视神经损伤后视网膜CNTF及CNTFRα免疫组织化学检测

目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）及其受体（ciliary neurotrophic factor recepterα，CNTFRα）在大鼠视网膜中的定位表达变化、方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。分别于伤后1d、3d、7d、14d、28d取眼球，以正常大鼠视网膜为对照，运用免疫组织化学方法检测视神经损伤后CNTF和CNTFRα的表达变化,结果在正常对照组中，由视锥视杆细胞外节组成的视网膜视锥视杆细胞层均有大量的CNTF及CNTFRα存在，在其它各层也存在散在颗粒状分布的CNTF及CNTFRα，视神经损伤后，CNTF及CNTFRα在视网膜各层显著增加，并呈弥漫性分布，在损伤后3d、7d、14d与正常对照组比较相差非常显著（P〈0．01）。损伤后7d．CNTF及CNTFRα在视网膜各层表达达高峰，在损伤后28d2者的表达均显著高于正常对照组（CNTF：P=0．02〈0．05；CNTFR：P=0．015〈0．05）。结论视神经不全损伤导致了视网膜CNTF和CNTFRα表达量的增加和分布的改变，可能是视网膜神经元损伤后自我保护的一种反应。     

脂质体介导质粒DNA转移至视网膜的观察

目的观察脂质体是否能介导目的基因转移至视网膜及脂质体潜在的毒副作用,探讨脂质体在视网膜疾病基因治疗中的应用价值.方法通过体外细胞转染实验优化阳离子脂质体与质粒DNA的比例,然后将脂质体-DNA混合物注射至Spregue-Dawley(SD)及Royal college of surgeon(RCS)大鼠视网膜下间隙,荧光显微镜观察目的基因的表达,病理学检查及电镜观察视网膜的组织形态学变化.结果阳离子脂质体介导转移的绿色荧光蛋白表达质粒在视网膜细胞中表达时间>4周.但转染后4周,正常SD大鼠的光感受器外节开始出现肿胀变性;8周时光感受器的细胞核明显减少,仅剩单层细胞,外节脱落或消失;双极细胞也出现凋亡;视网膜内可见新生血管.5只4周龄的RCS大鼠经阳离子脂质体介导睫状体神经营养因子(cillary neurotrophic factor, CNTF)表达质粒转移至视网膜,3～5周时镜下见3只实验眼视网膜光感受器保存情况明显比对照眼好.结论阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至视网膜细胞内;脂质体介导的CNTF基因转移对RCS大鼠视网膜光感受器有一定的保护作用,但对正常的视网膜神经细胞特别是光感受器有一定的毒副作用.     

表达睫状神经营养因子的人胚肺成纤维细胞视网膜下间隙移植延缓RCS大鼠光感受器变性

目的以遗传性视网膜变性RCS大鼠为模型,探讨视网膜下间隙移植表达睫状神经营养因子(CNTF)的人胚肺(HFL)成纤维细胞治疗视网膜变性的可行性。方法通过脂质体将编码CNTF的表达质粒转入HFL成纤维细胞、MTX及ELISA筛选高水平表达CNTF的细胞克隆。手术显微镜直视下经角膜缘后1mm注射5μl含1×105个高水平表达CNTF的HFL成纤维细胞至4～5周龄RCS大鼠右眼视网膜下间隙,左眼不手术或注射PBS作为对照。分别于移植术后2、4、6、8、10、12及15周随机取1只鼠摘除眼球作光镜观察,随机取2只鼠摘除眼球作电镜观察。结果稳定转染CNTF的HFL成纤维细胞能高水平表达CNTF(91046.15pg/ml),7只经光镜观察的移植眼中的4只,其视网膜外颗粒层明显较对照眼厚,保存的光感受器数量明显较对照眼多(P≤0.002)。14只经电镜观察的移植眼中的10只,视网膜外颗粒层光感受器凋亡明显较对照眼少。在光感受器与视网膜色素上皮间堆积的盘膜碎片亦较少。宿主视网膜色素上皮细胞的形态保存较好,并可见吞噬小体。结论经过CNTF基因修饰的HFL成纤维细胞视网膜下间隙移植能够延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性     

