磁探针标记人内皮型一氧化氮合酶基因修饰的内皮祖细胞及其体外磁共振成像实验研究

目的 人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)基因体外修饰兔外周血来源的内皮祖细胞(EPC)后,应用纳米磁探针三氧化二铁(Fe2O3)-精氨酸(arginine)复合物体外标记基因修饰的EPC,磁共振(MR)进行标记细胞成像.方法 制备Fe2O3-arginine复合物.分离兔外周血单个核细胞,贴壁法筛选出EPC,传代培养,用脂质体LipofectamineTM2000体外转染heNOS基因至EPC,转染后48 h对基因修饰EPC进行磁探针标记,普鲁士蓝染色显示细胞内铁,Western blot检测heNOS基因表达情况,四氮噻唑蓝(MTT)比色试验评价磁探针标记基因修饰EPC后对细胞生长状况的影响,流式细胞分析检测标记、未标记细胞的凋亡,应用磁共振的T1WI、T2WI、T2*WI3个序列进行细胞群成像.结果 普鲁士蓝染色可见铁颗粒位于细胞质内,标记率与标记的未修饰基因组EPC相似,都接近100%.MTT比色试验示Fe2O3-arginine标记后3、4、5天,标记的基因修饰细胞组、未修饰基因细胞组的吸光度值与未标记者比较,差异无统计学意义.流式细胞分析结果 显示Fe2O3-arginine标记后细胞凋亡与未标记细胞间差异无统计学意义.磁共振成像显示标记的基因修饰细胞群信号强度的变化与标记的未修饰基因细胞相似,两者之间差异无统计学意义,且两者均较未标记细胞群信号低,以T2*WI的信号强度变化率最大,标记后7 d的信号强度变化率均较标记后1 d者下降.结论 使用脂质体可以成功地将外源heNOS基因转染进兔外周血EPC中并在某中有效表达,Fe2O3-arginine可以有效标记heNOS基因修饰的EPC,其对细胞的活力、增殖等生物学特性无明显影响.临床应用型1.5T MR可在体外进行标记细胞群成像,间接反映干细胞的数量和分裂增殖状态.     

小鼠脾源性内皮祖细胞培养及7.0T磁共振单细胞成像初探

目的 建立一种小鼠脾源性内皮祖细胞的培养方法,探讨7.0T磁共振(7.0T MR)系统对磁标记单细胞成像的可行性.方法 密度梯度离心法分离脾脏单个核细胞,诱导培养得到内皮祖细胞(EPC).免疫化学、荧光染色鉴定细胞特性.Fe_2O_3-PLL标记细胞,普鲁士蓝染色,MTT法评价Fe_2O_3-PLL对细胞生长的影响,邻菲啰啉法定量分析细胞内铁含量.7.0T MR不同序列体外单细胞成像.结果 小鼠脾脏单个核细胞经体外诱导培养呈内皮细胞形态,表达EPC表面标志物CD31、CD34、vWF,显示内吞乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)、结合凝集素1(UEA-1)等内皮细胞的功能.MTT检测Fe_2O_3-PLL标记对细胞增殖活力影响不明显,标记组与未标记组吸光度(A)值比较第4天至第7天差异均无统计学意义(第4天,t=2.81;第5天,t=-1.87;第6天,t=-0.298;第7天,t=-0.115;P均＞0.05).磁标记单细胞能够在7.0T MR检测中成像,自旋回波序列(MSME)图像中标记细胞显示灰度高于梯度回波序列(2D-FLASH),MSME序列图像标记细胞平均导致信号缺失体素个数为20.2个,而2D-FLASH序列图像为30.1个,差异具有统计学意义(t=15.2,P＜0.05).结论 小鼠脾脏单个核细胞可诱导分化为EPC.在7.0T MR检测中Fe_2O_3-PLL标记的EPC能够实现体外单细胞成像.     

