复方血栓通对猴脉络膜一视网膜内皮细胞增生、移行和管腔形成的作用

目的探讨复方血栓通干预猴脉络膜．视网膜内皮细胞（Rr／6A）参与血管生成的作用及机理。方法实验研究。本研究分为四部分：①取对数生长期RF／6A细胞进行培养,设立空白对照组、阳性对照组以及不同浓度的复方血栓通观察组．每组均加入终浓度为10ng／ml的血管内皮生长因子（VEGF）．阳性对照组加入终浓度0．20mg／ml的硫酸鱼精蛋白,复方血栓通观察组设立0．39～50．00mg／ml的多个不同浓度组。培养24h后采用酶联免疫检测仪测定各组吸光度4值,观察不同浓度的复方血栓通对VEGF诱导的RF／6A细胞增殖的影响。②设立空白对照组和终浓度为3．13、6．25、12．50mg／ml的复方血栓通组,培养24h后检测不同浓度复方血栓通对RF／6A细胞移行的影响。⑧设立空白对照组和终浓度为0．39、0．78、1．56mg／ml的复方血栓通组,培养12h后检测不同浓度的复方血栓通对RF／6A细胞管腔形成的影响;④设立空白对照组、终浓度为0．20mg／ml的硫酸鱼精蛋白阳性对照组和终浓度为1．56、3．13、6．25mg／ml的复方血栓通组,培养24h后,运用Western Blot和实时定量逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）的方法,分别检测不同浓度的复方血栓通对RF／6A细胞表达VEGF、基质金属蛋白酶2（MMP．2）蛋白和mRNA的影响。对多组计量资料进行单因素方差分析。结果①各组间4值差异有统计学意义（F=158．669,P〈0．01）,同空白对照组比较,0．78～25．00mg／ml浓度的复方血栓通对VEGF诱导的RF／6A细胞增殖具有明显抑制作用（尸均〈0．011;②复方血栓通浓度为0、3．13、6．25和12．50mg／ml时,RF／6A细胞移行数分别为123．3±13．8、114．3±15．5、54．0±6．1和40．3±10．1,组间差异有统计学意义（B36．918,P〈0．01）;与空白对照组比较,6．25和12．50mg／ml浓度的复方血栓通对RF／6A细胞移行具有明显的抑制作用（P均〈0．01）;③复方血栓通浓度为0、0．39、0．78和1．56mg／ml时RF／6A细胞内皮管腔形成数分别为20．3±2．5、12．7±2．1、9．7±1．2和0．7±0．6,组间差异有统计学意义（F=64．324,P〈0．01）;与空白对照组比较,0．39、0．78和1．56mg／mA浓度的复方血栓通对RF／6A细胞内皮管腔形成均具有明显的抑制作用（P均〈0．01）,且抑制作用随浓度增加而增强;④空白对照组、阳性对照组以及1．56、3．13和6．25mg／ml浓度的复方血栓通组VEGF和MMP．2蛋白相对含量组间差异均有统计学意义（F=343．346、1670．505,P均〈0．01）;与空白对照组比较,其余各组均具有显著抑制RF／6A细胞VEGF和MMP-2蛋白表达的作用（P均〈0.01）,复方血栓通的抑制作用随浓度增加而增强;各组VEGF和MMP-2mRNA相对含量的差异也有统计学意义（F=228．130,208．579,P均〈0．01）,与空白对照组比较,其余各组均具有显著抑制RF／6A细胞VEGFmRNA表达的作用（P均〈0．01）,复方血栓通的抑制作用随浓度增加而增强。结论复方血栓通可能通过抑制RF／6A细胞增殖、移行以及管腔形成来抑制其参与新生血管生成．其机理可能与抑制RF／6A细胞VEGF、MMP-2的表达有关。     