大鼠视神经损伤后视网膜CNTF及CNTFRα mRNA的表达

目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子及其受体在大鼠视网膜中的表达变化。方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。分别于伤后1、3、7、14、28d取眼球,以正常大鼠视网膜为对照,提取视网膜组织RNA,运用RT-PCR检测视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA的表达变化。结果在正常视网膜中存在CNTF和CNTFRαmRNA的表达,视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA表达量逐渐增加,第7d达到最高,第14d下降,具有统计学意义(P<0.01)。28dCNTF表达仍高于正常组(P<0.01)。结论视神经损伤刺激了视网膜细胞表达CNTF和CNTFRα增加,可能是视网膜神经元自我保护的一种反应。     

大鼠视神经夹伤后CNTF CNTFR及OMgpmRNA表达的研究

目的 观察大鼠视神经夹伤后对闪光视觉诱发电位(F-VEP)的影响及睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、睫状神经营养因子受体(ciliary neurotrophic factor recepter,CNTFR)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)在视网膜中的表达变化.方法 采用夹持视神经方法建立大鼠视神经不完全损伤模型,在夹伤后1、3、7、14和28d剥离视网膜,提取总RNA用半定量逆转录聚合酶反应(rt-PCR)方法测定视网膜中CNTF,CNTFR,OMgp mRNA的表达,同时观测术后1、7、14和28dF-VEP波形改变.结果 大鼠视神经损伤后视网膜中CNTF,CNTFR,OMgp mRNA有所增加,正常大鼠视网膜中CNTF,CNTFR,OMgp少量表达.视神经损伤后F-VEP潜伏期延长,波幅降低,波形低而宽,14d后有所恢复.结论 大鼠视神经损伤后,CNTF,CNTFR,OMgp表达均增加,而CNTFR的增加可为外源性CNTF治疗视神经损伤提供依据.F-VEP的振幅,潜时伤后变化与时间相关,伤后14d变化最明显,以后有恢复迹象.     

补肾益精方对外周血干细胞在RCS大鼠视网膜上的募集及睫状神经营养因子表达的影响

目的：观察补肾益精方对外周血骨髓间充质干细胞在视网膜变性模型（RCS）大鼠视网膜募集及睫状神经营养因子（CNTF）分泌的影响，探讨补肾益精方治疗视网膜退行性病变的作用机制。方法：实验研究。采用尾静脉注射方式将1×107个GFP标记的骨髓间充质干细胞（GFP-MSCs）注射至3周龄RCS大鼠外周血，然后按随机数字表法分为蒸馏水组及补肾益精方（BSYJ）组，每组39只。注射后第1天开始分别采用蒸馏水及补肾益精方药液灌胃，正常SD大鼠作为对照组常规饲养。给药7 d、14 d及28 d时分别采用视网膜铺片、免疫荧光显微镜观察GFP-MSCs在视网膜的募集情况；实时荧光定量PCR及免疫荧光双染技术检测视网膜表达CNTF的情况；TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况；采用单因素方差进行数据分析。结果：给药7 d、14 d和28 d时，蒸馏水组GFP-MSCs的数目少于BSYJ组，其中给药28 d时，2 组差异有统计学意义（t=2.71，P=0.001）。给药7 d、14 d和28 d时，BSYJ组CNTF表达较蒸馏水组均明显增加，3 组差异有统计学意义（F=5.763，P=0.003；F=3.165，P=0.042；F=4.839，P=0.004）。给药7 d和28 d时，BSYJ组视网膜细胞凋亡率明显少于蒸馏水组，3组差异有统计学意义（F=0.002，P=0.001；F=0.307，P=0.004）。结论：补肾益精方能够促进外周血干细胞在视网膜上的募集以及促进CNTF的表达，这可能是补肾益精方延缓RCS大鼠视网膜细胞凋亡和病变进程的作用机制之一。     

