蛇麻酮通过Fas/FasL途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡机制研究

目的 探讨啤酒花 Humulus lupulus 中成分蛇麻酮 (lupulone, LP) 通过 Fas/FasL 途径诱导 HepG2 凋亡的机制。方法 体外培养人肝癌细胞株 HepG2 4、8、16 μg/mL 剂量的蛇麻酮作用 HepG2 细胞 24 h 后,采用活性检测试剂盒检测 caspase-8 相对活性,采用 Western blotting 技术检测 Fas、FasL、Caspase-3 蛋白表达情况。结果 LP 能显著提高 HepG2 细胞内 caspase-8 活性水平,并且具有剂量依赖性,其中 8、16 μg/mL LP 组与对照组比较有显著性差异 (P＜0.05)。此外,LP 能够上调 HepG2 细胞的 Fas/FasL 及 Caspase-3 蛋白表达水平,并且均具有剂量依赖性,其中 4 μg/mL 组与对照组比较均有显著性差异 (P＜0.05),8、16 μg/mL 组与对照组比较均有非常显著性差异 (P＜0.01)。结论 蛇麻酮可以通过激活 Fas/FasL,启动死亡受体途径诱导 HepG2 细胞凋亡。     

三氧化二砷启动人食管癌细胞凋亡机制研究

目的探讨三氧化二砷诱导白血病及实体瘤细胞凋亡的机制.方法以三氧化二砷敏感和不敏感人食管癌细胞株为模型,运用RT-PCR和流式细胞术检测三氧化二砷处理的这两类细胞Fas/FasL表达的改变;同时利用荧光探针检测线粒体功能变化.结果两类细胞有同等水平Fas表达,但均未检测出FasL;三氧化二砷既不能上调Fas也不能诱导FasL表达,但破坏线粒体跨膜电势和氧化-还原系统.结论三氧化二砷诱导人食管癌细胞凋亡不依赖Fas/FasL的启动,而直接作用于线粒体,活化Caspase-3导致凋亡.     

三氧化二砷启动人食管癌细胞凋亡机制研究

目的探讨三氧化二砷诱导白血病及实体瘤细胞凋亡的机制。方法以三氧化二砷敏感和不敏感人食管癌细胞株为模型,运用RT-PCR和流式细胞术检测三氧化二砷处理的这两类细胞Fas／FasL表达的改变;同时利用荧光探针检测线粒体功能变化。结果两类细胞有同等水平Fas表达,但均未检测出FasL;三氧化二砷既不能上调Fas也不能诱导FasL表达,但破坏线粒体跨膜电势和氧化-还原系统。结论三氧化二砷诱导人食管癌细胞凋亡不依赖Fas／FasL的启动,而直接作用于线粒体,活化Caspase-3导致凋亡。     

莱菔硫烷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与Fas/FasL途径的相关性研究

目的 研究莱菔硫烷对人肝癌HepG2细胞Fas、FasL、Bid蛋白表达的影响,探讨其诱导HepG2细胞凋亡过程中Fas/FasL途径的作用。方法 Caspase-8试剂盒检测莱菔硫烷对HepG2细胞Caspase-8活性的影响;流式细胞仪检测莱菔硫烷对HepG2细胞中Fas、FasL、Bid蛋白表达的影响。结果 莱菔硫烷10、20、40 μmol/L作用于HepG2细胞48 h,可显著升高HepG2细胞Caspase-8活性（P＜0.01）;可使HepG2细胞 Fas、FasL蛋白的表达显著升高（P＜0.01）;莱菔硫烷20、40 μmol/L时,可显著提高Bid蛋白的表达（P＜0.01）,上述作用均呈剂量相关性。结论 激活Fas/FasL途径可能是莱菔硫烷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的重要机制之一。     

转染肿瘤细胞总RNA的树突状细胞联合CIK细胞抗小鼠肝癌作用的实验研究

目的探讨转染小鼠肝癌H22细胞总RNA的树突状细胞(DC)疫苗体外抗小鼠肝癌的免疫作用。方法提取小鼠四肢长骨骨髓,在rmGM-CSF和rmIL-4体外刺激下增殖分化为DC。制备小鼠脾淋巴细胞,在体外经rmIFN-γ、anti-CD3、rmIL-2和rmIL-1b诱导成为细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK细胞)。制备肝癌H22细胞总RNA,体外转染DC,流式细胞仪检测转染前后的DC表面分子的表达情况。将转染H22细胞总RNA的DC和CIK细胞混合培养制备成为效应细胞,LDH释放法测定效应细胞对小鼠H22细胞、S180细胞的杀伤活性。结果经H22细胞总RNA转染后的DC,其MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子及CD83、CD86表达率明显增高,CD14表达率降低(P<0.05)。转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其对S180细胞的杀伤率(P<0.05)。转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其他各组效应细胞对H22细胞的杀伤率(P<0.05)。结论转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞具有高效而特异性的体外抗小鼠肝癌免疫作用。     

