LDH释放法检测肿瘤患者PBMC和CIK细胞的细胞毒活性

目的建立检测细胞毒活性的乳酸脱氢酶（LDH）测定法，了解肿瘤患者外周血单个核细胞（PBMC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）的抗肿瘤活性，为肿瘤的免疫细胞治疗提供参考。方法采集肿瘤患者和健康成人外周血，常规分离PBMC，体外进行CIK的培养，用LDH释放法分别检测PBMC和CIK对肿瘤细胞K562的细胞毒活性。结果肿瘤患者PBMC对K562的杀伤活力比正常人显著降低（P〈0．05）。经多种细胞因子诱导培养7～10d后，健康人和肿瘤患者的CIK对K562的杀伤活力都有显著提高（P〈0．01），肿瘤患者CIK杀伤活力接近于健康人。结论肿瘤患者PBMC细胞毒活性显著降低，但经诱导培养成CIK后则显著提高。用LDH释放法检测肿瘤病人CIK细胞毒活力，有助于CIK疗法适应病人的选择及个体疗效观察。     

健康人CIK细胞输注对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响

目的:研究用健康人细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)输注前后恶性肿瘤患者外周血细胞免疫功能的变化.方法:分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),予rhIFN-γ、rhIL-2、rhIL-1β、CD3单克隆抗体(CD3mAb)诱导CIK细胞,回输至病人体内;比较肿瘤患者用CIK细胞治疗前后PBMC对K562的杀伤活性和外周血T淋巴细胞亚群绝对计数的变化情况.结果:肿瘤患者治疗前PBMC杀伤活性和淋巴细胞亚群绝对计数均低于健康人,治疗后除NK细胞绝对计数未见明显改变外均有所提高,但仍比健康人低.结论:健康人CIK细胞治疗能提高肿瘤患者自身抗肿瘤能力.     

细胞因子诱导杀伤细胞抗淋巴瘤细胞作用的研究

目的:探讨体外细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:采集健康人外周血单个核细胞(PBMC),经IL-2、CD3Mc-Ab、IL-1、IFN-γ诱导,制备CIK细胞,同时以淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)作为对照,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型,LDH释放法检测其对淋巴瘤细胞株的杀伤活性.结果:CIK细胞与LAK细胞增殖在前期无明显差异,CIK细胞在培养14d后大量增殖,21d后扩增能力显著高于LAK细胞(P＜0.05);表型分析表明CIK细胞主要由CD3+和CD56+双阳性细胞构成;同一效靶比时,CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤活性明显高于LAK细胞(P＜0.05).结论:CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤作用强于LAK细胞,具有较强的抗淋巴瘤细胞活性,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞.     

肿瘤自体CIK细胞免疫治疗前后T细胞亚群的变化

细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）具有增殖快、杀瘤活性强和杀瘤谱广的特点。目前，用于临床治疗肿瘤的报告较少。本文用CIK细胞过继性免疫治疗肿瘤患者，探讨其对细胞免疫的影响。方法：用CS-3000得到肿瘤患者未梢血单个核细胞（PBMC），用含有IFN-r、IL-2和CD3单抗的培养液进行培养扩增，于培养的第11天和第12天回输给病人，并检测CIK治疗前后患者的外周血T细胞亚群的变化。结果：38例肿瘤患砉输注CIK细胞一疗程后，患者外周血CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞都较治疗前明显提高（P〈0．01）。结论：用自身CIK细胞过继性回输治疗能明显提高肿瘤患者细胞免疫功能。     

DC-CIK细胞的生物学活性及体外抗白血病作用的研究

本研究探讨树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及抗白血病细胞的作用。健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK，将DC与CIK共培养，以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数，MTT法测定杀伤活性，流式细胞术分析免疫表型，ELISA双抗体夹心法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明：DC—CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0．05）；DC、CIK细胞共培养后，CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0．05）；共培养3天，DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0．01，P〈0．05）；在5：1—40：1的效靶比范围内，DC—CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0．05），且杀伤率与效靶比呈正相关。结论：DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性，有可能作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗手段。     