RCS大鼠视网膜内核层变性的超微结构研究

目的　证实RCS大鼠视网膜内核层存在神经原变性。方法　利用光学显微镜和透射电子显微镜观察出生后第 18、2 0、2 8、3 5、42、45、5 6、60、70和 10 0d的RCS大鼠视网膜和正常SD大鼠视网膜组织结构的变化。并用TUNEL方法证实视网膜神经细胞存在凋亡。结果　和正常SD大鼠视网膜比较 ,RCS大鼠 18～ 2 0d开始视网膜变性 ,光感受器细胞死亡 ,内核层细胞也有不同程度的变性。RCS大鼠在出生后 2 5d ,视网膜外核层细胞核TUNEL呈阳性 ,出生后 3 5～ 45d呈强阳性 ,视网膜内核层细胞核TUNEL标记呈阳性。结论　RCS大鼠视网膜内核层细胞存在神经原变性 ,视网膜内核层细胞死亡存在凋亡这一方式。跨神经原变性很可能是这些细胞变性的机制。RCS大鼠视网膜外核层细胞存在神经原变性 ,其死亡以凋亡为主     

视神经损伤时视网膜睫状神经营养因子受体的表达

目的研究睫状神经营养因子受体于视神经损伤后不同时间在视网膜中的表达情况,探讨外源性的睫状神经营养因子在神经损伤疾病中的应用价值。方法采用钳夹视神经的方法建立神经损伤的模型,在损伤后1、7、14、28d获取视网膜,提取总RNA及总蛋白,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定视网膜中睫状神经营养因子受体(CNTFR)αmRNA的表达,用WesternBlot方法了解损伤后不同时间CNTFRα蛋白水平的表达。结果在正常大鼠视网膜内CNTFRαmRNA无表达,在损伤后的1、7、14、28d均有一定水平的CNTFRαmRNA的表达,与正常对照比较差别具有显著性意义(P<0.01);损伤后备时间均有CNTFRα蛋白的表达,但CNTFRα蛋白的表达较弱。结论神经损伤后CNTF的表达先短暂升高以后持续下调,而CNTFRα-mRNA在损伤后4周内均有一定量的表达,提示补充外源性CNTF可能改善神经再生的微环境而发挥保护效应。     

补肾益精方对先天性视网膜色素变性RCS大鼠感光细胞凋亡的抑制作用

目的　探讨补肾益精方对先天性视网膜色素变性RCS大鼠感光细胞凋亡的影响。方法　将先天性视网膜色素变性模型RCS大鼠24只随机分为补肾益精方组及蒸馏水组，分别给予补肾益精方药液及蒸馏水灌胃，12只健康SD大鼠常规饲养作为正常组。在给药7 d及28 d后HE染色观察各组大鼠视网膜组织病理学变化，TUNEL法检测细胞凋亡情况，实时荧光定量PCR检测视网膜中睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子以及碱性成纤维细胞生长因子表达情况。结果　HE染色切片光学显微镜下正常组SD大鼠视网膜结构清晰，层次分明，各层细胞排列整齐。蒸馏水组大鼠视网膜内核层及外核层均较正常组明显变薄，细胞排列稀疏，可见空泡样改变，感光细胞数减少，且随鼠龄增加减少日益显著。补肾益精方组大鼠视网膜内核层及外核层亦较正常组变薄，但与蒸馏水组相比增厚，感光细胞数较后者增多，细胞排列也较为整齐。给药7 d及28 d时补肾益精方组每个高倍视野感光细胞数分别为140±9和80±9，蒸馏水组分别为113±8和44±6，补肾益精方组较蒸馏水组明显增多，差异有统计学意义（均为P<0.05）。TUNEL检测结果显示给药7 d及28 d时补肾益精方组感光细胞凋亡率分别为31.67±5.39%及29.68±4.31%，蒸馏水组分别为50.34±5.21%及44.02±7.17%，补肾益精方组较蒸馏水组均明显降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示给药7 d及28 d补肾益精方组视网膜睫状神经营养因子表达均较蒸馏水组增加（均为P<0.05），给药7 d时补肾益精方组视网膜脑源性神经营养因子表达较蒸馏水组明显增加（P<0.05），28 d时两组差异无统计学意义（P>0.05）；给药7 d及28 d两组碱性成纤维细胞生长因子的表达差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　补肾益精方对RCS大鼠感光细胞凋亡有明显的抑制作用，其作用机制可能与补肾益精方促进视网膜分泌神经营养因子有关。     