超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞心肌移植的磁共振成像研究

目的探讨应用磁共振（MR）进行干细胞活体心肌内成像的可行性。方法从猪骨髓抽取、分离、培养间充质干细胞（MSC）,用含超顺磁性氧化铁纳米颗粒（铁羧葡胺）的DMEM培养液孵育24h,并用二脒基苯基吲哚（DAPI）和PKH。进行荧光标记。然后将MSC经心外膜直接注入猪急性梗死心肌内,每头猪注射3点。根据每注射点细胞数量以及细胞是否铁标记,12头猪随机分成4组：2×10^6标记细胞组（n=3）、1×10^6标记细胞组（n=3）、5×10^5标记细胞组（n=3）和1×10^6未标记细胞组（n=3）。细胞移植后20—24h行猪心脏1．5TMR成像,1h后处死并根据MR成像图像切取心肌组织行普鲁士蓝染色和免疫荧光检查。结果（1）体外标记：普鲁士蓝染色见标记MSC内大量蓝色颗粒,标记率为100％,电镜证实含铁囊泡位于胞质内。（2）MR成像：注射铁标记细胞的三组（9头猪）进行活体心脏快速小角度翻转梯度回波（T2·WI—Flash 2d）序列成像,发现移植部位均呈明显的低信号,而且注射点信号缺失区的面积大小与回波时间和移植细胞数量有关;而快速自旋回波（T2WI—FSE）序列成像仅隐约可见低信号区甚至难以辨认,但显示梗死病灶和猪心脏结构比T2·WI-Flash 2d序列清晰。未标记细胞组（3头猪）的9个注射点心肌壁均未显示MR低信号区。（3）组织学检查：MR成像低信号区心肌病理学检查见普鲁士蓝染色、DAPI和PKH26三重阳性细胞存在。结论应用磁共振对超顺磁性氧化铁标记的干细胞进行活体心肌内成像是可行的。     

利用内皮祖细胞制备组织工程血管的实验研究

目的:观察内皮祖细胞（endothelial progen itor cells,EPCs）在去细胞血管段上的再内皮化效果,探讨其组织工程学应用前景。方法:采用贴壁选择法培养人外周血EPCs,VEGF扩增分化,流式细胞仪分析培养细胞CD34、VE-Cadherin的表达,D iI-ac-LDL吞噬试验、Ⅷ因子相关抗原免疫组化及细胞形态观察证实培养细胞的内皮属性。采用球囊损伤法制备去内膜兔腹主动脉段,去内皮兔腹主动脉段体外培养3周使之去细胞,与人外周血EPCs共孵育制备再内皮化异种去细胞血管段。结果:体外成功培养出人外周血内皮祖细胞,EPCs与去细胞血管段共培育使之再内皮化,形成新内膜。结论:体外培养EPCs可制备再内皮化的异种去细胞血管段,提供了一种制备组织工程血管的新方法。     

菲立磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植的MR成像

目的:探索标记细胞肝内移植后磁共振威像技术.方法:获取猪自体骨髓间充质干细胞,分离、培养.应用菲立磁(Feridex)标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,标记细胞组n=6)和未标记细胞组(n=4)行经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6h、3 d、7d行磁共振T1WI,T2WI,T2*WI序列成像,同时行组织切片普鲁士蓝染色结果:普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100%,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2*WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后7 d,组织切片普鲁士蓝染色显示7 d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝血窦中.结论:利用Feridex可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,肝脏移植后行磁共振可以对标记细胞进行活体成像.     