人参皂甙Rg3对高糖条件下人视网膜血管内皮细胞的作用研究

目的:观察正常和高糖条件下人参皂甙Rg3对人视网膜血管内皮细胞血管新生作用的影响。方法:在正常和高糖条件的培养基中,分别加入0.1mmol/L和0.5mmol/L的人参皂甙Rg3,在24h,48h和72h用MTT检测细胞的增殖情况,用Transwell小室检测细胞迁徙情况,用Matrigel检测细胞管腔形成的情况,用实时定量RT-PCR和Western-Blot检测细胞中血管内皮生长因子mRNA和蛋白的表达情况。结果:在正常和高糖条件下,人参皂甙Rg3对于人视网膜血管内皮细胞增殖、细胞迁徙和细胞内皮管腔形成均具有抑制作用,且呈浓度与时间依赖性;且人参皂甙Rg3具有抑制人视网膜血管内皮细胞VEGF蛋白和mRNA表达的作用。结论:通过抑制VEGF的表达,人参皂甙Rg3可抑制人视网膜血管内皮细胞增殖、迁徙和管腔形成,进而抑制新生血管的形成。     

姜黄素通过AKT/HIF-1α/VEGF信号通路在体外抑制脉络膜新生血管的机制

目的：探讨姜黄素在体外抑制脉络膜新生血管(CNV)生成的作用及机制。

方法：氯化钴(CoCl₂)诱导人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞建立化学性缺氧模型,采用CCK-8法检测姜黄素对CoCl₂诱导的ARPE-19细胞活性的影响,采用RT-qPCR和Western blot检测姜黄素对CoCl₂诱导的ARPE-19缺氧模型细胞内AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达的影响。采用细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验、Transwell小室侵袭实验及Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。

结果：100μmol/L CoCl₂可成功建立ARPE-19细胞化学缺氧模型。CoCl₂在100μmol/L浓度下促进ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。姜黄素在浓度为100μmol/L时可减少ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。ARPE-19细胞姜黄素低(6.25μmol/L)、中(25μmol/L)、高剂量组(100μmol/L)条件培养液可显著抑制HUVEC细胞水平迁移; 其中高剂量组条件培养液可显著抑制HUVEC细胞垂直迁移和细胞侵袭。ARPE-19细胞姜黄素中、高剂量组条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。

结论：姜黄素在100μmol/L对CoCl₂诱导ARPE-19细胞缺氧有保护作用。姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。     

莪术醇抑制VEGF诱导的新生血管生成的实验研究

目的:研究莪术醇对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的新生血管生成的作用及机制。方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞,用50ng/mL VEGF和不同浓度莪术醇进行分组处理,采用CCK-8和EdU实验检测细胞增殖,Transwell实验分析细胞迁移能力,管腔形成实验分析内皮细胞血管生成能力,Western blot检测Akt/mTORC1通路变化。结果:CCK-8实验结果显示,400、800μmol/L莪术醇+VEGF组细胞OD450值明显低于VEGF组(均P<0.01)。EdU结果显示,400μmol/L莪术醇+VEGF组细胞增殖率明显低于VEGF组(P<0.001)。Transwell实验和管腔形成实验结果显示,与VEGF组比较,400μmol/L莪术醇+VEGF组迁移细胞数减少,管腔形成的分支数量和分支长度下降(均P<0.001)。Western blot结果显示,莪术醇可显著减少细胞中Akt/mTORC1下游靶点p-Akt和p-S6的表达。结论:莪术醇可抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,具有强的抑制血管生成的作用,可进一步用于眼底新生血管的治疗...     