骨髓源性树突状细胞增强CIK细胞抗肿瘤活性的研究

目的探讨骨髓源性树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖能力、免疫表型、以及抗淋巴瘤细胞的作用。方法取昆明小鼠骨髓单个核细胞在体外诱导DC和CIK细胞,同时用鼠脾脏单个核细胞诱导CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,流式细胞术检测免疫表型,MTT法测定杀伤活性。结果DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0.05）,骨髓DC-CIK细胞与脾脏DC-CIK细胞增殖无明显差异。DC-CIK细胞共培养后,CD3^＋和CD3^＋CD8^＋、CD3^＋NK1.1^＋双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0.05）;在5∶1-40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0.05）,且杀伤率与效靶比呈正相关。结论骨髓源性DC增强CIK细胞的增殖能力,DC-CIK细胞增加抗淋巴瘤细胞的活性。     

脐血树突状细胞对同源CIK细胞生物学活性及抗白血病作用影响的研究

本研究旨在探索脐血树突状细胞（DC）对同源细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞体外增殖、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对白血病细胞细胞毒作用的影响。采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞或外周血DC—CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤白血病细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN—γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明,脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于脐血CIK细胞和外周血DC-CIK细胞（P〈0．05、P〈0．05）;脐血DC、CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比例较相同奈件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3天,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ 、TNF—α含量均比单纯培养CIK细胞分泌含量高（P〈0．01、P〈0．05、P〈0．05）;在2．5：1—20：1的效靶比范围内,脐血DC—CIK细胞对各亚型急性白血病细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（p〈0．05）,但对各亚型白血病细胞杀伤活性无显著性差异,与外周血DC—CIK细胞对白血病杀伤效应相类同。结论：脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗白血病效应。脐血DC。CIK细胞增殖能力比外周血DC—CIK细胞强,但两者在细胞毒方面无显著性差异。因脐血较易获得,且输注不易引起严重的排斥反应,因而DC—CIK细胞在免疫治疗方面具有更广泛的临床应用前景。     

PHA 诱导的 CIK 细胞的生物学特性及其对 K562 细胞杀伤活性影响的研究简

本研究探讨植物血凝素（PHA）诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）与传统方法制备的CIK细胞的体外增殖能力、效应细胞含量和对K562细胞杀伤活性影响并分析其差异.分离健康人外周血单个核细胞（PBMNC）,分甲、乙两组,其中甲组用传统培养方法从PBMNC制备的传统CIK细胞,乙组采用PHA诱导单个核细胞制备获得的新型CIK细胞.在培养过程中,每3d统计各组细胞培养体系中细胞活率和细胞绝对值,并在培养至第15天时,用流式细胞仪分别检测两组细胞免疫表型,统计CD3＋ CD56＋、CD3＋ CD8＋和CD3＋ CD4＋细胞占各培养体系总细胞数的比例;同时用CCK-8试剂盒分别检测两组细胞在不同效靶比时对K562细胞的杀伤活性.结果表明：采用PHA诱导制备新型CIK细胞的方法比传统方法更能促进细胞增殖（P＜0.05）,且细胞活率都保持在90％以上.两组CD3＋ CD8＋、CD3＋ CD56＋细胞比例都显著升高.与传统方法比,新方法的CD3＋ CD8＋细胞升高比例存在显著差异（P＜0.05）,CD3＋ CD56＋细胞提升比例不存在差异,同时CD3＋ CD4＋下降的比例也不存在差异.效靶比为5：1、10：1、20：1、40：1时,PHA诱导制备的新型CIK细胞比传统方法制备的CIK细胞对K562细胞的杀伤活性更强（P＜0.05）,且随着效靶比的升高两种效应细胞对K562细胞的杀伤活力的差异明显性也增加.结论：与传统方法相比,PHA可明显提高CIK细胞的增殖能力,调高CD3＋ CD8＋细胞的比例,增强CIK细胞对K562细胞的杀伤活性,这为白血病及其他肿瘤的细胞免疫治疗提供一种新来源的CIK细胞和可靠依据.     