内皮祖细胞参与兔动脉瘤模型血管的修复

目的探讨内皮祖细胞（EPCs）是否参与兔动脉瘤血管损伤的修复过程。方法取清洁级兔10只,利用弹性酶诱导动脉瘤模型。按照EPCs回输方式不同,随机分为颈动脉原位回输组和耳缘静脉回输组,每组5只。自体培养EPCs后,用Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）对细胞进行双标记。采用荧光染色、HE染色、免疫组化等方法分析EPCs参与新生内膜修复的过程。结果①培养的EPCs经Hoechst33342和CFSE双标记后,颈动脉原位回输组自体回输EPCs（1．45±0．09）×10^6个,耳缘静脉回输组自体回输EPCs（1．47±0．17）×10^6个。②颈动脉原位回输组的动脉瘤内血栓中及新生内膜内均可见双标记的细胞直接黏附（5／5）,内膜表面未见内皮细胞生长。③静脉回输组的部分动脉瘤壁新生内膜内（非内膜表面）可见到双标记细胞（3／5）,未见有内皮细胞生长。④两组动脉瘤组织的HE染色均未见内膜上皮样细胞分布,免疫组织化学均显示内膜Von Willebrand因子（vwF）染色阴性。结论EPCs参与了动脉瘤损伤血管的早期内膜修复,但未以转化成内皮细胞形式参与修复。     

磁共振成像R2*map示踪超顺磁性氧化铁标记的内皮祖细胞

目的 探讨R2*map在超顺磁性氧化铁(SPIO)标记内皮祖细胞(EPCs)定量检测中的价值.方法 分离和培养Balb/c小鼠后肢骨髓来源的EPCs,培养7 d,用细胞膜红色荧光探针标记的乙酰低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素-1双阳性染色法,以及异硫氰酸荧光素标记干细胞抗原1和藻红素标记的血管内皮细胞生长因子受体2的方法上流式细胞仪进行鉴定.用50 μg/ml SPIO及6 μl/ml lipofectamine 2000与EPCs共孵育进行标记后透射电子显微镜观察;制成不同细胞浓度(0～2.0×106/ml)标记及未标记SPIO的细胞琼脂糖模型,进行3.0T磁共振扫描,包括T2*map和T2map扫描,得到R2*map和R2map图像.结果 培养7d后细胞呈现内皮祖细胞特征.SPIO标记的EPCs细胞结构与未标记细胞相比较,无明显改变.R2*和R2值与标记SPIO的细胞浓度呈线性相关(r值分别为0.955,0.922,P值均<0.05);R2*效应明显高于R2效应(t=23.23,P<0.05).结论 磁共振成像R2*map扫描可准确定量示踪SPIO标记的EPCs.     

番茄红素上调细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1的表达促进人外周血内皮祖细胞周期进展

目的探讨番茄红素对人外周血内皮祖细胞活性、周期调控的作用及其分子机制。方法体外原代培养人外周血内皮祖细胞,采用噻唑蓝法、流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应、实时聚合酶链反应和Western blot方法检测番茄红素对内皮祖细胞活性、细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1的表达情况。结果噻唑蓝比色实验显示,不同浓度(0.01、0.1、1μmol/L)番茄红素能显著增加内皮祖细胞的生长能力,且呈一定的量效与时效关系;流式细胞仪分析显示,番茄红素呈浓度依赖性使内皮祖细胞的G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增多;逆转录聚合酶链反应、实时聚合酶链反应和Western blot分析表明,番茄红素呈浓度依赖性使内皮祖细胞中细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1表达上调。结论番茄红素对内皮祖细胞的促进生长作用,可能与上调细胞周期素依赖性激酶4、细胞周期素D1的表达,使G0/G1期细胞比例减少有关。     

老年稳定型心绞痛患者外周血中内皮祖细胞变化及其影响因素

目的观察老年稳定型心绞痛（SA）患者外周血中内皮祖细胞（EPCs）数量及功能的变化，初步探讨心血管危险因素对其影响。方法选择老年SA患者和年龄匹配的对照者各20例，用密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞，用流式细胞仪测量外周血中CD＋细胞以鉴定EPCs，并进一步用倒置荧光显微镜鉴定FITC标记荆豆凝集素Ⅰ（FITC—UEA—Ⅰ）和DiⅠ标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiLDL）双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。采用黏附能力测定试验、改良Boyden小室和体外血管生成试剂盒分别观察EPCs的黏附能力、迁移能力和体外生成血管能力。结果老年SA患者外周血中EPCs数量明显低于对照组，其黏附能力、迁移能力和体外生成血管能力也明显受损。SA组患者EPCs数量与收缩压、空腹血糖水平呈负相关。结论老年SA患者外周血中EPCs数量降低且功能减退，其数量降低与高血压、糖尿病有关。     

黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞增殖及NO生成的影响

目的观察黄芪多糖（APS）对2型糖尿病（T2DM）患者外周血内皮祖细胞（EPCs）增殖和NO生成的影响,并探讨其机制。方法密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7 d后鉴定EPCs,检测APS对T2DM组EPCs增殖的影响。观察APS对T2DM组EPCs NO浓度影响的时效和量效关系,然后予磷脂酰肌醇三磷酸激酶（PI3K）抑制剂LY294002和APS共培养,检测NO浓度。结果 APS在一定剂量和时间范围内能促进T2DM组EPCs增殖（P〈0.05）,并呈剂量和时间依赖性地升高EPCs NO浓度;PI3K抑制剂LY294002能阻断APS升高的NO水平（P〈0.05）。结论鼠尾胶原可代替EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs更节省的一种方法。APS能促进EPCs增殖,并促进其NO的生成,PI3K抑制剂LY294002能阻断APS引起的NO的生成。     

兔外周血与骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及生物学特性的研究

目的:探索并建立兔内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、鉴定方法。方法:采用密度梯度分离法分别从兔外周血和骨髓中分离出单个核细胞,接种于预包被明胶的培养瓶,并应用培养基(EBM-2)诱导培养,诱导分化为EPCs;在倒置显微镜下观察两种源性细胞生长过程;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种源性获得的EPCs增殖情况;采用免疫荧光染色观察EPCs相关抗原CD34、CD31、CD133及vWF因子的表达。结果:两种源性EPCs均于培养3～4d完全贴壁,呈克隆样生长,7～9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95%。两种源性获得的第2代细胞生长曲线近似"s"形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显,外周血源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为96.48%和3.52%,骨髓源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为97.11%和1.84%。第2代EPCs进行免疫荧光鉴定结果显示:两种源性内皮祖细胞均阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达。结论:两种源性的EPCs均可高效获得且在体外稳定培养。与传统的骨髓源性EPCs相比较,从外周血源获得的EPCs是一种可靠、简便的培养方法,为组织工程学提供理想的细胞来源。     

磁共振成像示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植神经干细胞的实验研究

目的探讨MRI示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植的标记神经干细胞的分布和迁移的可行性。方法选取16只雄性SD大鼠制做脑梗死模型,随机分为标记组和未标记组,每组8只,分别于脑梗死对侧侧脑室内立体定向移植超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记和未经标记的神经干细胞。移植细胞后,不同时间点分别进行MRI连续成像观察,之后进行大鼠脑组织冷冻切片的普鲁士蓝染色。结果标记组移植后即刻的MRI即可观察到大鼠侧脑室内的移植标记细胞,移植后7天脑梗死皮质下即可见到低信号影,各对应时间点组织切片的普鲁士蓝染色与MRI结果相符。结论MRI能够在活体内连续无创的示踪观察大鼠侧脑室移植的标记神经干细胞的迁移及分布情况。     

糖基化终末产物对人外周血内皮祖细胞数量及功能的影响

目的观察糖基化终末产物(AGEs)对体外培养的人外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及功能的影响。方法体外培养的人外周血EPCs根据不同AGEs-人血白蛋白(HSA)浓度分为对照纽、正常组(终浓度7.5 mg/L)、干预1组(终浓度1 5 mg/L)干预2组(终浓度30 mg/L)和干预3组(终浓度60 mg/L)。采用密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞;激光共聚焦显微镜检测其对FITC标记荆豆凝集素-1的吸附和Dil-标记乙酰化低密度脂蛋白进行细胞功能鉴定;加入AGEs后,分别采用MTT法、Boyden小室测定EPCs的增殖、迁移能力;人纤维连接蛋白检测EPCs的黏附能力;用体外血管生成分析试剂盒检测不同浓度AGEs HSA作用后的EPCs成血管能力。结果高浓度AGEs可减少EPCs贴壁细胞数量(P<0.01),减弱EPCs的黏附(P<0.01)、增殖(P<0.01)、迁移(P<0.05)和成血管能力(P<0.01)。结论 AGEs可减少人外周血EPCs的数量并使用其功能受损。     

