体外扩增人脐带血来源的NK细胞对食管癌细胞的促凋亡作用

目的：建立体外扩增人脐带血来源的NK细胞的方法,并研究其对多株人食管癌细胞系和食管癌患者原代肿瘤细胞的杀伤作用。方法：分离人脐带血单个核细胞,加入放射线灭活的人白血病K562细胞及IL-2、IL-15、IL-18细胞因子体外扩增培养2周,诱导NK细胞。采用流式细胞术检测NK细胞的扩增效果及其产生的IFN-γ等细胞因子杀伤靶细胞K562的能力,并检测体外扩增的人脐带血来源NK细胞对多种食管癌细胞系和食管癌患者原代肿瘤细胞凋亡的影响。结果：利用放射线灭活的K562细胞联合多种细胞因子,可以有效的扩增人脐带血来源的NK细胞。体外培养2周后NK细胞比率可达80%左右,并对靶细胞K562有明显促凋亡作用。此外,体外扩增的人脐带血来源NK细胞能够促进6株人食管癌细胞系和食管癌患者原代肿瘤细胞的凋亡。结论：本研究建立了体外扩增人脐带血NK细胞的方法,并证实这些NK细胞对食管癌细胞的促凋亡作用,可能为食管癌的免疫治疗提供新的手段。     

体外扩增肾癌患者自体NK细胞及其对人肾细胞癌786-O细胞的杀伤

目的:探究IL-15、4-1BBL基因修饰的人白血病K562细胞(modi-K562细胞)联合IL-2体外高效扩增肾细胞癌患者自体自然杀伤(natural killer,NK)细胞的方法,研究扩增前后NK细胞对肾癌细胞株786-O的杀伤作用。方法:10例肾癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)与modi-K562细胞在含不同浓度IL-2培养液中共育14 d,采用流式细胞术、Calcein-AM释放实验检测NK细胞的扩增情况、免疫表型及对肾癌786-O细胞的杀伤作用。结果:modi-K562细胞联合IL-2可有效扩增NK细胞,300 U/ml IL-2培养14 d时,NK细胞扩增(202.4±12.8)倍。在效靶比为20∶1时,扩增后NK细胞对786-O细胞的杀伤率为(72.0±4.3)%,显著高于扩增前NK细胞的杀伤率(34.2±3.6)%(P<0.01)。结论:IL-15、4-1BBL基因修饰的K562细胞联合IL-2在体外能有效扩增肾细胞癌患者NK细胞,扩增后NK细胞对肾癌786-O细胞的杀伤作用显著增强。     

一种经济高效的人外周血NK细胞纯化方法的建立

目的:建立一种经济并且纯化率高的人外周血NK细胞分离方法.方法:对用RosetteSepR法直接从全血分离NK细胞的方法进行改进,先从全血中获得单个核细胞(PBMC),与红细胞按比例混合后再进行分离,利用流式细胞仪检测纯度,并且用CCK-8法检测NK细胞对K562细胞的杀伤活性.结果:改进后分离每毫升血所需RosetteSep抗体复合物用量仅为直接分离法的1/50;NK细胞的纯度由纯化前的(11.02±3.15)%提高到(96.52±2.42)%,细胞回收率为(70.24±10.51)%;纯化的NK对靶细胞K562有较强的杀伤作用,与直接分离法比较杀伤活性差异无统计学意义(P＞0.05).结论:改进后的方法可以获得高纯度的NK细胞,该分离方法不影响NK的杀伤活性,同时极大的降低了分离成本.初步建立了一种经济高效,快速简便,并且纯化率高的人外周血NK细胞纯化方法.     

