用PCR产物制备标准品作荧光定量PCR检测细菌标本的结果更接近实际结果。     

多重qPCR检测疟原虫方法的建立及应用评价

目的 建立一种能检测4种疟原虫多重qPCR(multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction)方法,并对其进行临床应用评价。方法 以4种疟原虫18S rRNA基因作为靶序列,在保守区域设计双侧扩增引物,根据4种疟原虫特异性区域分别设计荧光探针,建立多重qPCR检测方法,并测试其特异性、敏感性,同时应用该方法对疟疾或疑似疟疾的临床血样进行检测。结果 建立检测4种疟原虫多重qPCR方法具有良好的特异性与敏感性,检测下限可达10拷贝/μl。该方法对浙江省2020年—2021年115份疟疾或疑似疟疾的临床血样进行检测,结果与疟疾分子诊断参考方法巢式PCR一致,临床特异度与敏感度均为100%。结论 本研究所建立的检测4种疟原虫多重qPCR方法简单快速、特异性好、敏感性高,可应用于疟疾临床病原诊断和参比实验室样本复核。     

实时荧光定量PCR法在低密度疟原虫感染病例中的应用研究

目的 运用实时荧光定量PCR法对低密度疟原虫患者血样进行基因检测,分析其检测效果。方法 选取恶性疟原虫患者和间日疟原虫患者抗凝全血标本各1份,制作厚血膜血片,计算其原虫密度。再以健康人“O”型抗凝全血为稀释液按照1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384比例分别稀释,制作成7个浓度梯度血样。每个浓度血样分别制备1张厚血膜血片和提取1份疟原虫DNA,分别采用显微镜观察、实时荧光定量PCR法检测其疟原虫感染情况。结果 恶性疟原虫血片厚血膜显微镜法、实时荧光定量PCR法的检出区间分别为12.44~49.76个疟原虫/μL血、3.11~12.44个疟原虫/μL血;间日疟原虫血片厚血膜显微镜法、实时荧光定量PCR法的检出区间分别为45~180个疟原虫/μL血、2.81~11.25个疟原虫/μL血。结论 实时荧光定量PCR法对低密度疟原虫检出限明显高于显微镜检查,可有效解决目前低密度感染以及服用抗疟药后难检测、难鉴别疟原虫的问题,指导合理用药。     

3种高发致病菌多重PCR快速检测方法建立

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是目前最常用的病原菌分子生物学检测方法。近年来在PCR的基础上发展了多重PCR(multiplex PCR,MPCR)技术,能在同一反应体系中同时对多个目的基因片段进行检测,进一步缩短了检测时间并提高了检测效率。     

两种染色方法疟原虫镜检效果比较

疟疾是一种严重危害人类健康的寄生虫病。人体疟原虫有4种:间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。我国间日疟较常见,恶性疟次之,但对人体危害较间日疟严重,三日疟偶尔发现,卵形疟已无病例报告。随着人口流动性加大,我国输入性疟疾病例也不断增加,及早的通过镜检发现疟原     

Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较

目的:通过对两种DNA提取方法的比较,寻找一种灵敏、快速、经济实用的提取方法.方法:采用Chelex-10{3法和碱性裂解法分别提取不同浓度大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA,利用通用引物扩增16SrDNA片段检测两种方法的灵敏度.结果:碱性裂解法提取的不同浓度的两种细菌DNA,经PCR扩增均未显出目的条带;chelex-100法提取不同浓度的两种细菌DNA均扩增出目的条带,PCR检测大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的灵敏度均为1.2×101cfu/ml,电泳结果提示相同浓度的大肠杆菌被提取到的DNA含量比金黄色葡萄球菌的含量高.结论:Chelex-100法操作简便,可用于细菌DNA的快速提取.     

RAPD-PCR技术筛选间日疟原虫基因标记

目的建立并优化间日疟原虫RAPD-PCR方法，筛选间日疟基因标志。方法采集5例间日疟病人、4例非间日疟病人和5名健康者血样并提取DNA，用随机引物进行RAPD-PER扩增、改变各项反应条件进行RAPD-PER方法的优化，10条不同的随机引物（S60-S69）检测各种血样并筛选间日疟特异性扩增条带。结果在MgCl2浓度为2．0mmol／L、dNTP浓度为150μmol／L、引物浓度为0．2μmol／L、TaqDNA聚合酶为1U和36℃的退火温度时进行RAPD-PCR扩增效果最好。所用10条随机引物中的S62、S65、S69在检测血样中分别筛选出3、1、1条间日疟所仅有的扩增条带。结论在优化的反应条件下，RAPD-PCR方法的稳定性、重复性好。筛选出3条随机引物获得5条间日疟仅有的RAPD-PER扩增条带。     

多重荧光定量PCR检测鼠感染3种病原体的方法

目的 建立多重荧光定量PCR快速检测以鼠为宿主伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的方法,对预防3种病原体引发的疫情具有重要意义.方法 通过设计特异性引物和探针,扩增伯氏疏螺旋体23S rRNA基因,弓形虫的B1基因和恶性疟原虫的SSU基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外8种以鼠为宿主的致病菌评价检测体系的特异性;建立了同时感染3种病原体的鼠全血模拟样本检测试验,以验证方法的适用性.结果 建立自鼠血液模拟样本中同时检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的多重荧光定量PCR方法,检测3种病原体的灵敏度分别为5.5、12.8、17.2拷贝/μl,特异性强.结论 建立了多重荧光定量PCR检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫方法,缩短了检测时间,在疾病防控等方面有很好的应用前景.     