DC／CIK联合免疫治疗晚期肿瘤患者的护理体会

树突状细胞（DC）是体内最有效的专职抗原递呈细胞（APC），通过MHCⅠ、Ⅱ类途径将外源性抗原呈递给CD3＋CD4及CD3＋CD8＋T细胞，诱导机体产生抗原特异性CYL，识别和杀伤肿瘤细胞，并能抑制肿瘤血管生成，同时激发免疫记忆保护。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），是人外周血单个核细胞（PBMC）在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞，具有增殖性、杀癌活性强、杀瘤谱广的特点。临床上曾经使用CIK单独治疗，它主要用于手术、放化疗后肿瘤微小残留病灶的清除。而在CIK细胞培养的过程中加入自体DC后CIK细胞的杀瘤活性显著增强。南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤科将此基础研究成果运用于临床，采取了静脉采血进行细胞培养后第7天DC回输及第15天CIK回输的治疗方案。本文将此治疗中的护理措施汇报如下。     

细胞因子诱导的杀伤细胞

正常人或患者外周血，骨髓单个核细胞/淋巴细胞中定期加入γ-干扰素（IFN-γ），白细胞介素-1（IL-1），白细胞介素-2（IL-2），抗CD3抗体（CD3mAb)经2-4周的诱导可获得大量的新型肿瘤杀伤细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK)，增殖旺盛及肿瘤杀伤活性高，包含大量CD3^ CD56^ 细胞，有关基础及临床研究证明，CIK细胞较细胞毒性T淋巴细胞（CTL），淋巴细胞因子活化的杀伤细胞（lymphokine-activted killer,LAK)，肿瘤细胞浸润的淋巴细胞（tumer infiltrating-lym-phocyte,TIL）更适用于肿瘤的生物治疗，本文就CIK细胞的来源与生物学特征，对肿瘤细胞的杀伤及临床应用进行综述。     

树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养增强其体内外抗肿瘤活性

目的探讨与树突细胞(DC)共培养能否增强正常人细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的体内外抗瘤活性.方法分别按照常规方法从正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将NB4白血病细胞冻融物(LCL)冲击或未冲击的DC与CIK细胞共培养(LCL-DC+CIK、DC+CIK),以CIK细胞单独培养作为对照.用流式细胞术分析细胞表型,酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定分泌IFN-γ的细胞数,51Cr释放实验测定体外细胞毒活性,同时用NB4细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肿瘤活性和归巢情况.结果在培养第15天, LCL-DC+CIK与CIK细胞单独培养相比,增殖速率明显提高 [(18.2±2.1)倍vs(11.6±2.3)倍, P<0.05],CD3+CD56+ 表达水平也明显提高 [(51.05±2.63)% vs(30.18±1.45)%, P<0.05],分泌IFN-γ的细胞数量明显增高 [(86.33±5.51)/104细胞 vs(44.61±3.05)/104细胞, P<0.05],同时LCL-DC+CIK对NB4、K562、KG1a的体外细胞毒活性增强.体内实验显示与单独培养CIK细胞相比,LCL-DC+CIK细胞共培养后,可明显抑制接种瘤细胞裸鼠的成瘤率,提高裸鼠的长期无瘤存活率(100% vs 66.7%, P<0.05),以DiI标记的LCL-DC+CIK细胞在接种后7 d内可在脾脏、淋巴结及肿瘤局部被检测到.LCL-DC+CIK与DC+CIK细胞在抗瘤效应上没有明显差异.结论与DC共培养可使CIK细胞获得更高的增殖速率和更强的体内外抗肿瘤活性,可以作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略.     