复方血栓通胶囊对叔丁基过氧化氢诱导人视网膜色素上皮细胞氧化损伤保护作用

目的 探讨复方血栓通胶囊对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞(hRPE)氧化损伤的保护作用.方法 原代培养hRPE细胞后取第3～5代进行实验.应用MTT法筛选复方血栓通的最佳药物浓度;再分别用MTT及Annexin V/PI双染法检测复方血栓通及其各单方药物对细胞氧化损伤的保护作用.hRPE细胞分为正常对照组、t-BHP模型组和t-BHP+复方血栓通(0.25mg/ml)组,倒置相差显微镜和Hoechst33258染色观察各组细胞的形态和细胞核;MitoSOX染色检测活细胞线粒体中ROS的产生;JC-1染色检测线粒体膜电位的变化;ELISA法检测细胞分泌的VEGF浓度.结果 500μmol-BHP干预6h后,模型组细胞存活率下降到(49.9±6.3)%,而不同浓度的复方血栓通组细胞存活率均较模型组升高,且以0.25mg/ml的保护作用最佳;细胞存活率、凋亡及坏死率的结果显示复方血栓通较各单方药物的保护作用更为明显;模型组多数细胞肿胀、变圆、漂浮和核固缩,复方血栓通组损伤的细胞明显减少,线粒体内ROS的产生、线粒体膜电位的下降、分泌的VEGF均较模型组明显减少.结论 复方血栓通胶囊对t-BHP诱导hRPE细胞的氧化损伤具有保护作用,且其保护作用较各单方药物更为明显,其作用机制为清除ROS,阻止线粒体膜电位的下降,抑制VEGF的分泌,从而抑制细胞凋亡和坏死,提高细胞存活率.     

内皮抑素对培养的血管内皮细胞增殖的影响

目的:探讨血管生成抑制因子内皮抑素(endostatin,ES)对培养的血管内皮细胞增殖的影响,以获得最佳作用浓度、作用时间及最佳条件。方法:将培养ECV304细胞分别培养在含倍比稀释的ES培养液中,其中培养液分为有无血清和VEGF无血清组,在不同的作用时间(24,48h及72h),应用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法测定ES对ECV304细胞增殖的影响。结果:ES可显著抑制各种条件下ECV304细胞的增殖,以无血清条件下抑制作用达到最大,ES作用于ECV304细胞的最佳作用敏感时间区为24～48h,最佳作用浓度敏感区为157～2500mg/L。结论:ES对各种条件下ECV304细胞增殖有明显抑制作用,但未发现诱导内皮细胞凋亡。     

TNP-470对人脐静脉内皮细胞生长的抑制作用

目的：观察TNP-470对人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞生长的影响。 方法：采用MTT、细胞生长曲线、倒置显微镜形态学观察、荧光染色、流式细胞术等方法观察不同浓度TNP-470对ECV-304细胞形态、细胞增殖和细胞周期的影响。 结果：MTT结果显示：在低浓度（0．2μg／D时,TNP-470对ECV-304增殖无明显抑制作用,从2μg／L开始产生抑制作用,且该抑制作用具有量效关系,IC50值为305μg／L;生长曲线：20,200,2000μg／LTNP-470处理细胞后,细胞增殖被抑制,且具有剂量一时相依赖性;倒置相差显微镜下观察：各时间段对照组细胞生长状态正常,排列整齐呈铺路石样;从2μg/L开始出现细胞增殖抑制现象,随作用时间的延长和浓度增高抑制作用更为明显：2000μg／L组见少部分脱落、悬浮细胞;流式细胞仪分析经20,200,2000μg／L的TNP-470作用24,36h后,细胞被阻滞在G0／G1期,G2／M和S期的细胞数减少（P〈0．05）,细胞分裂受抑制,增殖指数降低。 结论：TNP-470能使ECV-304细胞周期阻滞在G0／G1期,对细胞增殖具有抑制作用。     