K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果

目的：评价新建立的K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果。 方法：采集健康志愿者和肿瘤患者的外周血PBMC并分离NK细胞,采用前期构建的K562工程细胞(将IL-15、4-1BBL和IL-18在白血病K562细胞上进行跨膜表达获取）联合IL-2培养方案对NK细胞进行扩增和活化,以流式细胞术检测NK细胞的扩增效果和NK细胞表面受体表达水平,CCK-8法检测扩增后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和ADCC活性,CCK-8法检测在培养方案扩增末期加入TKD多肽对NK细胞的活化效果。结果：对于健康志愿者的NK细胞,新建立扩增培养方案可使NK细胞在PBMC中的比例提高至（93±3）%;使NK细胞中活化性受体NKG2D、CD94、NKp30、NKp44和NKp46的比例分别提高60%、40%、20%、40%和63%,而抑制性受体的表达变化不大;扩增后NK细胞对白血病细胞K562、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMU-7721和乳腺癌细胞MCF-7的杀伤活性分别提高了19%、29%、26%和28%,其ADCC活性从（33±5.6）%上升至（65±12）%;方案中增加TKD可使NK细胞的杀伤活性从（86±4）%提高至（96±2）%。对于肿瘤患者的NK细胞,新扩增方案使其在PBMC的比例提高至（90.0±8.0）%,其对K562细胞的杀伤活性提高了17%左右。 结论： K562工程细胞联合IL-2扩增方案可高效扩增NK细胞,明显激活其杀伤活性,扩增和活化的NK细胞可满足临床治疗的需要。     

γδT细胞对血液肿瘤细胞的体外杀伤活性

目的:建立γδT细胞培养体系,探讨γδT细胞对不同血液肿瘤细胞的杀伤活性.方法:选取2016年1月至2016年4月在解放军第307医院造血于细胞移植科收治的4例B细胞淋巴瘤患者和该院5例体检健康志愿者,分别分离其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用唑来磷酸(zoledronate,Zol)和IL-2体外扩增γδT细胞,采用流式细胞术检测γδT细胞对血液肿瘤细胞Jurkat、THP-1、HL-60、K562、Raji、U-937和RPMI-8226的杀伤活性,比较CIK、NK和γδT三种细胞对K562细胞的杀伤作用,检测γδT细胞IFN-γ、TNF-α的分泌水平及CD107a分子的表达水平.结果:成功在体外扩增外周血γδT细胞;γδT细胞对Jurkat、THP-1、HL-60、K562、U-937和RPMI-8226细胞均有明显的杀伤活性(P＜0.05);γδT细胞对K562细胞的杀伤活性与NK细胞无统计学差异,但明显强于CIK细胞(P＜0.01);随着与K562细胞共孵育时间的延长,γδT细胞分泌IFN-γ的水平呈现出时间依赖性增加,TNF-α在8h后逐渐增加;与K562细胞或HL-60细胞共孵育后,γδT细胞CD107a分子的表达水平均显著增加(P＜0.01).结论:体外扩增的γδT细胞对血液肿瘤细胞具有较高的杀伤活性,为血液肿瘤的细胞免疫治疗提供实验依据.     

选择性扩增人自然杀伤细胞的实验研究

背景与目的:自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞具有很强的杀瘤活性,但体外扩增NK细胞的数量难以达到治疗肿瘤的目的。本实验探讨由人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)和附壁Wilms肿瘤细胞株HFWT混合培养能否有效地诱导NK细胞。方法:采用PBMCs和HFWT细胞混合培养诱导扩增NK细胞,51Cr释放法和结晶紫染色法测定NK细胞的杀瘤活性;流式细胞计数仪检测培养细胞中CD3 、CD4 、CD8 、CD16 和CD56 细胞的比例。结果:HFWT对人NK细胞特别敏感,它比不表达MHC-Ⅰ类分子的K562细胞和其他附壁生长的肿瘤细胞株更有效地刺激PBMCs,从而选择性扩增NK细胞。健康人PBMCs在HFWT细胞中培养10～21天后,CD56 CD16 细胞占细胞总数50%以上。当效靶比为2∶1时,NK细胞杀伤80%的HFWT细胞,NK细胞的扩增需要HFWT细胞反复刺激PBMC。结论:从HFWT细胞株中可选择性扩增人NK细胞,将有助于开展临床肿瘤过继免疫疗法。     

