幽门螺杆菌cag1基因缺陷株的构建与鉴定

目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）细胞毒素相关基因致病岛（cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI）中的第1个编码基因hp0520/cag1基因缺陷株,为进一步研究cag1基因在cag PAI中的功能奠定基础。方法：使用同源重组技术,通过PCR扩增出cag1基因两侧同源臂序列,酶切纯化后分别连接于带卡那霉素抗性标志的载体两端,构建成cag1基因自杀质粒。将该质粒通过电穿孔导入受体野生株中,通过抗性筛选与PCR验证得到cag1基因缺陷株,与人胃上皮GES-1细胞共培养后,与野生株比较,观察细胞形态变化。结果：成功敲除H.pylori cag1基因,获得cag1基因缺陷株;与野生株相比,cag1基因缺陷株破坏细胞的能力降低。结论：成功获得幽门螺杆菌cag1基因缺陷株;cag1基因缺失后H.pylori对GES-1细胞的毒力减弱。     

幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因napA克隆及序列分析

目的：从幽门螺杆菌(H．pylori)中克隆中性白细胞激活蛋白基因napA并构建重组载体。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-HP27基因组DNA作模板;根据H．pylori J99全基因组序列设计napA PCR引物,高保真酶扩增napA片断;限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒,T4 DNA酶连接酶切产物,重组质粒转化E．coli TBIT程菌,蓝白斑试验筛选阳性克隆;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物学软件进行序列分析。结果：DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB-napA的EcoR I和Sal I位点之间切出一个435bp的DNA片断,测序结果与J99 napA同源性为96．5％,与H．pylori其他菌株的同源性为92％～97％。结论：成功构建H．pylori中性白细胞激活蛋白基因的重组质粒pNEB-napA;序列分析表明HP-napA是一类高度保守的原核型基因,可作为H．pylori疫苗候选基因。     

耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体的构建

目的 构建耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体,为进一步构建HPI全岛缺失株打下基础。方法根据已知小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因序列设计PCR引物,扩增并克隆irp8结构基因,作为同源重组的一侧序列,以irp5的部分序列作为同源重组的一侧序列,并将之克隆入同一载体,中间插入有卡那霉素(Km)基因(kan)、抗性标记。以自杀质粒pcvD442为载体．构建了含有irp8基因和Irp5部分序列的缺失突变载体pCO85。结果构建的突变载体经酶切及PCR鉴定克隆片段大小与预期一致。结论成功构建了致耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体,这个以小肠结肠炎耶尔森菌为靶序列构建的重组自杀质粒可应用于肠杆菌科及其他菌属HPI毒力岛全岛缺失株的构建。     

luxS基因敲除临床分离大肠杆菌株生物膜形成能力的变化

目的探讨LuxS基因对临床分离大肠杆菌生物膜形成能力的影响。方法以临床分离大肠杆菌S17为研究对象,PCR分别扩增S17 LuxS基因的上下游序列和质粒pEGFP-N1的卡那抗性基因,分别连入T载体pAT2,再通过酶切连接的方法分别将LuxS基因的上、下游序列连接入pAT2-kana质粒,构建同源重组质粒pAT2-△luxS,同源重组质粒转化大肠杆菌DH5α扩增后,提取质粒后双酶切获得同源重组片段,将同源重组片断电转入感受态S17,通过同源重组构建LuxS基因缺失的S17,96孔板结晶紫染色法分析LuxS基因缺失株生物膜形成能力的变化。结果 LuxS基因缺失株基因组PCR扩增出1678的片断,测序鉴定正确,成功构建临床分离大肠杆菌S17 LuxS基因缺失株,S17与S17LuxS基因缺失株形成生物膜的微孔板法半定量OD值的结果分别为(1.51±0.09)和(0.43±0.13)。结论 LuxS基因对细菌生物膜的形成具有重要调控作用。     