复方血栓通对人视网膜血管内皮细胞抗氧化损伤的保护作用及其机制

背景氧化损伤是引起内皮细胞功能障碍和细胞死亡的重要因素之一,它还可导致视网膜血管性疾病的发生。复方血栓通对多种视网膜血管性疾病有一定的疗效,但分子机制尚不明确。目的研究复方血栓通对叔丁基过氧化氢（t—BHP）诱导的人视网膜血管内皮细胞（RVECs）氧化损伤的保护作用及其机制。方法分离健康人供体眼的视网膜,用组织块培养法进行人RVECs的原代培养,并用FITC-vwF染色流式细胞仪对培养细胞进行鉴定。取3～5代的细胞用于实验,在含有5×10^4个／L细胞密度的培养孔中分别加入质量浓度为0．0625、0．1250、0．2500、0．5000、1．000g／L复方血栓通溶液,各质量浓度复方血栓通组和t-BHP模型组均加入终浓度为100μmol／Lt-BHP,干预24h后用MTT法检测各组人RVECs的吸光度（A490）值以评估复方血栓通的细胞毒性。t-BHP模型组分别加入终浓度为75、100、200和300μmol／L的t-BHP,相应的复方血栓通组在不同浓度t-BHP造成细胞氧化损伤的同时均加入终质量浓度为0．2500g／L复方血栓通溶液,干预6h后,用MTT法检测复方血栓通对t-BHP引起氧化损伤的作用。用Annexin V—FITC／PI双染流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和坏死率;用倒置显微镜和Hoechst33258细胞核染色观察各组细胞的形态学,利用免疫荧光法检测人RVECs中蛋白氧化损伤和DNA氧化损伤的生物标记物硝基酪氨酸（NT）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的表达;Western blot法检测t-BHP损伤6、12、24h各组细胞核转录因子．KB（NF—KB）、p53、bcl-2和bax的蛋白表达水平。结果正常对照组、0．0625、0．1250、0．2500、0．5000、1．000g／L复方血栓通组人RVECs的A490值总体比较差异无统计学意义（F=1．989,P〉0．05）,75、100、200和300μmol／L的t-BHP作用后细胞存活率下降,而相应的复方血栓通组细胞存活率均较t-BHP模型组升高,差异均有统计学意义（t=14．57、13．82、21．51、32．64,P〈0．05）。分别用75、100、200、300μmol／Lt-BHP干预6h后细胞凋亡率和细胞坏死率升高,而细胞正常率均明显低于相应的复方血栓通组,差异均有统计学意义（t=14．908、5．495、17．165、26．330,P〈0．01）。t-BHP模型组随着t-BHP浓度的增加,变形和死亡的人RVECs数目增加,但复方血栓通组细胞形态无明显变化,死亡细胞数减少。与相应的t-BHP模型组相比,不同质量浓度的复方血栓通组人RVECs中NT及8-OHdG的表达明显减少,NF—KB、p53和bax蛋白的表达水平明显降低,而bcl-2蛋白的表达升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论复方血栓通可保护人RVECs免受t-BHP诱导的氧化损伤,其机制可能是通过下调细胞中NF—κB、p53和bax蛋白的表达并上调bcl-2蛋白的表达。     