一种经济高效的人外周血NK细胞纯化方法的建立

目的：建立一种经济并且纯化率高的人外周血NK细胞分离方法。方法：对用RosetteSep法直接从全血分离NK细胞的方法进行改进,先从全血中获得单个核细胞（PBMC）,与红细胞按比例混合后再进行分离,利用流式细胞仪检测纯度,并且用CCK-8法检测NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果：改进后分离每毫升血所需RosetteSep抗体复合物用量仅为直接分离法的1／50;NK细胞的纯度由纯化前的（11．02±3．15）％提高到（96．52±2．42）％,细胞回收率为（70．24±10．51）％;纯化的NK对靶细胞K562有较强的杀伤作用,与直接分离法比较杀伤活性差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：改进后的方法可以获得高纯度的NK细胞,该分离方法不影响NK的杀伤活性,同时极大的降低了分离成本。初步建立了一种经济高效,快速简便,并且纯化率高的人外周血NK细胞纯化方法。     

人外周血NK细胞生物学特征的初步研究

NK细胞的纯化及体外扩增是研究NK细胞重要的方法学基础.NK细胞不需在要特异抗原的刺激下即可杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞,它的功能还受多种细胞因子的调节,其中IL-2在体外可显著促进NK细胞的杀伤功能及增殖.本实验在此基础上对NK细胞的生物学特征进行了初步研     

苦参碱诱导自然杀伤细胞对白血病K562细胞杀伤的实验研究

目的 探讨中药苦参碱对人自然杀伤（NK）细胞体外杀伤白血病细胞的作用及可能的分子机制.方法 以人慢性粒细胞白血病K562细胞为靶细胞,采用CFSE/PI双染色法流式细胞术检测不同质量浓度（02、0.5、0.8 mg/ml）苦参碱处理后,人NK细胞在不同效靶比下对K562细胞的体外杀伤活性.流式细胞术分析不同浓度苦参碱处理24 h对NK细胞主要活化性受体NKG2D和抑制性受体CD158a、CD158b表达的影响及K562细胞膜上NKG2D配体MICA/B、ULBP1、ULBP 2、ULBP 3表达的改变.结果 效靶比为5∶1时,NK细胞对0.2、0.5和0.8 mg/ml苦参碱处理后的K562细胞杀伤率分别为32.8％、38.1％和40.5％,较处理前均有不同程度增高（29.2％）;但进一步增加效靶比（10：1）后,NK细胞杀伤活性改变差异无统计学意义（P＞0.05）.苦参碱处理24 h,NK细胞抑制性受体CD158a、CD158b的表达均较处理前降低,而活化受体NKG2D的表达则增高.K562细胞表面NKG2D配体ULBP1和ULBP2分子的表达也较处理前增高（平均荧光强度分别为174.33±39.93比275.67±32.88,517.6±47.97比1368.6±49.43,P＜0.05）.结论 苦参碱可增强NK细胞对白血病K562细胞的体外杀伤活性,其机制可能与NK细胞受体及配体表达调节作用有关.     