颈动脉硬化病人内皮祖细胞增殖和分化能力改变及其临床意义

目的观察颈动脉硬化病人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖和分化能力的改变,探讨其在颈动脉硬化发生发展中的意义。方法选择颈动脉硬化病人和同年龄组正常人各20例,密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种在培养板内,培养7d后对贴壁细胞进行鉴定,激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝血素-Ⅰ(FITC-UEA-I)和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染色阳性细胞为正在分化的EPCs细胞。四氮唑溴盐比色法(MTT)测定EPCs的增殖能力,流式细胞仪检测细胞表面CD14 ,CD64 和vWF ,测定EPCs向内皮分化能力。结果颈动脉硬化病人外周血EPCs增殖能力较正常对照组显著降低(P<0.05);与正常对照组比较颈动脉硬化组EPCs早期标志物CD14 和CD64 百分比明显升高(P<0.05),而内皮细胞分化的特异性标志物vWF 显著降低(P<0.05)。结论动脉硬化组较正常组外周血EPCs增殖能力和分化为内皮细胞的能力明显减退,血管的再内皮化的过程受损,促进颈动脉硬化的发生发展。     

葡萄糖受体介导的肿瘤靶向2-DG修饰超顺磁性氧化铁的制备及体外实验

目的 合成一种2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)包被γ-Fe2O3纳米探针,检测其性质特征及对前列腺癌PC3细胞葡萄糖受体的靶向性摄取.方法 运用化学共沉淀法合成γ-Fe2O3@二巯基丁二酸(DMSA),再与2-DG共轭生成γ-Fe2O3@DMSA-DG,红外光谱和透射电镜检测粒子结构特征;噻唑蓝试验(MTT)法进行细胞毒性实验,分别加入含无糖DMEM的探针培养基γ-Fe2O3@DMSA、γ-Fe2O3@DMSA-DG、γ-Fe2O3@DMSA-DG+ 2-DG(4.5 mg/mL),将探针在不同时间( 10 min、20 min、1h、2h)孵育PC3细胞,运用普鲁士兰染色法和铁三嗪法分析PC3细胞对探针的吸收情况,并以体外MRI观察T2WI信号强度变化.结果 2-DG以酰胺键连接γ-Fe2O3@DMSA,粒子平均直径10 mm;探针未见明显毒性;γ-Fe2O3@DMSA-DG可被PC3细胞靶向摄取,并可在早期被2-DG抑制.结论 本研究成功合成γ-Fe2O3@DMSA-DG探针,其对PC3细胞葡萄糖受体有较好的靶向性,使用临床型MR仪可对其进行监测.     

巴曲酶对体外培养下内皮祖细胞数量及功能的影响

目的探讨巴曲酶(DF-521)对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量和功能的影响。方法采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在细胞培养板中,分为对照组、低剂量干预组(DF-5210.05BU/ml)、中剂量干预组(DF-5210.1BU/ml)和高剂量干预组(DF-5210.2BU/ml)。激光共聚焦显微镜鉴定"FITC标记的荆豆凝集素"和"DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白"双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标记并进一步鉴定EPCs。MTT比色法、改良的Boyden小室及黏附能力测定EPCs的增殖、迁移和黏附能力。结果与对照组比较,不同浓度DF-521干预组均随浓度增加明显提高EPCs的数量;中剂量干预组作用24h时对EPCs的数量影响最为显著,较对照组增加近1倍(P<0.05)。DF-521对于EPCs的增殖、迁移、黏附能力也有显著的改善(P<0.05)。结论DF-521可增加体外培养条件下EPCs的数量并改善其功能。