1例输入性卵形疟原虫实验室检测

目的对1例输人性疑似疟疾患者的血样进行实验室确诊。方法首先制备血涂片,吉姆萨染色后镜检疟原虫;其次对血样进行RDT检测;最后利用疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和多重PCR检测方法,对该血样进行分子生物学检测及分型。结合分子生物学检测结果,再对血片进行镜检复核。结果初次镜检结果为间日疟原虫,RDT结果为阴性。巢式PCR检测结果,仅扩增出预期大小约800bp的卵形疟条带;多重PCR（Pf／Pv）检测无特异性条带产生。重新对薄血膜复核镜检,改判为卵形疟原虫。结论综合巢式PCR、多重PCR、RDT和镜检等检测结果,确诊该患者为卵形疟原虫感染。     

A qPCR-based multiplex assay for the detection of Wuchereria bancrofti, Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax DNA

The purpose of this study was to develop real-time multiplex quantitative PCR (qPCR) assays for the simultaneous detection of Wuchereria bancrofti (Wb), Plasmodium falciparum (Pf) and P. vivax (Pv) in mosquitoes. We optimized the assays with purified DNA samples and then used these assays to test DNA samples isolated from Anopheles punctulatus mosquitoes collected in villages in Papua New Guinea where these infections are co-endemic. Singleplex assays detected Wb, Pf and Pv DNA in 32%, 19% and 15% of the mosquito pools, respectively, either alone or together with other parasites. Multiplex assay results agreed with singleplex results in most cases. Overall parasite DNA rates in mosquitoes, estimated by PoolScreen 2 software, for Wb, Pf and Pv were 4.9%, 2.7% and 2.1%, respectively. Parasite DNA rates were consistently higher in blood-fed mosquitoes than in host-seeking mosquitoes. Our results show that multiplex qPCR can be used to detect and estimate prevalence rates for multiple parasite species in arthropod vectors. We believe that multiplex molecular xenodiagnosis has great potential as a tool for non-invasively assessing the distribution and prevalence of vector-borne pathogens such as W. bancrofti and Plasmodium spp. in human populations and for assessing the impact of interventions aimed at controlling or eliminating these diseases.     

结核分枝杆菌的优化PCR检测方法的研究

〔目的〕的建立了检测结核分枝杆菌的高灵敏度和高特异性PCR扩增体系。[方法]以国内结核病人常见病原菌-结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异性抗原Pab编码基因上的419bp段作为扩增靶序列,扩增引物序列为5’-ACC、ACC、GAG、CGG、TTC、CCC、TGA-3’、5’-GAT、CTG、CCG、GTC、GTC、CCA、GGT-3’。〔结果〕变性温度选择69℃-70℃。PCR扩增体系的成份经优化,选择引物浓度为0.30μmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,MgC12浓度为3.5mmol/L。〔结果〕该体系对11株标准菌株和12株临床分离菌株提纯的染色体进行扩增,其中卡介苗、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的扩增为阳性,其他分枝杆菌为阴性。〔结论〕以提纯的染色体DNA作模板,该体系可检出5fg结核杆菌染色体DNA,相当于一个结核分枝杆菌。     

Detection of Asymptomatic Carriers of Plasmodium vivax among Treated Patients by Nested PCR Method in Minab,Rudan and Bashagard,Iran

Background

Plasmodium vivax is the most widespread species of Plasmodium in humans and causing about 80 million clinical cases annually. This study was undertaken to detect P. vivax in asymptomatic treated vivax malaria patients to trace latent/sub-patent malaria infection.

Method

The venous blood of all detected cases with P. vivax in Bashagard, Minab and Roodan Districts in Hormozgan Province from 2009 to 2010 was examined by microscopic and nested PCR methods for presence of the parasite.

Results

In microscopic examination of peripheral blood smears, all samples were negative for the presence of the parasites. But, we detected two P. vivax related bands in the electrophoresis of the nested PCR products (120 bp).

Conclusion

Following up the malaria cases after treatment by a combination of methods, or new diagnostics such as RDTs can be included in the priorities of malaria elimination program in Iran.     

聚合酶链反应技术在从业人员体检中的应用

[目的]综合运用聚合酶链反应技术与常规技术的检测手段,提高行业从业人员体检中的阳性检出率。[方法]通过聚合酶链反应技术和常规技术相结合的综合检测手段与单纯的常规技术检测手段进行比对,观察分析阳性检出率情况。[结果]聚合酶链反应技术和常规技术相结合的综合检测手段,其阳性检出率(0.85‰)高于单纯常规技术检测手段的阳性检出率(0.12‰)。[结论]聚合酶链反应技术在行业从业人员体检中的应用将大大提高阳性检出率,同时还具降低检测成本和提高检测工作效率的优势。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

甲醇法制备的血模板DNA用于聚合酶链反应

建立从外周血标本制备用于聚合酶链反应的 DNA模板的甲醇法 ,并与 A/ B液法、Qiagen纯化柱法和 ISOCODE法进行比较。甲醇制备纸血片 DNA法为 :取直径为 3mm的血环 ,经甲醇固定后加去离子水 ,煮沸后离心 ,上清即为 DNA储备液。甲醇法与其它 3种制备模板 DNA的方法比较 ,具有提取的模板 DNA质量较高 ,血标本容易获得、保存且成本低 ,制备效率高 ,而且实验方法简单易行等诸多优点。