人参皂甙Rg3对正常和缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞的作用

目的 观察正常和缺氧条件下人参皂甙Rg3对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增生、迁徙和管腔形成的影响.方法 在正常条件的培养基中,分别加入0.0、0.1、0.5 mmol/L的人参皂甙Rg3,依序分为A、B、C3个组;在150 μmol/L 氯化钴缺氧条件的培养基中,分别加入0.0、0.1、0.5 mmol/L的人参皂甙Rg3,依序分为D、E、F3个组.在培养后24、48、72 h用噻唑蓝比色法检测HRCEC的增生;在24 h,用Transwell小室检测细胞迁徙,用基质胶检测细胞管腔形成,实时荧光定量逆转录酶链聚合反应和蛋白质免疫印迹法检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白质表达.结果 正常或缺氧条件培养基中,均可观察到人参皂甙Rg3对HRCEC增生的抑制作用,并且这种抑制作用呈浓度与时间依赖性(F正常组浓度=30.331,F缺氧组浓度=33.402,F正常组时间=85.462,F缺氧组时间=136.045,P均＜0.05).Transwell小室结果显示,A、B、C、D、E、F组HRCEC细胞的移行细胞数分别为(103.33±3.54)、(92.25±3.68)、(78.64±4.66)、(125.76±3.11)、(90.27±3.55)、(77.81±5.01)个.正常和缺氧条件下各组间HRCEC细胞的移行细胞数比较,差异有统计学意义(F正常组组间=28.801,F缺氧组组间=117.594,P均＜0.05).基质胶检测结果显示,A、B、C、D、E、F组HRCEC细胞的完整管腔形成数分别为(24.3±2.2)、(15.7±1.7)、(10.1±2.3)、(26.2±1.9)、(15.1±2.6)、(8.6±1.9)个.正常和缺氧条件下各组间HRCEC细胞的完整管腔形成数比较,差异有统计学意义(F正常组组间=35.364,F缺氧组组间=50.989,P均＜0.05).实时荧光定量逆转录-酶链聚合反应检测结果显示,A、B、C、D、E、F组HRCEC细胞的VEGF mRNA相对表达量分别为1.00±0.06、0.79±0.06、0.68±0.02、3.88±0.12、2.83±0.09、1.15±0.05.正常和缺氧条件下各组间HRCEC细胞的VEGF mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F正常组组间=31.303,F缺氧组组间=682.668,P均＜0.05).蛋白质免疫印迹法检测结果显示,A、B、C、D、E、F组HRCEC细胞的VEGF蛋白质相对表达量分别为0.62±0.03、0.41±0.02、0.32±0.02、0.91±0.03、0.82±0.03、0.71±0.02.正常和缺氧条件下各组间HRCEC细胞的VEGF蛋白质相对表达量比较,差异有统计学意义(F正常组组间=125.471,F缺氧组组间=41.045,P均＜0.05).结论 人参皂甙Rg3可通过抑制HRCEC细胞增生、迁徙和管腔形成来抑制新生血管的形成,其机制可能通过抑制VEGF的表达来实现.     

胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白-1抑制视网膜血管新生的实验研究

背景寻求有效的血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂是治疗和预防新生血管性眼病的关键。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白-1（IGFBP—rP1）是一种新发现的抑血管新生因子,推测其在眼内有抑制VEGF的作用。目的探讨IGFBP—rP1对VEGF体外诱导视网膜新生血管形成的抑制作用及其机制。方法使用含质量分数10％FBS的DMEM对猕猴视网膜／脉络膜血管内皮细胞株（RF／6A）进行扩增培养,利用免疫荧光细胞化学染色法观察RF／6A细胞表达IGFBP—rP1的情况。RF／6A细胞血清饥饿法培养24h后分为对照组、10mg／LVEGF组,50、100、200mg／LIGFBP—rP1＋10mg/L VEGF组进行干预,分别利用MTS比色法、Transwell实验和流式细胞术比较IGFBP—rP1（0、50、100、200mg／L）联合VEGF（10mg／L）作用后,RF／6A细胞在增生、移行和凋亡等生物学行为方面的变化。结果RF／6A细胞用不同质量浓度的IGFBP—rP1培养后细胞质呈FITC激发后的绿色荧光,细胞核呈PI激发后的红色荧光,而对照组细胞仅见细胞核的红色荧光。10mg／LVEGF组RF／6A细胞的A490值、移行细胞数与对照组相比明显增加,差异均有统计学意义（t=-15．191,P=0．000;t=-21．274,P=0．000）,细胞凋亡率明显下降,差异有统计学意义（t=10．228,P=0．000）。与10mg／LVEGF组相比,IGFBP—rP1（50、100、200mg／L）＋10mg／LVEGF组RF／6A细胞的A490值、移行细胞数明显下降（均P〈0．05）。50、100、200113geLIGFBP—rPl＋10mg／LVEGF组RF／6A细胞的细胞凋亡率分别提高了（1．26±0．04）％、（1．50±0．07）％和（1．93±0．27）％,各组的总体差异有统计学意义（F=274．273,P=0．000）。结论IGFBP—rP1作为一种内源性因子,通过促细胞凋亡机制抑制VEGF诱导的视网膜血管的生成。     