视网膜下间隙移植经基因修饰的视网膜色素上皮细胞对大鼠光感受器变性及视功能的保护作用

目的 以RCS大鼠作模型,研究经基因修饰的永生化视网膜色素上皮细胞(RPE)视网膜下移植对光感受器变性的保护作用。方法 在绿色荧光蛋白基因逆转录病毒感染的基础上,利用脂质体介导节状神经生长因子(CNTF)表达质粒转移,修饰成人RPE细胞系CRL-2302。将1×105个表达绿色荧光蛋白(GFP)或GFP及CNTF的RPE细胞移植到4～5周龄RCS大鼠右眼视网膜下间隙,左眼不移植或注射。PBS作为对照。术后2、4、6、8、10和12周作荧光显微镜、光镜、电镜及电生理检查。结果 荧光显微镜观察,术后1周移植的人RPE细胞在RCS大鼠视网膜下间隙已扩散到几乎整个眼底,但随时间延长移植的细胞逐渐减少,术后6周仅残留少量移植细胞。光镜及电镜观察显示移植眼保留的光感受器数量明显较对照眼多,凋亡细胞则较对照跟少。此外,移植眼宿主RPE细胞形态较正常,并可见吞噬小体。视网膜电图(ERG)检查结果表明部分移植眼视网膜功能明显较对照眼好。结论 经过基因修饰的RPE细胞移植可延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性,为治疗视网膜变性提供了新的途径。(中华眼科杂志,2004,40:552-556)     

A comparative study of distribution of 70 kD stress protein in the retina between the normal and retinal dystrophic rat]

The immunolocalization of 70 kD stress protein (SP70) was investigated in the retinal tissues of normal Sprague-Dawley (SD) rat and that of the Royal College of Surgeons (RCS) rat with inherited retinal dystrophy. From postnatal day 2 to 15, SP70 was present in the maturing retinal tissues of both rat strains. In the RCS rat retina of postnatal day 22, at the onset of retinal degeneration, SP70 was expressed in the retinal pigment epithelium (RPE). At postnatal day 40, immunostaining for SP70 was considerably reduced in the degenerating RCS retina. In the RCS retina at postnatal day 90, immunostaining for SP70 was completely lost except for the ganglion cells and the inner plexiform layers. These results suggested that, at the onset of retinal degeneration, the RCS retina may have a state of metabolic stress, which induced SP70 expression in the RPE. At the end stage of retinal degeneration, the immunostaining for SP70 was lost, suggesting the lack of production of SP70 in the degenerated retinal tissue.     

Immunohistochemical localization of basic fibroblast growth factor in mature and developing retinas of normal and RCS rats.

Basic fibroblast growth factor (bFGF) delays photoreceptor degeneration when injected intraocularly in Royal College of Surgeons (RCS) rats with inherited retinal dystrophy. In the present study, we have determined the localization of endogenous bFGF in retinas of normal and RCS rats during the normal developmental period (postnatal days 0-20) and the period of photoreceptor degeneration in RCS rats (days 20-90). bFGF was localized immunohistochemically by indirect immunoperoxidase using two different polyclonal antibodies and one monoclonal antibody against bFGF. bFGF was present in retinas as early as birth, and remained through adult age. Controls using either PBS, non-immune IgG or antibody preabsorbed with bFGF peptide were devoid of label. In normal rats between the ages of birth and postnatal day (P) 4, bFGF was found in developing ganglion cells, superficial blood vessels, some of the innermost cells in the neuroblastic layer, developing horizontal cells, and retinal pigment epithelial (RPE) cells. Between P0 and P4, the intensity of staining increased significantly in horizontal cells. From P6-P10, some cells in the inner nuclear layer remained positive, but horizontal cell staining became less intense in the central retina. The superficial vessels, ganglion cells and RPE cells also remained positive for bFGF. At P20-25, when the retina was essentially mature, bFGF was found in RPE cells, most cells of the ganglion cell layer, and many cells of the inner nuclear layer, but horizontal cells and blood vessels showed a lower concentration of bFGF than they did at younger ages. At P45 and older, blood vessels no longer showed bFGF immunoreactivity. The staining pattern in RCS rats was indistinguishable from that for normal rats at all ages examined. These results show that bFGF is present in the developing and adult rat retina in some neural cells, in addition to vessels and RPE cells. The transient elevated expression of bFGF immunoreactivity in developing horizontal cells and blood vessels suggests a possible role for this growth factor in retinal development. In addition, if RCS retinas possess any difference in bFGF localization or concentration compared to normal retinas, it must be too small to detect by immunohistochemical means, or at least with the reagents used.     