肿瘤细胞培养上清对CIK细胞活性影响的研究

目的 探讨两种血液肿瘤细胞K562和HL－60培养上清液对脐带血CIK细胞的影响作用。方法 在细胞因子诱导的脐带杀伤细胞（CIKs）形成的过程中，加入肿瘤细胞培养上清，观察CIK细胞为主的异质性细胞群体。随培养时间延长，CD3^＋CD56^＋细胞比例明显升高。K562和HL－60培养上清液能明显抑制CIK的增殖率和杀伤活性，免疫表型亦有显著的变化(P＜0．05）。结论 K562和HL－60培养上清液能抑制脐带血CIK细胞的活性，这可能是肿瘤细胞免疫逃避和耐受的原因。     

热休克胃癌细胞负载DC-CIK细胞杀伤癌细胞活性的研究

目的研究负载相关抗原的树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞对胃癌细胞的杀伤作用。方法取健康人外周血并分离出外周血单个核细胞(PBMC),经不同细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,热休克方法处理胃癌MKN-28细胞株并制备肿瘤抗原用于负载DC,与CIK细胞共培养,以流式细胞术检测DC、CIK细胞表型,MTS法检测CIK细胞对MKN-28细胞的杀伤作用。结果 CIK与DC共培养后,与单纯CIK细胞相比较,增殖活性明显提高,CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞数增多并且具有更强的杀瘤活性,效靶比为20.0∶1时,负载MKN-28抗原的DC-CIK(Ag-DC-CIK)组对MKN-28的杀伤活性为(57.96±2.23)%,远大于未负载MKN-28抗原的DC-CIK组[(38.02±2.06)%]和单纯CIK组[(29.78±1.84)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。结论以热休克凋亡肿瘤细胞抗原负载的DC能促进CIK细胞增殖分化,并提高其对胃癌细胞的杀伤活性。     

恶性肿瘤患者外周血CIK细胞体外增殖能力及其杀伤活性

[目的]研究恶性肿瘤患者外周血自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)体外增殖情况及杀伤活性,为肿瘤自体CIK细胞治疗提供实验依据.[方法]从恶性肿瘤患者的外周血中分离出CIK细胞进行体外培养,使用细胞计数板计数不同时间点CIK细胞的数目及MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀伤活性.[结果]低年龄组较高年龄组CIK细胞体外增殖及杀伤活性强( P ＜0.01),不同分期的肿瘤患者CIK细胞体外增殖能力及杀伤活性均较强,不同分期之间无显著性差异( P ＞0.05);不同性别的恶性肿瘤患者CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性无明显差别( P ＞0.1).恶性肿瘤患者的CIK细胞在体外对不同肿瘤细胞均具有较强的杀伤活性,对人乳腺癌细胞(MCF-7),肺癌细胞株(SC-1680),前列腺癌细胞株(PC-3),宫颈癌细胞株(Hela)的体外杀伤活性均超过50%.[结论]患者年龄是影响其外周血CIK细胞体外增殖能力及杀伤活性的重要因素,而肿瘤分期、患者性别对CIK细胞的体外增殖能力及杀伤活性无明显影响;CIK细胞具有较广的抗肿瘤细胞的特点.     

自体外周血单个核细胞制备CIK细胞治疗恶性实体肿瘤应用价值研究

目的探讨自体外周血单个核细胞(PBMC)应用于恶性实体瘤过继性免疫治疗的有效性。方法选取恶性实体瘤患者100名,粒细胞动员后,单采PMBC并计数,分析相关因素;流式检测CIK细胞中NKG2D受体率及CIK细胞治疗前后外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3+CD56+百分率;采用LDH释放法检测PMBC及CIK细胞的杀伤活性;利用Kaplan-Meier生存曲线对比分析CIK治疗组与非治疗组的生存期差异。结果 PMBC数与采血前外周血象的WBC及MNC总数相呈正相关,相关系数r分别为0.62、0.72(P<0.05),而与采集时间及血液流速无关。对照组、实验组各组CIK的杀伤活性与PMBC杀伤活性呈正相关(r分别为0.523、0.627,P<0.05)。培养前、培养至d 7、培养至d 14时CIK细胞杀伤活性都与NKG2D受体表达率成正相关r,分别为0.413、0.5460、.657(P<0.01)。CIK回输治疗前、后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD3+CD56数量分别为38.66±8.34及62.15±12.36(P<0.05)、30.16±10.26及38.15±9.46(P<0.05)、37.42±11.12及25.74±10.35(P<0.05)1、.15±0.12及1.89±0.12(P>0.05)、17.63±4.25及25.89±8.96(P<0.05)、0.93±0.31及5.67±1.84(P<0.05)。对照组及CIK治疗组的3年生存率平均为86.5%及79%(P<0.05)。结论实体瘤患者的自体PMBC可以用于CIK细胞的制备及治疗。     