两种血管内皮生长因子抑制剂对血管内皮细胞功能的抑制作用比较

目的　对比tenomodulin（TNMD）和avastin 对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖和体外血管样结构形成的抑制作用。方法　将传至3~6代的HUVEC接种于微孔板中贴壁生长,再置于孵箱中培养6 h,分别加入不同剂量VEGF处理24 h,MTT法测量细胞增殖能力,筛选促进细胞最大增殖作用的VEGF剂量A。将HUVEC分别加入A剂量的VEGF+不同剂量（0.25 mg·L^-1、0.50 mg·L^-1、1.00 mg·L^-1、2.00 mg·L^-1）的TNMD或avastin置于孵箱中培养24 h,MTT法检测TNMD和avastin对VEGF诱导的HUVEC增殖抑制的差异。基质胶体实验检测细胞体外血管形成的形态和长度:实验分为4组,A组为阳性对照;B组添加VEGF;C组添加 VEGF和 avastin;D组添加VEGF和TNMD,共焦显微镜下观察细胞形态,图像处理分析软件量化分析毛细血管样结构的差异。结果　MTT在490 nm波长处测定吸光值（A值）检测细胞增殖,结果显示,相同药物浓度时TNMD的A值均明显低于avastin的A值（均为P<0.01）。基质胶体实验结果显示,D组的毛细血管样结构破坏明显;A组、B组、C组和D组细胞总长度分别为（7422±311）μm、（9369±121）μm、（6499±258）μm、（5292±137）μm,两两相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　TNMD比avastin对体外培养的HUVEC增殖具有更强的抑制作用。     

血管紧张素Ⅱ和血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及意义

目的:探讨血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在视网膜新生血管发生发展中的作用。方法:随机对照实验研究。选取7d龄C57BL/6J新生小鼠40只,随机分为2组:正常对照组和高氧模型组,每组20只,高氧模型组建立氧诱导视网膜病变模型。采用荧光素血管灌注视网膜铺片观察视网膜血管形态学改变;制作视网膜组织切片并进行HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用Western blot检测视网膜Ang II和VEGF蛋白的表达。采用独立样本t检验和Pearson相关分析进行统计学分析,以P<0.05作为差异具有统计学意义。结果:荧光素血管灌注视网膜铺片:高氧模型组较正常对照组可见大量新生血管丛,伴明显荧光渗漏。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数:高氧模型组(43.23±2.57)个较正常对照组(1.37±0.93)个明显增多,差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜Ang II蛋白表达水平:高氧模型组(0.365±0.004)较正常对照组(0.035±0.003)明显上调,差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜VEGF蛋白表达水平:高氧模型组(0.372±0.004)较正常对照组(0.049±0.007)明显上调,差异具有统计学意义(P=0.00)。结论:Ang II促血管生成的作用与VEGF存在明确的联系,Ang II通过上调VEGF参与视网膜新生血管的形成。     

视网膜新生血管形成过程中VEGF对TGF-β表达的影响—生长因子冗余性的初步探索

目的:研究早产儿视网膜病变新生血管形成过程中VEGF对TGF-β表达的影响。方法:体外培养人视网膜血管内皮细胞(HRCECs),分别转染重组腺相关VEGF病毒和VEGF的RNA干扰质粒到HRCECs,增高和抑制VEGF的表达,通过二氯化钴诱导HRCECs缺氧,观察TGF-β在不同VEGF水平下的mRNA表达变化,同时观察HRCECs增殖的变化。结果:高表达VEGF组(C组),低表达VEGF组(D组),阴性对照组(E组),阳性对照组(F组)的VEGF/actin分别为:1.15±0.77,0.36±0.31,0.28±0.16,0.83±0.72;而TGF-β/actin为:0.55±0.39,0.92±0.57,0.18±0.07,0.70±0.45,当VEGF高表达,TGF-β的mRNA表达下调;在VEGF低表达时,TGF-β的mRNA表达上调。结论:TGF-β能部分代偿VEGF的功能,视网膜新生血管形成过程中生长因子具有冗余性。     