体外扩增对食管癌患者NK细胞表面受体表达及其抑瘤活性的影响

目的： 探讨食管癌患者NK细胞扩增前后的受体表达及其对肿瘤细胞的杀伤。 方法： 收集福建省肿瘤医院食管癌患者外周血20例,健康供者（对照组）外周血10例。NK细胞培养采用细胞因子（IL-2+IL-12+IL-15+IL-18）组合,流式细胞术检测NK细胞免疫表型及其受体（CD56+、CD69+、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b、CD159a）的表达,LDH法检测不同效靶比时NK细胞对多种肿瘤细胞株（K562、Raji、Eca-109、TE-1）的杀伤作用。 结果： 与对照组相比,食管癌患者外周血CD3+、CD4+细胞比例以及CD4+/CD8+T细胞比值明显降低（P<0.05）,NK细胞（CD3-CD56+）及调节性T细胞（Treg）比例明显升高（P<0.05）。经细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合定向扩增20 d后,食管癌患者NK细胞比例高达90%以上,NK细胞数扩增达1 000倍以上（P<0.01）;而CD3+T细胞、CD4+、CD8+T细胞、CD19+B细胞、Treg细胞及单核巨噬细胞（CD14+）比例均显著降低（P<0.01）,且食管癌患者与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。经细胞因子体外培养20 d后,NK细胞表面CD69及活化性受体（NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46）均明显上调,而抑制性受体（CD158b、CD159a）均明显下调（P<0.05）。培养20 d后,食管癌患者NK细胞对肿瘤细胞K562、Raji、Eca-109、TE-1的杀伤能力均显著高于培养前\[（69.2±5.1）% vs （42.3±3.0）%,（44.6±3.2）% vs （21.1±2.0）%,（69.7±3.9）% vs （50.3±35）%,（67.1±4.5）% vs （41.2±3.3）%;均P<0.01\]。 结论: 细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合能有效扩增外周血NK细胞并上调其活并性受体的表达、下调抑制性受体的表达,其数量及功能均能满足临床治疗需要。     

四种NK细胞体外扩增方案的比较

目的： 通过对4种NK细胞体外培养方案扩增后产物的细胞免疫表型、扩增倍数以及杀伤活性进行比较,确定一种高效的NK细胞体外扩增方案。 方法: 建立4种NK细胞体外培养方案：方案1为经典的NK细胞体外扩增方案(IL-2+IL-15);方案2为IL-2+IL-15+IL-18;方案3为IL-2+IL-15+IL-7;方案4为新型NK培养基（IL-2+OKT3）。收集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年2月至2012年4月间10例晚期实体瘤患者的PBMC,按照4种方案进行体外扩增。在体外扩增的0、5、10、15 d,采用流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群（尤其是NK细胞）的比例;比较各方案体外扩增15 d后的NK细胞的扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化,并采用LDH法检测各方案扩增产物对人白血病K562细胞的杀伤活性。结果： 上述4种NK细胞培养方案体外扩增15 d后,细胞总数分别扩增（40.1±20.00）、（44.08±22.09）、（44.82±23.67）、（46.82±2502）倍,其中NK细胞的扩增倍数分别为（75.86±28.57）、（93.32±32.16）、（88.66±24.94）,（58.88±41.53）倍。NK细胞比例由0 d的（20.44±2.23）%分别扩增至15 d的（48.30±13.90）%、（54.72±12.25）%、（55.94±12.70）%和(54.5±14.93)%;各培养方案组在总细胞扩增倍数、NK细胞扩增倍数上的差异均无统计学意义（P>0.05）。前3种培养方案体外扩增产物的杀伤活性明显高于方案4\[（63.40±500）%、（77.30±9.40）%、（62.17±5.60）% vs （37.39±10.42）%,均P<005\],而方案1、2、3之间体外扩增产物杀伤活性的差异则无统计学意义（P>0.05）。 结论： 细胞因子组合对于体外大规模培养NK细胞有着一定的优势,但不同的细胞因子组合（方案1中是否加入IL-18或IL-7）对NK细胞体外大规模扩增的影响差异并不显著;但前3个方案扩增产物对K562细胞的杀伤活性明显强于方案4。     