Fas、FasL在大鼠肝癌中的表达及意义

目的:研究Fas、FasL在大鼠肝癌中的表达及其与细胞调亡和肿瘤发生、发展的关系.方法:应用免疫组织化学方法,对41只大鼠肝组织中的Fas及其配体FasL表达进行检测比较,其中34只经过暴露黄曲霉毒素B1(AFB1),28只出现癌变,6只未出现癌变,7只未经处理.结果:出现癌变大鼠肝组织和未出现癌变大鼠肝组织中的Fas表达率分别为25.0%、69.2%(P＜0.05).而FasL表达率分别为32.1%、53.8%(P＞0.05).结论:大鼠肝癌组织中Fas表达率要比未出现癌变的大鼠肝组织的表达率降低,Fas的低表达在大鼠肝癌的形成中可能起着重要的作用.     

细胞凋亡相关基因Fas和FasL在大鼠苯巴比妥促肝癌过程中的表达研究

肿瘤发生是机体自稳态破坏,细胞异常过度增生,逃避免疫监视的结果。通过Fas(Apo-1)受体和Fas配体(FasL)介导的细胞凋亡,被认为是机体保持自稳态的重要机制之一。近年来的研究发现,Fas/FasL系统与肝癌的发生、发展和预后有密切关系。本实验研究了Fas及FasL在实验性大鼠肝癌促癌过程中的表达及作用。     

自体CIK细胞治疗肝癌患者的护理

肝癌在我国是一种多发性肿瘤,且大多数合并严重肝硬化,易发生肝内播散和转移,严重危害人们的健康.肝癌患者经手术、化疗及放疗后难以改变患者的生存质量,且预后极差[1].我院生物治疗研究中心研究发现,细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)具有较强的体内外抗肝癌细胞活性CIK细胞毒活性和细胞增殖力可以满足过继免疫治疗中抗肿瘤细胞的要求[2,3] CIK细胞成为肝癌手术、放疗、化疗后的一种新的治疗模式.我院自2001年11月开始成功地应用于肝癌的临床治疗.CIK细胞治疗后的肝癌患者免疫活性细胞的检测表明,CIK细胞治疗可提高肿瘤患者的细胞免疫功能,提高对肿瘤细胞的杀伤作用[4],且有较好的疗效和很好的安全性[5].     

CIK细胞联合TACE治疗原发性肝癌的随机对照研究

目的评价CIK细胞免疫疗法联合TACE治疗肝癌的疗效。方法采用随机数字表将118例确诊HCC分为单纯TACE组及联合CIK组。主要评价治疗后疾病进展时间(TTP)及随访1年、3年总生存率。结果 TACE组TTP平均4.7个月,1、3年生存率分别为51.7%、11.6%。CIK-TACE组TTP平均10.7个月,1、3年生存率分别为86.3%、46%。结论 TACE联合CIK细胞免疫治疗可以更好控制肝脏肿瘤病变,延长生存期。     

CIK细胞在晚期肝癌治疗中的应用(附13例报告)

CIK(cytokine induced killers)细胞是新近发展起来的过继免疫细胞,由于它具有增殖速度快,抗肿瘤能力高,而且在细胞的数量上能满足临床的需要,因而在临床具有较好的应用前景.     

CIK细胞体外逆转多药耐药性的研究

目的:研究CIK细胞体外逆转多药耐药(multidrug resistance,MDR)可行性。方法:用人外周血分离出的单个核细胞,在不同细胞因子诱导下培养成细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)及树突状细胞(DC),然后将其与成熟DC进行共培养,作为效应细胞,以K562敏感株与耐药细胞株为靶细胞进行体外逆转研究。流式细胞术检测靶细胞的P-gp表达及细胞内的ADR相对含量,MTT法测定其细胞毒作用,RT-PCR检测mdr-1基因耐药性逆转表达状况。结果:K562/ADR耐药细胞株ADR含量经效应细胞细胞作用后,细胞内的ADR含量分别提高了13.80%、39.50%,(P<0.01);,P-gp分别降低12.00%、42.69%,(P<0.01),mdr-1基因表达呈下调趋势,效应细胞对靶细胞的细胞毒作用分别达45.8%、78.9%,(P<0.01)。结论:CIK+K562/ADR-DC对P-gp高表达K562/ADR耐药细胞株具有特异性的细胞毒作用,有效提高了细胞内的ADR含量,下调了P-gp、mdr-1表达,使免疫效应细胞体外逆转多药耐药的效果得以显现。     