LeTx抑制MEK通路对体外血管紧张素诱导的VEGF分泌的影响

目的:体外观察血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)对视网膜色素上皮细胞(retinal pigmented epithelium,RPE)VEGF分泌的影响以及能否通过炭疽毒素致死因子(lethalfactor,LF)通过阻断MEK/MAPK通路对VEGF分泌的影响。方法:体外培养人RPE细胞分为A,L和N组。A组用含100μmol/LAngⅡ及25mL/L小牛血清的低糖DMEM培养液刺激。L组于A组培养液刺激细胞前,先用10μmol/LEF与100nmol/LLF联合处理细胞24h;N组细胞培养于仅含25mL/L小牛血清的DMEM培养液。作用不同时间梯度后收集细胞上清。采用ELISA法测定各组VEGF浓度。结果:AngⅡ刺激RPE45min即能诱导VEGF分泌,这种作用在刺激3h达到最强,约为对照组7.9倍。预先用LeTx处理的RPE细胞并不能够对AngⅡ的刺激产生反应。在任一刺激时段,细胞培养液中VEGF浓度始终维持在较低水平。结论:LeTx通过抑制MEK通路对AngⅡ刺激的VEGF分泌有抑制作用。     

恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞后房水血管内皮生长因子水平的变化

目的探索恒河猴血管内皮细胞移植替代角膜内皮细胞后房水血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度的变化。方法实验组将体外培养增殖的恒河猴视网膜-脉络膜血管内皮细胞通过离心沉淀法移植到撕除后弹力层的恒河猴角膜内表面;对照组撕除角膜内皮层后,不做任何处理,直接原位缝合角膜植片。分别于术前及术后1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周抽取房水,通过ELISA方法检测其中VEGF浓度,并进行统计分析。结果实验组和对照组术后1周时VEGF浓度差异无统计学意义(P>0.05),术后2周、3周、4周时实验组VEGF浓度分别为(374.74±3.30)ng·L-1、(419.06±1.39)ng·L-1、(481.83±3.36)ng·L-1,同时间点对照组分别为(271.11±1.12)ng·L-1、(345.18±3.27)ng·L-1、(380.33±5.03)ng·L-1,差异均具有统计学意义(均为P<0.05),相应时间点实验组显著高于对照组。实验组术后1周、2周、3周、4周VEGF浓度的差异均有统计学意义(均为P<0.05),各时间点与术前(128.75±3.83)ng·L-1差异均有统计学意义(均为P<0.05)。对照组术后各时间点VEGF浓度与术前差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论血管内皮细胞移植到角膜内表面后,房水VEGF浓度在术后4周内持续升高,之后稳定在一较高水平。     

腺病毒介导的重组Tum5基因对生理状态下脐静脉血管内皮细胞生物学行为的抑制作用

背景 肿瘤抑素是迄今发现活性最强的内源性血管生成抑制因子,对病理性新生血管形成有明显抑制作用.Tum5片段为肿瘤抑素的抗血管生成活性片断. 目的 研究腺病毒介导的Tum5重组基因过表达对生理状态下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、迁移及管腔形成的影响. 方法 构建表达绿色荧光蛋白的空载体腺病毒(rAd-GFP)和携带重组Tum5基因的腺病毒载体(rAd-Tum5).将HUVECs分为正常对照组、空载体组(rAd-GFP组)和Tum5基因组(rAd-GFP-Tum5组).将rAd-GFP和rAd-Tum5病毒颗粒(1×101o/ml)各20μl分别加入rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组培养液以感染培养的细胞48 h,倒置荧光显微镜下观察各组细胞中GFP的表达,并计算病毒的感染效率;采用细胞计数试剂盒(CCK)-8检测各组细胞在波长为450 nm处的吸光度(A)值并计算细胞增生率;采用Transwell小室实验测定各组的迁移细胞数目;采用基质胶(Matrigel)实验检测各组细胞的管腔形成数;采用人血管内皮生长因子(VEGF) ELISA试剂盒检测细胞感染后24、48和72 h各组细胞培养上清液中VEGF质量浓度. 结果 倒置荧光显微镜下可见rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组HUVECs中呈绿色荧光,rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组的感染效率分别为55.13％和50.31％.细胞感染后24 h和48 h,正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组细胞增生率比较差异均无统计学意义(均P＞0.05);细胞感染后72 h,rAd-GFP-Tum5组细胞增生率明显低于正常对照组和rAd-GFP组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞感染后48 h,正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组迁移细胞数分别为(2 260.25±930.44)、(2 370.00±441.06)和(723.75±363.80)个,总体比较差异有统计学意义(F=8.524,P=0.008),rAd-GFP-Tum5组迁移细胞数量较正常对照组和rAd-GFP组均明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.01).正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组平均每张图片中管腔形成数目分别为(95.67±5.86)、(88.00±4.58)和(20.67±3.51)个,总体比较差异有统计学意义(F=226.498,P＜0.01),其中rAd-GFP-Tum5组细胞管腔形成数量较正常对照组和rAd-GFP组明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞感染后24、48和72 h,各组细胞培养上清液中VEGF蛋白质量浓度总体比较差异均有统计学意义(F分组=73.260,P＜0.01;F时间码 =73.477,P＜0.01);其中感染后48 h和72 h,rAd-GFP-Tum5组VEGF质量浓度均明显低于rAd-GFP组,差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 腺病毒介导的重组Tum5基因的过表达可抑制生理状态下HUVECs的增生、迁移及管腔形成,这可能与Tum5下调VEGF在细胞上清液中的含量有关.     

