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相似文献
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1.
血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 克隆人血小板生成素(hTPO)基因,并使其在原核细胞中获得表达。方法 先从人胚胎肝脏中提取总RNA,进行RT-PCR获得编码氨基端195个氨基酸残基的hTPO195cDNA。将该片段亚克隆至pGEM-Teasy克隆质粒中,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将hTPO195cDNA插入到原表达质粒pET28-a中,转化大肠杆菌BLR21(DE3),进行诱导表达,以SDS-PAGE方法及免疫印迹法进行检测。结果 得到的hTPO195cDNA与文献报道的序列完全一致。经诱导后hTPO基因在大肠杆菌中获得表达,目的蛋白占总菌体蛋白的10%,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论 得到hTPO195cDNA,并在原核细胞中获得表达,得到截短形式的rhTPO195。  相似文献   

2.
rhTPO的分子克隆表达及活性测定   总被引:3,自引:2,他引:1  
分子克隆并表达具有生物学活性的人血小板生成素。方法:采用PCR,序列测定,原核表达及亲和层析法。结果;以人全长的TPOcDNA为模板,用PCR法获得了编码195个氨基酸残基的hTPO^195cDNA并克隆至原核表达质粒pMal-p2中,以麦芽糖融合蛋白方式进行了表达。  相似文献   

3.
目的;分子克隆并表达具有生物学活性的人血小板生成素(rhTPO)。方法:采用PCR、序列测定、原核表达及亲和层析法。结果:以人全长的TPOCDNA为模板[1],用PCR法获得了编码195个氨基酸残基的hTPO195cDNA并克隆至原核表达质粒pMal-p2中,以麦芽糖融合蛋白(MBP)方式进行了表达。经Amylose树脂系和层析纯化获得了较高纯度的rhTPO195融合蛋白。生物学活性测定结果显示,其促进体外培养的巨核细胞集落形成与日本麒麟(Kirin)公司产品类似。结论;获得了具有天然生物学活性rhTPO,并在原核细胞中获得表达。  相似文献   

4.
HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的:获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法:通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段,将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1,表达后进行菌体蛋白质Western blotting免疫印迹分析。结果:HPV16L1基因重组体的构建成功,克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中个有抗  相似文献   

5.
水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:利用DNA重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭不基因。方法:将水蛭素变体1的基因HV1克隆到pEZZ318表达载体,转化E.coliJM109菌株,IPTG诱导表达,增减上清液经SDS-PAGE凝胶电泳检测,hIgG-agarose亲和层析纯化。结果:表达的融合蛋白相对分子质量为20kD,表达上清的抗凝血酶和为47ATU/ml。结论:在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑  相似文献   

6.
本实验分别用两种融合表达载体(pGEX-2T及pDS-6H)在大肠杆菌XL1-Blue中表达人促红细胞生成素(h-EPO)。结果发现,虽然h-EPO基因中大肠杆菌使用频率为0%或1%的密码子占密码子总量的14.3%,但实验中却取得了较高的蛋白表达量。pGEX-2T和pDS-6H中表达的融合蛋白(分子量:44400和23800)分别占细菌总蛋白的29.7%和17.5%。从而提示,一个基因中的密码子使  相似文献   

7.
目的:研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达,为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法:采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段,克隆至载体pMDl8-T中,并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下,克隆至原核表达质粒pQE30中,经IPTG诱导表达,再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果:HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别,分子量为66KD,经IPTG诱导4h后,表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25%以上。结论:成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达,且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性,可与HPVl6抗体发生反应。  相似文献   

8.
目的:获得足够量的高纯度小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)重组蛋白。方法:酶切重组克隆质粒pMD18-MIF,将片段插入原核表达载体pQE31,构建相应的重组表达质粒pQE31-MIF,将此质粒转化大肠杆菌M15,得到转化子。经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析,并用Ni—NTA凝胶进行纯化。结果:MIF基因重组体构建成功,克隆的目的基因片段在M15中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应的特性。得到了纯化的目的蛋白。结论:MIF基因片段可在大肠杆菌中有效表达,表达产物可以与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应,并得到纯化的MIF。  相似文献   

9.
在大肠杆菌中克隆及高效表达绿色荧光蛋白基因。方法;PCR法克隆GFP-S65TcDNA并改造其两端的限制性内切酶位点,构建重组原核表达载体pRSET-GFPS65T。结果;在IPTG诱导条件下,GFP-S65T的表达量占细菌蛋白的 上。细菌培养物及其超声上清在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光。  相似文献   

10.
为探索鱼抗冻肽基因在大肠杆菌中的高效表达条件,我们将鱼抗冻肽基因克隆到原核高效表达载体P^kk223-3上,筛选到8个重组克隆,经转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导5 ̄6h,超声裂解细菌产物,在SDS-PAGE电泳胶带中分子量9KD处显示一条表达产物带,证明插入的抗冻肽基因已表达,含量占菌体总蛋白的10%左右  相似文献   

11.
Objective: To express the soluble recombinant hemangiopoietin protein in E. coli BL21 (DE3). Methods: Using human fetal live cDNA as a template, a partial cDNA fragment of HAPO coding N-terminal region was subcloned into plasmids pTrc99, pQE60 and pET32c to construct different recombinant prokaryotic expression systems. After selecting, the soluble rhHAPO fusion protein was expressed stably in E. coli BL21 (DE3) by vector pET32c-HAPO and further isolated by nickelnitrilotriacetic acid (NTA) affinity chromatography. After cleavage with enterokinase, the rhHAPO protein was applied to Fast Flow SP sepharose column. Results: The rhHAPO protein had a purity of more than 95% and a good bioactivity based on the cell adhesion assay in ECV304 cells. Conclusion: We have established a protein engineering system to produce rhHAPO which may provide the possibility for clinical application  相似文献   