细胞因子诱导的杀伤细胞对Lewis肺癌细胞的抑瘤作用及抑瘤机制的研究

目的观察细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞对Lewis肺癌细胞增殖和Lewis肺癌移植瘤生长的抑制作用,探讨其抑瘤机制。方法常规方法培养CIK细胞,以CIK细胞为效应细胞,Lewis肺癌细胞为靶细胞,以不同效靶比共同培养,MTT法检测细胞增殖情况,同时电镜观察Lewis肺癌细胞形态特征改变;流式细胞仪检测Lewis肺癌细胞的凋亡;免疫细胞化学法检测并比较FasL在单个核细胞和CIK细胞表面的表达;用MTT法检测抗FasL单克隆抗体对CIK细胞杀伤Lewis肺癌细胞的影响;用ELISA方法检测Lewis肺癌荷瘤小鼠脾细胞上清液中IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α浓度。结果电镜观察:CIK细胞能促进Lewis肺癌细胞凋亡超微结构的改变;流式细胞仪检测:CIK细胞组凋亡率明显高于对照组;FasL在CIK细胞表达增加;抗Fas单抗可抑制CIK杀伤Lewis肺癌细胞的活性;CIK细胞治疗的Lewis肺癌小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子水平明显高于对照组。结论CIK细胞可在体内及体外抑制Lewis肺癌细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,Fas/FasL途径在其中发挥一定作用,同时CIK细胞抗肿瘤作用可能与淋巴细胞活化和分泌细胞因子有关。     

NK细胞与CIK细胞体外诱导扩增及其活性比较

目的：探讨体外诱导和扩增NK细胞和CIK细胞的方法,比较二者的增殖能力及其对肿瘤细胞的杀伤活性。方法：提取肿瘤患者外周血单个核细胞（PBMCs）,在细胞因子诱导下培养NK细胞和CIK细胞。观察2种细胞的形态学变化,采用流式细胞术检测CD3－CD56+NK细胞和CD3+CD56+ CIK细胞比例,计算细胞扩增倍数;采用ELISA法检测NK细胞和CIK细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的水平;采用CCK-8法检测NK和CIK细胞对K562细胞株的杀伤活性。结果：经过14 d体外诱导培养后,NK细胞扩增（160.00±12.15）倍,CIK细胞扩增（110.00±15.48）倍,NK细胞的扩增能力强于CIK细胞（P<0.05）;NK和CIK细胞分泌IFN-γ量分别为（4 227.75±731.94）和（525.96±304.84） μg/L,NK细胞分泌IFN-γ的能力强于CIK细胞（P<0.01）;诱导扩增后NK和CIK细胞对K562细胞株具有较强的杀伤活性,随着效靶比的升高杀伤活性增强。在效靶比为25∶1时,NK细胞和CIK细胞对K562细胞的杀伤率分别为65.35%和57.68%,NK细胞的杀伤活性强于CIK细胞（P<0.01）。结论：在体外成功建立了NK细胞和CIK细胞的诱导扩增体系,NK细胞的扩增能力、IFN-γ分泌水平以及其对K562细胞株的杀伤作用均强于CIK细胞。     

不同因素对诱导肿瘤患者cik细胞体外增殖能力及杀伤活性的影响

目的研究不同因素对诱导细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)体外增殖能力及杀伤活性的影响。为肿瘤CIK细胞治疗提供实验依据。方法细胞计数法及MTT法测定CIK细胞的增殖能力及杀伤活性。结果低年龄组较高年龄组CIK细胞体外增殖能力及杀伤活性强;在无血清培养基条件下培养的CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性较完全培养基的强;在一定的培养时间内CIK细胞的体外增殖能力与培养的时间成正比;CIK细胞对各种肿瘤细胞均有杀伤作用。结论不同因素对肿瘤患者CIK细胞体外增殖能力及杀伤活性有影响。     

CIK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIKcells）的体外扩增特性及其在抗肿瘤免疫治疗中的作用。方法通过提取健康供血者的PBMNC,培养诱导CIK细胞,显微镜下观察其扩增倍数、增殖速率,流式细胞仪分析细胞免疫表型,用MTT法观察其对K562细胞的体外杀伤效应,并通过流式细胞仪进一步分析30例实体瘤患者CIK细胞输注前后外周血免疫活性细胞表型的改变。结果经2周培养,CIK细胞平均增加了30倍,总数达（4.8～5.0）×109,活性细胞比例〉90%;体外杀伤率约50%,表型检测效应细胞CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋亚群比例显著升高,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。实体瘤患者CIK细胞输注后外周血中免疫活性细胞比例也明显升高,差异也有统计学意义（P〈0.05）。结论CIK细胞在体内外能明显抑制肿瘤生长,有效改善患者的免疫功能,为晚期肿瘤治疗提供了新的方法。     