抗噬菌体甲型副伤寒沙门菌突变菌的构建及其生物学特性

目的:采用同源重组基因敲除方法构建3株甲型副伤寒沙门菌(副甲)抗噬菌体突变菌,并研究其生物学特性。方法:通过PCR和融合PCR方法获得了2、3、5号同源臂片段,经酶切后与pYG4载体连接,构建pYG4-2、pYG4-3和pYG4-5同源重组质粒。经PCR测序鉴定正确后,与野生型副甲菌进行同源重组,获得2、3、5号3株抗噬菌体突变菌。将3株突变菌和野生型副甲菌经不同种类和浓度的抗生素、不同pH值和温度及不同浓度的盐离子处理后,测量菌株的A₅₉₅值,分析3株突变菌对抗生素、温度、pH值和盐离子的敏感性以及生长曲线。结果:PCR和融合PCR扩增出3个同源臂,构建的pYG4-2、pYG4-3和pYG4-5同源重组质粒经PCR测序表明构建成功;同源重组和抗噬菌体验证表明成功获得3株抗噬菌体突变菌。3株突变菌产生了卡那霉素抗性,且对链霉素表现出敏感性;2号菌表现出氨苄青霉素抗性,5号菌表现高温度耐受性;与野性型副甲菌比较,3株突变菌的生长曲线明显平缓,尤以2号突变菌最为突出。结论:成功构建抗噬菌体突变菌,并获得一些特殊的生物学特性。     

伤寒沙门菌fljB∷lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljB::lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ辅基铁-硫蛋白基因克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ琥珀酸-泛醌还原酶辅基铁-硫蛋白(iron-sulfur protein,Ip)基因原核表达质粒pET28α-Ip，测定Ip基因序列，为研究铁-硫蛋白基因功能奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫海南株基因组DNA中扩增出Ip基因，扩增产物经纯化后，用BamHI XhoI双酶切，定向克隆入pET28α质粒，转化大肠杆菌DH5α，再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定，并进行同源性比较。结果：筛选出编码海南株Ip基因的原核表达质粒pET28α-Ip，海南株Ip基因序列与K1、3D7株高度同源。结论：pET28α-Ip重组质粒的构建，为进一步研究铁-硫蛋白基因奠定基础。     

表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的构建1个含有luxS基因上、下游片段、抗卡那霉素基因的重组克隆质粒,用以敲除表皮葡萄球菌luxS基因。方法检索GenBank获得luxS基因序列以设计引物,以生物膜阳性表皮葡萄球菌基因组DNA为模板,采用高保真PCR扩增得到包含luxS基因上游片段、完整的luxS基因和luxS基因下游片段的长片段DNA;以pEASYT4质粒为模板扩增得到抗卡那霉素基因,再用内侧引物分别扩增luxS基因上、下游序列,按luxS基因上游片段＋抗卡那霉素基因＋luxS基因下游片段的顺序重组连接,转化JMl09感受态细胞,通过卡那霉素筛选、酶切分析和PCR一测序验证luxS基因敲除的重组克隆载体。结果经酶切后电泳验证重组质粒中各目的片段插入无误,PCR检测结果证明重组质粒luxS基因缺失,测序结果显示碱基无错配,含目的基因的重组质粒菌株在含卡那霉素培养平板内正常生长,证明插入的抗卡那霉素基因表达良好。结论表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒构建成功,为后续luxS基因缺陷株的构建奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljA样基因缺陷变异株的制备

目的：为探讨z66鞭毛抗原阳性伤寒沙门菌的fljA样基因的功能,制备沙门菌fljA样基因缺陷变异株。方法：根据伤寒沙门菌fljA样基因序列,设计PCR特异性引物并在5末端加接酶BglII位点,扩增fljA样基因上、下游片段,用BglII消化后,定向连接成fljA样基因的缺损性同源性核苷酸片段,先克隆至pGEM—T质粒,再经BnmHI酶切后导入自杀质粒pGMB151,电转化入伤寒沙门菌(GIFU 10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为fljA样基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。结果：PCR及序列分析证实,缺陷变异株的fljA样基因缺失231个碱基。结论：成功构建伤寒沙门菌flja样基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌鞭毛抗原表达的调控作用奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

目的:为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制,建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)插入变异株。方法:采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物,用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段,并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体(pSV-β-galactosidase vector)的片段定向连接,将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151,再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌,在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果:经筛选获得阳性克隆,经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763 bp被3550 bp的lacZ片段替代。结论:成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株,为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

