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1.
血小板生长因子(thrombopoietin,TPO)是一种正常生理状态下的造血生长因子,它刺激造血祖细胞向巨核细胞的分化及血小板的生成和释放。该实验从6月龄人胚肝脏中分离RNA,经逆转录PCR等步骤克隆出了TPOcDNA,并进行了序列分析。将TPOcDNA亚克隆至哺乳动物细胞瞬时表达载体pCMV4,形成了重组表达质粒pCMV4/TPO。以该重组质粒转染COS7细胞,可测到TPO在COS7细胞中的瞬时表达 相似文献
2.
人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor,hEGF)具有促进表皮细胞增殖的作用,与免疫性皮肤病及创面组织修复有着密切的关系。随着分子生物学理论和技术的发展,人们对外源性基因在真核系统中表达的机理有了进一步了解〔1〕。为了进行hEGF基因的真核表达及表皮组织基因治疗方面的研究,我们采用逆转录PCR方法扩增了hEGF及其信号肽基因,并选用pBKCMV穿梭质粒构建了hEGF基因真核表达质粒。1 材料和方法1.1 主要试剂限制性内切酶NheⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及T4D… 相似文献
3.
目的:利用COS7细胞表达角质细胞生长因子(KGF)并检测其活性。方法:利用脂质体把KGF基因转入COS7细胞中,再用Western印迹和ELISA方法检测KGF蛋白的表达,然后用MTT法检测其活性。结果:KGF基因在COS7中得到了表达,并对小鼠肠上皮细胞(IEC-6)具有刺激增殖作用。结论:KGF有望成为肠型放射病治疗的新型药物。 相似文献
4.
目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达。方法:将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞,以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列,转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论:鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功,为进一步研究奠定了基础。 相似文献
5.
目的:克隆编码人CD40分子基因的全长cDNA,在COS-7细胞中获得高表达。方法:提取人B淋巴细胞看Daudi总RNA,以RT-PCR技术克隆了编码人CD40基因全长cDNA,序列测定证实其正确性。将测序正确的CD40基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺(Lipofectamine)杂COS-7细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测CD40基 相似文献
6.
目的:构建带FLAG标签的过氧化物还原酶3(peroxiredoxin3,PRDX3, PRX3)的真核表达载体,并对其在人舌癌SCC15细胞中的定位进行检测。方法以乳腺文库为模板,PCR扩增带有FLAG标签的PRDX3基因片段,并将扩增产物插入到PCDH空载体中,构建成PCDH-FLAG-PRDX3,质粒测序正确后瞬时转染入人胚肾293T细胞, Western免疫印迹检测克隆载体的表达情况,细胞免疫荧光实验检测PRDX3的亚细胞定位。结果双酶切和测序结果表明,PCDH-FLAG-PRDX3真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达了FLAG-PRDX3融合蛋白;细胞免疫荧光显示FLAG-PRDX3蛋白定位于舌癌SCC15细胞的细胞质中,不存在于细胞核内。结论成功构建了带FLAG标签的PRDX3真核表达载体,并检测其定位于舌癌SCC15细胞质中,为进一步明确PRDX3在舌癌发生发展中的功能及分子机制奠定基础。 相似文献
7.
目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础. 相似文献
8.
目的:克隆人PD—1分子的编码序列cDNA,将其重组进真核表达载体中,并表达于COS—7细胞。方法:从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列,将其克隆进真核表达载体pcDNA3.1( ),构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞,流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果:PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段,插入pcDNA3.1( )载体后构建成重组表达质粒,经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞,流式细胞仪检测显示有21.10%的细胞表达人PD—1分子。结论:本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。 相似文献
9.
目的:构建以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB,转染体外培养的COS-7细胞,以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法:PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后,以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达,并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果:RT.PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS.7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示,在空载体pEGFP-N1转染组中,COST细胞内荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中,绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论:CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达,且蛋白表达主要定位于细胞浆中,本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。 相似文献
10.
目的 构建小鼠固醇载体蛋白2(SCP-2)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化获得具有活性的融合蛋白,为进一步研究SCP-2的生物学功能提供基础.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到鼠SCP-2编码序列,然后将该编码序列克隆到带有His标记的载体pET14b上,重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性,然后切取分子量正确的条带用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确.融合蛋白表达纯化后获得了分子量约59kD的融合蛋白,符合预期大小,并经质谱分析证明该融合蛋白的表达正确.结论 成功构建了带His标签的SCP-2原核表达载体,并成功表达及纯化出该融合蛋白,为深入研究SCP-2的相关生物学功能提供了一个重要的工具. 相似文献
11.