流式细胞术检测CIK的免疫表型和体外杀伤活性

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）的免疫表型和体外杀伤活性。 方法:从健康人外周血分离淋巴细胞,经过IFNγ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的CIK。采用流式细胞术检测CIK的表型;以CFSE标记靶细胞来区分效应细胞,再以ＰＩ染色,用FACS检测靶细胞的死亡率。 结果:CIK于第22天达到增殖高峰,并高度表达CD3、CD11a、CD54和HLA-DR;中度表达CD3/CD56、CD25、CD28、CD69和FasL;CD16表达不增加。CIK对肿瘤细胞K562、 HL-60、Hela、SMMC7721和A375均表现出杀伤活性,其中对K562、HL-60、Hela 3种细胞的杀伤作用较强;而对SMMC7721、A375的作用不明显。 结论:细胞因子IFNγ、CD3McAb和IL-2体外诱导的单个核细胞具有强大的增殖力和杀伤活性。     

问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞FasL/Fas表达上调及FasL/Fas相关细胞凋亡的研究

目的：了解FasL／Fas途径参与问号钩端螺旋体（简称钩体）诱导细胞凋亡及其FasL／Fas表达水平变化。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核一巨噬细胞J774A．1模型。采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征，流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法，观察问号钩体56601株感染细胞FasL／Fas表达情况。采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL／Fas表达水平。结果：问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h时，部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象；感染24h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解。问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h和24h的凋亡率分别为53．6％和64．31％。FasL中和抗体预处理细胞后，问号钩体56601株感染细胞4h或24h的凋亡率分别为10．27％和15．90％。J774A．1细胞被问号钩体56601株感染后4和24h，FasL表达率分别从感染前的4．19％上升至21．69％和65．70％，Fas表达率分别从感染前的12．88％上升至91．96％和88．01％。结论：诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A．1细胞的重要机制。问号钩体可上调靶细胞FasI。／Fas表达水平；并通过FasL／Fas途径诱导J774A．1细胞凋亡。     

大蒜素诱导THP-1细胞凋亡的作用及机制

目的:探讨大蒜素对急性单核细胞白血病细胞株THP-1凋亡及凋亡基因Fas/FasL表达的影响。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定大蒜素对THP-1细胞增殖抑制率;AO/EB染色观察细胞凋亡形态;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测凋亡率的变化;FCM检测细胞凋亡率和细胞周期分布;免疫细胞化学法和Western blot观察细胞Fas、FasL蛋白表达。结果:MTT显示大蒜素能抑制THP-1细胞增殖,呈时间-剂量依赖性,72h中效浓度(IC50)为12.8mg/L。Annexin V-FITC/PI检测凋亡率随大蒜素浓度增加而增加。6.4、12.8mg/L大蒜素作用THP-1细胞72h后,FCM检测G0/G1期细胞比率明显上升,而S期比率明显下降,均出现凋亡峰,凋亡率分别为(22.93±2.93)%和(36.73±2.88)%,呈剂量依赖性,与对照组比较有显著差异(P<0.01)。在荧光显微镜下可区分早、晚期凋亡细胞、活细胞和坏死细胞。免疫组化显示大蒜素作用后Fas/FasL蛋白上调,主要分布在细胞浆和细胞膜。Western blot结果显示Fas/FasL蛋白表达量随大蒜素浓...     

清热化瘀方提取物预处理对大鼠脑缺血耐受作用及Fas/FasL表达的影响

目的：探讨脑缺血耐受机制及清热化瘀方作为预处理药物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法：采用线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血预处理模型和再灌注模型。取健康雄性SD大鼠40只，随机分为假手术组、单纯脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组、药物预处理组。再灌注后以免疫组化法测定Fas／FasL蛋白表达。TUNEL法检测细胞凋亡。结果：药物预处理能够抑制梗死后Fas／FasL表达（P〈0．05），其作用程度与缺血预处理接近；药物预处理能抑制缺血半暗区神经元凋亡（P〈0．05）。其作用程度与缺血预处理相当。结论：脑缺血预处理可能通过抑制促凋亡蛋白Fas／FasL的合成发挥其神经保护作用，Fas／FasL是脑缺血耐受机制之一；清热化瘀方通过下调脑缺血后Fas／FasL的表达而减轻再缺血后神经元凋亡。     

CIK细胞及LAK细胞对小鼠克洛氏肉瘤作用的实验研究

通过向ＰＢＭＣ中加入ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－α及抗ＣＤ３单克隆抗体,诱导出高效免疫活性细胞因子激活的杀伤细胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｕｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ,ＣＩＫ）,并建立了小鼠克洛氏肉瘤（Ｓ１８０）荷瘤动物模型,证实ＣＩＫ过继免疫疗法具有显著的抗肿瘤作用,其抑瘤率可达７８％;并同时以ＬＡＫ细胞作为对照,ＬＡＫ组的抑瘤率为３３．７０％,明显低于ＣＩＫ组１３．３０％（Ｐ〈０．０５）