幽门螺杆菌omp11基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体的构建与表达

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)外膜蛋白基因(omp11)与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,为幽门螺杆菌疫苗和诊断抗原的筛选奠定基础。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA,用自行设计的PCR引物,从染色体DNA上扩增出omp11基因,将其克隆到表达载体pMAL-c2x中,用重组质粒转化大肠杆菌(E．coli TB1)。对重组质粒进行酶切鉴定,对目的基因片段进行测序。用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果：用PCR方法扩增的omp11基因长度为561bp;经酶切鉴定和测序,插入到载体的基因片段与文献报道相一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为28000,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的30％。结论：作者构建的pMAL-c2x与omp11基因重组质粒在E．coli TB1中能够高效表达目的基因,该重组质粒的构建为H．pylori omp11基因的研究建立了重要的基础。     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

缺失HPI毒力岛的EAggEC O42突变菌株的构建及鉴定

目的构建并鉴定HPI毒力岛缺失的EAggEC突变株.方法运用基因重组方法，以irp8基因部分序列作为同源重组的一侧序列，irp5基因序列作为同源重组的另一侧序列，中间插入有卡那霉素（Km）抗性基因（kan）标记。以pCVD442作为载体，构建含有irp8部分序列和irp5基因的重组自杀质粒pC085。以EAggEC O42为出发菌株．构建缺失irp8-irp5约24kb的HPI毒力岛功能卡受心区区域的全岛缺失侏EAG85．结果通过接合转移和同源重组．利用蔗糖抗性筛选，pC085上的同源序列有效的置换rEAggEC O42的irp8和irp5基凶。PCR方法扩增irp3、ybtA、irp9等基因的结果显示，筛选出的EAG85确为缺失HPI毒力岛基闪的EAggEC菌株结论成功地构建了缺失HPI毒力岛的EAggEC O42突变菌株．为进一步阐明HPI毒力岛存EAggEC菌株中的功能建立了重要的物质基础。     

O139群霍乱弧菌TLC、CTX、RTX基因簇缺失株的构建及鉴定

目的构建O139群霍乱弧菌TLC、CTX、RTX基因簇缺失株。方法PCR扩增TLC上游片段(TLC up)、RTX下游片段(RTX down),克隆入pU18中,再在两者间插入氯霉素抗性(Cm)基因,获得重组质粒pUC18-TLC up-Cm-RTX down。酶切回收TLC up-Cm-RTX down片段,克隆入自杀质粒pDS132,构建重组自杀质粒pDS132-TLC up-Cm-RTX down。通过接合将重组自杀质粒转入O139群霍乱弧菌ZJ199693,20%蔗糖选择培养基(Cm抗性)筛选TLC、CTX、RTX基因缺失株。结果PCR、酶切证明重组自杀质粒pDS132-TLC up-Cm-RTXdown构建正确。PCR证实O139群霍乱弧菌ZJ199693TLC、CTX、RTX毒力基因簇成功缺失。结论成功缺失O139群霍乱弧菌ZJ199693TLC、CTX、RTX基因簇,为进一步研究其功能和疫苗构建打下基础。     

猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建

目的：构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TS045-4B的真核表达质粒pcDNA3．1／TS045-4B。方法：全基因合成TSO45-4B的基因序列，并利用PCR扩增该基因序列，将其插入真核表达载体pcDNA3．1，经酶切、测序鉴定。结果：经酶切和测序鉴定表明所构建的重组表达质粒中含有TSO45-4B基因。结论：成功构建pcDNA3．1／TS045-4B重组质粒。     

幽门螺杆菌尿素酶基因ureB植物双元表达载体的构建

目的:构建含有人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)ureB基因的植物表达载体.方法:采用高保真PCR技术从质粒pMED-ureB中扩增出ureB基因,构建质粒pUC18-ureB,再将pUC18-ureB酶切,将ureB基因与质粒pBI121连接.结果:构建的PBI121-ureB经PCR、酶切鉴定和测序分析证明,插...     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF 基因缺失株和回补株的构建

目的利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的espF基因及其核苷酸片段;建立以pBAD 33质粒为载体的espF
基因回补实验平台。方法设计1 对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46 质粒的
EDL933w,在PKD 46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体espF基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增espF及其核
苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入pBAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株。采
用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中espF及其核苷酸片段是否转录。结果构建了espF基因及其核苷酸片段缺失的
EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且espF基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录。结论本研究运用
Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株,并建立以pBAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回
补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中espF基因的调控机制奠定了基础。