脐血CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的临床应用研究

目的:研究用脐血单个核细胞制备CD3AK细胞的抗肿瘤作用,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标.方法:分离脐血单个核细胞,分别用IL-2和IL-2 CD3Ab诱导LAK和CD3AK细胞,并测其扩增数量和对K562细胞的杀伤活性;测定肿瘤患者用CD3AK细胞治疗前后外周血T淋巴细胞亚群绝对计数的变化情况和外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性.结果:脐血LAK细胞和脐血CD3AK细胞均于培养后11天时扩增倍数最高,分别是培养前的18倍、24倍,对K562的杀伤活性分别是培养前的2.6倍和3.2倍;肿瘤患者输注CD3AK细胞一疗程后,其外周血T淋巴细胞亚群绝对计数有明显升高:总T升高66.0%,Th升高68.0%,Ts升高58.0%;其PBMC的NK杀伤活性由63.0%升高到81.0%,平均升高28.0%.结论:1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3AK细胞良好的前体细胞.2)LAK和CD3AK细胞的数量和杀伤能力在培养的11天时达高峰,而且CD3AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞.3)CD3AK细胞输注能明显提高肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群绝对计数和PBMC的NK活性.4)肿瘤患者的外周血T淋巴细胞计数和PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数.     

IL-15联合GM-CSF对急性白血病NK细胞作用的研究

目的选择细胞因子IL-15和GM—CSF作为刺激物，观察其对急性白血病自然杀伤细胞(NK细胞)的激活作用。方法分离健康成人及化疗缓解后的白血病患者外周血单个核细胞(PBMC)，分别加入IL-2、IL-15、GM—CSF培养，MTr法检测PBMC及活化后的PBMC对白血病K562的细胞毒作用。流式细胞仪检测NK细胞并计数NK／PBMC比例。结果正常人及化疗缓解组PBMC经过IL-15、IL-15 GM—CSF分别作用后，细胞均呈现不同程度的增殖。化疗后缓解的增殖程度均小于正常人。正常人及化疗缓解组PB—MC联合应用IL-15和GM—CSF后对k562杀伤活性优于单用IL-15。缓解组对k562的杀伤活性明显低于正常对照组，化疗缓解后病人的NK／PBMC比例低于正常人。经联合应用IL-15、GM—CSF孵育后NK／PB—MC高于正常人。结论正常人及白血病患者PBMC与IL-15和GM—CSF联合孵育，能有效刺激PBMC增殖，提高NK／PBMC的比例。通过正常人及白血病患者的PBMC对K562的杀伤能力，间接反应IL-15和GM—CSF能有效激活外周血NK细胞，增加杀伤活性。     

细胞因子组合体外扩增人NK细胞的研究

目的：探讨细胞因子IL-2、IL-12、IL-15和IL-18组合对体外扩增人外周血来源的NK细胞受体表达及杀伤肿瘤细胞能力。方法：NK细胞的培养分为cIK组、IL2＋II,15组和IL-2＋IL-12＋IL-15＋IL-18组;流式细胞术检测培养的细胞表型及NK细胞受体表达;LDH法检测不同效靶比NK细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤作用。结果：外周血淋巴细胞经细胞因子IL-2＋IL广12＋IL-15＋IL-18组合作用下,17d后NK细胞（CD3-CD56＋）比例上升至80％以上,NK细胞数扩增〉1000倍,明显高于其他两组,F=37．154,P〈0．001。NK细胞活化标志CD69。‘分子增加（t-21．271,P〈0．001）,NK细胞活化性受体（NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46）均有不同程度上调（P值均〈0．05）,而NK细胞抑制性受体CDl58b（t=3．416,P=0．021）和CDl59a（t=4．209,P=0．018）不同程度下调,T淋巴细胞、B淋巴细胞（CD19＋）、单核巨噬细胞（CD14＋）、调节性T细胞（T—reg）等均显著减少,P〈0．001。对扩增的NK细胞杀伤敏感的肿瘤细胞株均高表达MHCI类相关蛋白A（majorhistocompatibility complexclass Ichainrelated moleculesA,MICA）,MICA表达分别为K562（46．2±3．2）％、MCF-7（56．5±4．7）％、HTC-8（52．5±4．1）％和Eca-109（36．5±2．5）％,而对NK细胞抵抗的细胞株均低表达或不表达MICA分子,分别为Raji0、MDA-MB-435s0和HT-29（1．2±0．8）％。结论：细胞因子IL-2＋IL-12＋IL-15＋IL-18组合能有效的扩增外周血来源NK细胞,上调其活化性受体,下调抑制性受体,其数量及功能均满足临床治疗需要。     