目的 构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.方法采用激光共聚焦显微镜观察GILP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78 cDNA序列,构建真核表达载体peDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.结果 GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布.双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白.结论 正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达.pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具. 相似文献
12.
目的构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况。方法取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上。采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质。结论成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。 相似文献
13.
目的:构建人宫颈癌HPC2基因的原核及真核表达载体,进一步研究该基因在宫颈癌发生中的作用。方法:从人宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA。用RT-PCR方法扩增出人宫颈癌HPC2全序列基因,插入pT7 b lue载体。酶切鉴定及序列分析后,构建人HPC2基因的原核及真核表达载体。结果:成功扩增出人宫颈癌HPC2基因;并构建pGEX4T1-HPC2原核表达载体及pCMV-F lag-HPC2真核表达载体。结论:人HPC2基因的原核及真核表达载体的构建为深入研究HPC2基因与宫颈癌的发生奠定了基础。 相似文献
14.
目的 建立丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)区7个辅助T细胞抗原表位融合基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达产物,为进一步研究应用HCV NS3序列进行预防HCV感染的DNA免疫的研究创造条件。方法合成3对相互重叠的寡核苷酸引物,涵盖NS3区7个辅助T细胞抗原表位,细胞通过重叠延伸PCR方法,将它们拼接在一起构建了一个多肽融合基因,经克隆测序后,插入真核表达载体pEGFP-N3和pBuDCE中,用构建的pEGFP-DR4质粒分别转染293T和B淋巴细胞系046W,用pBuDCE-DR4质粒转染293T细胞,用Western印迹和流式细胞仪检测其表达。结果经测序证实成功的将丙型肝炎病毒NS3区7个辅助T细胞抗原表位基因序列拼接成融合基因,构建的pEGFP-DR4质粒在293T和B淋巴细胞系046W中均表达了预期的融合蛋白36kD。构建的pBuDCE-DR4质粒在293T细胞中可观察到预期的13kD的多肽融合蛋白。结论本研究建立了能够在真核细胞表达HCVNS3区7个辅助T细胞抗原表位融合基因的细胞系。 相似文献
15.
目的:构建白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)基因真核表达载体,瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞,为进一步探讨其与肿瘤发生发展关系奠定基础.方法:采用RT-PCR法自健康志愿者外周血单个核细胞扩增IL-8基因,构建pcDNA3.1( )/IL-8重组质粒;脂质体介导将外源基因转入OVCAR-3卵巢癌细胞,半定量RT-PCR、Western印迹及ELISA法鉴定其mRNA及蛋白瞬时表达后,MTT法检测细胞转染前后生长增殖特性的改变,FCM检测细胞周期的变化.结果:重组质粒双酶切电泳结果显示,相应位置(300 bp,5 400 bp)可见2条清晰特异的DNA条带;DNA测序结果进一步显示,重组质粒中插入的基因片段全长 300 bp,编码序列与GenBank报道的基因序列相符,阅读框保持不变;RT-PCR、Western 印迹检测及ELISA检测结果显示,转染后OVCAR-3细胞IL-8 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);MTT检测结果显示,IL-8转染细胞组转染3 d后的光密度值(D值)显著高于未转染细胞组(P<0.05);FCM分析结果显示,OVCAR-3细胞转染IL-8基因后进入S期的细胞比例显著增高,增殖指数也相应上升,与未转染及空质粒转染组细胞相比,差异显著(P<0.05).结论:IL-8基因真核表达载体成功构建并瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞;IL-8可以自分泌方式促进卵巢癌OVCAR-3细胞生长增殖. 相似文献
16.
HLA—DR基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
获得表达HLA-DR基因的小鼠墨色素瘤细胞,方法应用RT-PCR技术从人B淋巴瘤细胞Raji中克隆了HLA-DR3α和β链cDNA,并经测序证实。将其分别插入至真核表达载体pLXSN和pCEP4中,用脂质体转上鼠黑色素瘤细胞B16,然后用G418和Hyg双重筛选。 相似文献