体外AGEs诱导培养的视网膜Müller细胞增殖活性和分泌VEGF的改变

目的:探讨体外Mller细胞在糖基化终末产物(AGEs)作用下增殖活性的变化。方法:采用本实验室培养及鉴定的新生大鼠Mller细胞,设置正常生长组和添加AGEs培养组,AGEs浓度在250～1000mg/L范围内逐步递增。MTT法测定AGEs对体外纯化培养Mller细胞增殖的影响和分泌VEGF的改变。结果:高浓度AGEs对Mller细胞有明显的促增殖作用,并且促进Mller细胞分泌VEGF,并在一定的浓度范围内(250～1000mg/L)细胞增殖活性呈剂量依赖关系。结论:体外高浓度AGEs可促进Mller细胞异常增殖和VEGF表达增加,与临床上观察到增殖性糖尿病视网膜病变时胶质细胞反应性增生情况一致,因此可以在体外用高浓度AGEs模拟体内糖尿病环境,观察胶质细胞形态和功能的改变。     

内皮抑素基因转移抑制血管内皮细胞增殖的实验研究

目的　探讨脂质体介导的内皮抑素 (ES)基因转移抑制血管内皮细胞增殖的可行性及ES基因转移对血管内皮细胞增殖的影响。方法　利用阳离子脂质体介导的分泌型真核细胞表达载体PCDNA3 ES转染COS 7细胞 ,并采用免疫斑点杂交法检测转染细胞及其上清液中ES蛋白的表达 ;以脂质体介导的PCDNA3 ES转染培养的人脐静脉血管内皮细胞 (ECV 30 4细胞 ) ,免疫组化染色观察ES蛋白的表达 ;应用噻唑蓝染色法 (MTT)观察脂质体介导的ES基因转移并抑制ECV 30 4细胞增殖的作用 ;以流式细胞仪检测ES基因转染后对细胞增殖周期的影响。结果　重组质粒转染的COS 7细胞及其上清液中均有明显的斑点出现 ,而以载体质粒转染的细胞则无斑点出现 ;脂质体介导的ES基因成功转染ECV 30 4细胞 ,转染后 2d ,ES蛋白表达量达到高峰 ;ES基因转移可以明显抑制血管内皮细胞增殖 ,同一观察时间转染与非转染组比较 ,差异有非常显著意义 (P <0 0 1) ;ES基因转染组G0 /G1细胞比例增加 ,S期细胞比例减少。结论　脂质体介导ES基因可成功转染血管内皮细胞并有ES蛋白的分泌表达 ,从而特异性抑制血管内皮细胞的增殖。