一种简单γδT细胞扩增培养方法及其抗肿瘤生物学功能研究

目的 :建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法 ,并比较了γδT细胞 ,NK和LAK细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法 :收集用不同单抗分别包被粘附的细胞 ,然后通过MACS细胞分选仪的分选 ,获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以及单抗阻断效应的分析。结果 :经MACS分离得到的γδT细胞 ,培养 2周后细胞数扩增 6 0 0～ 80 0倍 ,CD3,CD8和γδ细胞表达阳性率分别是 72 .2 9% ,5 8.0 2 %和 6 5 .98%。γδT细胞对NK敏感细胞K5 6 2以及NK不敏感细胞Raji和XG 7这 3种不同靶细胞均有较高的杀伤率 ,分别为 35 .98% ,5 2 .2 7%和 6 9.0 8% ;NK细胞对此 3种细胞的杀伤率分别是 45 2 1% ,12 .34%和 11.94% ;LAK细胞的杀伤率分别为 44 .0 1% ,2 9.2 7%和 2 5 .6 8%。γδT细胞对经MHC Ⅰ类单抗阻断前后的K5 6 2 ,Raji和XG 73种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论 :γδT细胞、NK细胞和LAK细胞都具有一定的非特异性杀伤肿瘤细胞的作用 ;γδT细胞对MHC Ⅰ类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化。提示γδT细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱     

人胶质瘤细胞U251逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步探讨

目的 探讨人神经胶质瘤细胞U251逃逸同种异体NK细胞免疫杀伤的机制。方法以K562细胞为对照,应用LDH释放法检测不同效靶比时NK细胞体外杀伤U251细胞的活性。用RT-PCR检测K562和U251细胞MHC-I类链相关分子A和B（MICA／B）、人巨细胞病毒糖蛋白UL16结合蛋白（ULBP1～3）基因,用流式细胞仪检测两细胞MICA／B、ULBP1～3和HLA-I分子的表达情况。效靶比20：1时用单抗分别阻断K562和U251细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3和HLA—I类分子,观察NK细胞对其杀伤活性的变化。结果同一效靶比时NK细胞杀伤U251细胞的活性明显低于杀伤K562细胞的活性,两者之间差异有统计学意义（P〈0．05）;K562和U251细胞均表达基因MICA／B和ULBP1～3,但U251细胞仅低表达ULBP2分子。用单抗封闭MICA／B和ULBP1～3分子后,NK细胞对K562细胞的杀伤活性明显降低,对U251细胞的杀伤活性无明显改变。封闭HLA-I类分子后NK细胞对U251细胞的杀伤活性明显上升,对K562细胞的杀伤活性无明显改变。结论U251细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制可能是由于U251细胞高表达HLA-I类分子,不表达NKG2D的配体MICA／B和ULBP1～3。     

链式CIK细胞对白血病K562细胞的体外杀伤活性

目的： 研究细胞因子诱导的体外细胞经过链式激活后获得的链式CIK细胞对白血病K562细胞的杀伤效应。 方法: 采用血细胞单采机从外周血分离单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）,经过细胞因子诱导、扩增、培养得到链式CIK细胞,以CIK细胞作对照,检测链式CIK细胞的增殖能力, LDH释放法测定其对K562细胞的杀伤活性。 结果: 链式CIK细胞组在培养第5、第14天的细胞数低于CIK细胞组（P<0.01）;链式CIK细胞对K562细胞的杀伤活性在效靶比40 ∶1和20 ∶1时分别为（56.1±2.24）%、（34.4±3.56）%,均低于CIK细胞（均P<0.01）。 结论: 链式CIK细胞是一种培养周期短、对白血病K562杀伤活性较弱的免疫细胞。     