PHA对CIK细胞增殖和细胞毒作用影响的研究

为了探讨植物血凝素 (PHA)对细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK)增殖和细胞毒作用的影响 ,分离健康人外周血单个核细胞 ,用含自体血浆的培养液培养CIK细胞和PHA先刺激 2 4小时的PHA CIK细胞。用51 Cr释放法检测两种细胞对K5 6 2细胞、食管癌细胞和初治急性白血病病人骨髓幼稚细胞的细胞毒作用。结果表明 :两种细胞体外增殖能力较强 ,且PHA CIK细胞强于CIK细胞 (P <0 .0 5 )。两种细胞对不同靶细胞均有较强的杀伤能力。在效靶比为 2 0∶1、10∶1时 ,PHA CIK细胞对K5 6 2细胞和初治急性白血病病人骨髓幼稚细胞的杀伤作用强于CIK细胞 (P <0 .0 5 )。结论 :PHA增加CIK细胞的增殖能力和抗肿瘤活性 ,可作为生物治疗应用于临床。     

自体活化脾细胞输注后T细胞亚群及PBMC细胞活性的临床观察

目的：细胞因子诱导的杀伤细胞具有可以快速增殖、高效和抗瘤谱广的特点。但是有关该细胞在肿瘤患者临床应用的报道甚少。本文旨在探讨自体脾细胞经黄芪皂甙（Astragalus Saponin）和小剂量rIL-2活化后过继免疫治疗对肝癌伴有脾功能亢进的患者免疫功能的影响。方法：16例患者均接受肿瘤切除、脾脏切除、皮下肝动脉泵埋入术和自体活化脾细胞过继免疫治疗。患者于手术前、后及过继免疫治疗后采集外周血Ficoll-Hypaque gradient分离单个核细胞，流式细胞仪检测CD44＋、CD44＋／CD8＋和NK细胞水平；MTT法检测PBMC细胞活性。结果：患者手术前、后CD44＋、CD44＋／CD8＋和NK细胞水平明显低于过继免疫治疗后（P〈0．01），而CD8＋细胞水平明显高于过继免疫治疗后（P〈0.01）；自体活化脾细胞过继免疫治疗后PBMC细胞活性明显高于手术前、后（P〈0．05）。结论：自体活化脾细胞过继免疫治疗可有效地提高患者的细胞免疫功能，且无副作用，对肝癌伴脾亢患者是一安全而有效的治疗方法。     

细胞因子诱导的杀伤细胞基本特性及抗肿瘤效应研究

目的建立培养细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞方法,并评价其基本特点、体内外抗肿瘤活性及安全性。方法使用抗CD3单克隆抗体、rhIL-2及rhIFN-γ刺激PBMC细胞,使其在体外大量扩增,利用流式细胞术、体外杀伤实验及荷人卵巢癌小鼠模型检测CIK细胞的特点及抗肿瘤活性;并检测CIK细胞中外源性因子污染情况及其急性毒性作用。结果体外培养21 d后,CIK细胞总数可达1010以上,其主要成分为CD3+CD8+T细胞及CD3+CD56+NKT细胞,CIK细胞在体外对Ho8910、A549、K562及HepG2细胞均有较高的杀伤活性,并对荷瘤小鼠具有治疗作用。同时在CIK细胞中未检测到外源性病原体污染。结论 CIK细胞在体内外均具有较高的抗肿瘤活性且无毒性作用。