12.
目的在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET-32a(+)/AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定。方法将pET-32a(+)质粒和重组pET-32a(+)/AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导时间和不同异丙基.p—D.硫代半乳糖苷诱导浓度确定最佳诱导条件,用Ni抖金属层析柱进行蛋白亲和层析,对纯化蛋白进行浓缩,蛋白质印迹鉴定所诱导的蛋白。结果得到分子量为43kD的新生蛋白,经蛋白质印迹鉴定为重组脂联素融合蛋白。结论将重组pET-32a(+)/AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中,建立表达体系,且获得高效表达。  相似文献   

13.
目的:获得重组抗菌肽S-thanatin (Ts) 在大肠杆菌的可溶性表达及分离纯化方法,通过不同方法鉴定Ts的最低抑菌浓度(MIC),揭示不同方法对结果的影响. 方法:利用基因重组手段构建表达质粒pET32a-Ts,转化大肠杆菌BL21(DE3),可溶性表达Ts融合蛋白,利用镍柱亲和层析纯化出融合蛋白,透析以后经凝血酶酶切,再通过葡聚糖凝胶G-50纯化除去融合伴侣TRX,最后冻干精制得到Ts冻干粉.利用玻璃管的常量肉汤稀释法、聚苯乙烯和聚丙烯96孔板的微量肉汤稀释法和MH琼脂打孔法测定阳离子肽Ts的抑菌活性.结果:Ts 在大肠杆菌中成功可溶性表达并获得85%以上纯度的目的蛋白.不同测定方法显示,Ts对同一菌株具有不同的MIC,以常量肉汤稀释法和聚丙烯96孔板的微量肉汤稀释法测定的多肽抑菌活性效果最佳.结论:Ts在工程菌BL21(DE3)中得到高表达,纯化出后具有较高的抑菌生物活性.不同方法测定出差异化MIC表明,阳离子肽Ts的抑菌活性易受实验材料材质影响.  相似文献   

14.
目的 研究大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌连续分离株质粒AmpC基因情况和耐药性.方法 应用聚合酶链反应(PCR)法对耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌连续分离株进行AmpC酶DHA和ACT-1基因检测和分析.结果 68株大肠埃希菌中ACT-1基因阳性4株(5.9%),DHA基因全为阴性;44株肺炎克雷伯菌中DHA基因阳性4株(9.1%),ACT-1基因全为阴性.结论 质粒型AmpC酶基因可通过转化、接合等方式转移给其他同种或不同种菌,易于传播,应加强监测.  相似文献   

15.
目的 探讨重组人内皮抑素(recombinant human endostatin,rhES)表达、纯化及复性的最佳生产方案.方法 活化rhES工程菌,诱导表达,提取并洗涤包涵体,然后变性、复性、浓缩.通过鸡胚尿囊膜实验(chorioallantoic membrane,CAM)检测rhES活性.结果 rhES产品纯度超过95%.CAM中rhES显著抑制新血管生长.结论 本实验方法可以提取到高活性、高纯度的可溶性rhES,为大规模生产rhES奠定了基础.  相似文献   

16.
大肠杆菌S—腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达   总被引:14,自引:0,他引:14  
应用PCR技术从E.coli JM109中扩增出长约1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,将其插入高表达载体pET11c的NdeI和BamHI位点中,转化E.coli BL21(DE3)。SDS-PAGE和薄层扫描结果表明,重组菌S-腺苷甲硫 酸合成酶的表达量点菌体总可溶性蛋白含量的58.3%,酶活测定结果表明,重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活力比宿主菌高7倍。  相似文献   

17.
大肠杆菌T蛋白的调节结构域的定位分析   总被引:3,自引:0,他引:3  
目的:分析大肠杆菌T蛋白是否拥有独立的调节结构域,并确定其在氨基酸序列上的定位.方法:利用分段克隆法克隆了11个大肠杆菌T蛋白的片段,检测各片段的调节活性.结果:发现大肠杆菌T蛋白的调节结构域定位于C末端约270个氨基酸,并与其预苯酸脱氢酶结构域密不可分.结论:大肠杆菌T蛋白没有独立的调节结构域.  相似文献   

18.
致病性大肠杆菌和出血性大肠杆菌的研究进展   总被引:2,自引:0,他引:2  
王建阳 《中国热带医学》2004,4(2):292-293,294
致病性大肠杆菌(EPEC)是导致婴幼儿腹泻的主要病原菌,特别在发展中国家。近期研究表明,EPEC病原与宿主细胞的作用可视为三个阶段。第一阶段,局限性的粘附在上皮细胞;第二阶段,产生分泌蛋白:第三个阶段,紧密粘附和受体蛋白的作用。一些出血性大肠杆菌侵袭人的肠上皮细胞也靠粘附和损伤作用。  相似文献   

19.
纳豆激酶原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 构建纳豆激酶原基因克隆 ,实现其在大肠杆菌中的表达。方法 从纳豆芽胞杆菌中分离纯化基因组DNA ,作为模板通过PCR扩增纳豆激酶原基因。运用重组DNA技术 ,构建表达质粒pESX 1,转化大肠杆菌JF112 5 ,温度诱导表达目的蛋白。结果 琼脂糖凝胶电脉及核苷酸序列分析证实 pESX 1为含纳豆激酶原基因的阳性克隆。在大肠杆菌中表达纳豆激酶原 ,经自体加工产生具有纤溶活性的纳豆激酶。结论 成功地构建了纳豆激酶原基因克隆 ,实现了在大肠杆菌中的表达。  相似文献   

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