NK细胞杀伤人胶质瘤起始细胞的体外研究

背景与目的：越来越多的证据支持人脑胶质瘤来源于胶质瘤起始细胞／干细胞（glioma initiating cell／stemcell,GIC／GSC）的假说,鉴于干细胞特性．常规手术和放化疗难以清除GIC．本研究试图用体外活化的自然杀伤（natural killer,NK）细胞对GIC细胞进行杀伤研究。方法：以体外长期培养于干细胞培养基的CD133阳性胶质瘤细胞作为GIC,用免疫磁珠从胶质瘤患者（或健康人）的外周血中分离NK细胞,常规IL2／PHA活化NK细胞后,应用LDH释放法检测其体外杀伤GIC细胞的活性,以K562细胞为阳性对照。结果：体外实验中,异体NK细胞可以在GIC的培养基甩生长和活化．且其杀伤GIC细胞的能力随效靶比增高而增强,同一效靶比时,活化的NK细胞杀伤GIC细胞的活性明显高于未活化（静止）NK细胞的活性（P〈0．011。结论：异体NK细胞可以在GIC的培养环境中活化并表现出针对GIC的杀伤能力,为NK细胞用于脑胶质瘤起始细胞的临床清除提供可能性。     

HSP70-TKD诱导的NK细胞杀伤肝癌细胞的实验研究

目的:探讨从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中获得足够数量和高细胞毒活性的CD3-CD56 NK细胞的方法,并观察其对肝癌细胞HepG2杀伤效应.方法:以干细胞培养基(SCGM)为基础培养基,在不同浓度的抗CD3单抗、IL-2和PHA的培养条件下,从健康人PBMC中高效扩增获得CD3-CD56 NK细胞;以不同剂量的HSP70-TKD诱导NK细胞的活性,MTT法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2和榄香烯处理的HepGZ细胞的杀伤活性.结果:建立了从人PBMC体外扩增CD3-CD56 NK细胞体系:以SCGM为基础培养基,在600 U/mL IL-2、500 μg/L抗CD3单抗和50 mg/L PHA联合作用下,培养14 d细胞扩增了116倍,舍有(66.97±8.76)?3-CD56 NK细胞;HSP70-TKD诱导的NK细胞对HepG2杀伤活性低.与未经TKD诱导的NK细胞之间差异无统计学意义,P=0.298;而对税香烯处理过的HepG2杀伤活性高,诱导组与未诱导组之间差异有统计学意义,P=0.008;当TKD浓度为2.0 mg/L时,杀伤活性最高为(58.8±3.4)%.结论:以干细胞生长培养基为基础培养基,在抗CD3单抗和IL-2协同刺激下体外大量扩增NK细胞,HSP70-TKD诱导的NK细胞对细胞膜HSP70阳性的肿瘤细胞杀伤活性高,而对于细胞膜HSP70低表达的肿瘤细胞杀伤活性低.     

无血清培养基对体外激活的A-NK细胞的支持作用

目的多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外细胞因子激活的NK细胞的支持作用.方法分别用AIMV及完全培养基培养粘附NK细胞(A-NK)和非粘附NK细胞(NA-NK),比较细胞的增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达粘附分子CD11c的能力.结果与完全培养基培养细胞相比,AIMV培养细胞增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达CD11c的能力与之相当;在同一培养条件下A-NK细胞的增殖能力、杀伤活性高于NA-NK细胞.结论无血清培养基可替代完全培养基用于A-NK细胞的培养;A-NK细胞用于治疗肿瘤的过继免疫疗法要优于NA-NK细胞.