内源性睫状神经营养因子对青光眼鼠视网膜的保护作用

目的 探讨睫状神经营养因子(CNTF)蛋白在慢性高眼压性青光眼大鼠视网膜中的定位及表达情况.方法采用水下电凝巩膜静脉建立大鼠慢性高眼压性青光眼模型,在1、3、7、14、28 d分别摘取眼球,运用免疫组织化学和Western blot法检测大鼠视网膜CNTF蛋白的定位及表达变化.结果对照组大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)层有少量CNTF蛋白表达,青光眼大鼠视网膜CNTF蛋白的表达显著增加,建立模型后第7～14 d表达量达到高峰,此时除了神经节细胞层外,内外核层亦发现有CNTF蛋白的表达,之后表达减少.结论青光眼大鼠视网膜内源性CNTF表达增加,可能与促进损伤的RGCs的存活和轴突再生密切相关.     

半胱氨酸天冬氨酸酶3在遗传性视网膜变性中的表达

目的 观察半胱氨酸天冬氨酸酶3（caspase 3)mRNA在RCS大鼠视网膜中的表达，分析caspase 3特异抑制剂Ac-DEVD-CHO对视细胞凋亡的影响。方法 应用逆转录－多聚酶链反应（RT－PCR）检测RCS大鼠出生后不同时间视网膜中caspase 3 mRNA的表达。应用TUNEL方法检测玻璃体内注射Ac-DEVD-CHO后视细胞凋亡的改变。结果 RCS大鼠出生后14天至60天视网膜caspase 3 mRNA均有表达，25天水平明显升高，达到高峰。SD大鼠视网膜15至60天的表达量无明显差异，与RCS大鼠14天水平接近。caspase 3特异抑制剂Ac-DEVD-CHO能显著抑制视细胞凋亡。结论 caspase 3可能在RCS大鼠视网膜变性视细胞凋亡中起关键作用。     

大鼠视神经损伤及修复过程中视网膜睫状神经营养因子mRNA的表达

目的 探讨大鼠视神经损伤及修复过程中睫状神经营养因子（CNTF）mRNA在视网膜上的表达及意义。 方法 35只健康雄性SD大鼠，随机取5只作为正常对照组；另两组为视神经单纯切断组和视神经-坐骨神经吻合组，每组各15只大鼠。建立大鼠视神经单纯切断和神经-坐骨神经吻合模型，分别于建立模型后3、7、14 d取视网膜组织，应用半定量逆转录-聚合酶链反应方法观察正常大鼠及各模型大鼠视网膜上CNTF mRNA的表达情况。 结果 在正常大鼠视网膜上，CNTF mRNA有微量表达，视神经单纯切断后其表达增加（3、7、14 d CNTF mRNA的表达分别增加100%、594%和485%），视神经切断并吻合一段坐骨神经后，表达增加更明显（3、7、14 d CNTF mRNA的表达分别增加258%、752%和515%）。 结论 视神经损伤后，可通过提高内源性CNTF来应答视网膜神经节细胞（RGC）轴索反应，保护RGC，为外源性CNTF的应用提供理论依据。 （中华眼底病杂志，2004，20：355-357）     

RCS大鼠视细胞超微结构观察

目的 观察遗传性视网膜变性大鼠视细胞超微结构改变。方法 电子显微镜观察出生后9－60天皇家外科学院（RCS）大鼠及正常SD大鼠视网视细胞超微结构。结果 与正常SD大鼠相比,RCS大鼠从出生后15天,视细胞相继出现视杆外节脱落的膜盘堆集,外节膜盘排列紊乱,视杆内节椭圆体线粒体空泡化,视肌样质结构消失,细胞核浓缩,浓缩的染色质沿核膜排列呈“新月形”,最终细胞体消失。结论 RCS大鼠遗传性视网膜变性中视细胞死亡具有细胞凋亡的形态特征。