PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

TNF—α拮抗胰岛素样生长因子—1对人α1（Ⅰ）胶原启动子？…

目的：探讨ＴＮＦ－α对胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ－１）激活人α１（Ⅰ）胶原启动子的作用。方法：构建含不同长短α１（Ⅰ）胶原启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因的重组体ｐＣＯＬＨ１ ０．２７,ｐＣＯＬＨ１ ２．５用脂质体法瞬时转染至ＮＩＨ３Ｔ３细胞的人皮肤成纤维细胞中,加入ＩＧＦ－１或（和）ＴＮＦ－α,测定ＣＡＴ活性。结果;１００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１可使转染至ＮＩＨ３Ｔ３细胞的ｐＣＯ     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

人白细胞介素2,β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人…

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细     

人白细胞介素2、β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人肾细胞癌及其TIL中的表达

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）。经Ｇ４１８选择阳性克隆后测上清表达ＨｕＩＬ－２及ＨｕＩＦＮ－β活性。结果ＨｕＩＬ－２和ＨｕＩＦＮ分别在转ＨｕＩＬ－２基因和ＨｕＩＦＮ－β基因肾细胞癌细胞的表达量达２５０Ｕ／１０６细胞·ｄ－１和６４００Ｕ／１０６细胞·ｄ－１，在经目的基因转染ＴＩＬ细胞中的表达量分别比未经目的基因转染的ＴＩＬ高２～３倍和４～８倍。ＴＩＬ生长状况未有明显改变，抗肿瘤活性未见明显增强。     

血小板源性生长因子和转化生长因子-β_1对大鼠肺成纤维细胞整合素α_5β_1表达的影响

目的观察血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）和转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）对大鼠肺成纤维细胞整合素（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）α５β１及其配体纤维连接蛋白（ＦＮ）合成的影响。方法采用细胞培养、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、免疫细胞化学方法。结果经ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＴＧＦ－β１作用２ｈ，α５、β１、ＦＮｍＲＮＡ的表达即强于对照组，以后继续增强，其间仅于１８或１２ｈ短暂回落，但仍明显强于对照组。免疫细胞化学显示肺成纤维细胞α５β１和ＦＮ蛋白的表达也明显增强。结论ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β１可以促进ｉｎｔｅｇｒｉｎα５β１及其配体ＦＮ的合成增加，其调控机制之一可能是在转录水平上增强ｉｎｔｅｇｒｉｎα５β１及其配体ＦＮｍＲＮＡ的表达。     

血小板源生长因子-AB对成纤维细胞周期及DNA合成的影响

目的：探讨血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）－ＡＢ在创面愈合及瘢痕增生过程中的作用机制;方法：取第３代～６代体外培养的人正常皮肤成纤维细胞（ＮｓＦｂ）及增生性瘢痕成纤维细胞（ＨＴｓＦｂ）,经ＰＤＧＦ－ＡＢ作用后,用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法测定ＤＮＡ合成的变化,用汉式细胞术测定细胞周期的变化。结果：ＰＤＧＦ－ＡＢ作用后,两种细胞ＤＮＡ民均明显增加,Ｓ期细胞数百分比均明显增高,Ｇ１期细胞不断进入Ｓ期,但作用有划     

老年Graves病患者血清骨钙素与甲状腺功能关系的研究

目的　探讨老年Ｇｒａｖｅｓ 病骨病的发病机制,对不同治疗阶段患者血清骨钙素（ＢＧＰ）及甲状腺功能进行检测并作对比分析。方法　采用放射免疫技术检测Ｇｒａｖｅｓ 病患者血清ＢＧＰ及甲状腺功能指标（ＦＴ３ 、ＦＴ４ 、ＴＳＨ、ＴＧ－ Ａｂ、ＴＭ－ Ａｂ）。结果　Ｇｒａｖｅｓ 病患者血清ＢＧＰ明显升高,相关分析揭示ＢＧＰ与ＦＴ３ 、ＦＴ４ 呈正相关（ＦＴ３ ：ｒ＝ ０．５８２ ,Ｐ ＜ ０．０１;ＦＴ４ ：ｒ＝ ０ ．６２１,Ｐ＜ ０．０１）,与ＴＳＨ、ＴＧ－ Ａｂ、ＴＭ－ Ａｂ 无相关（ Ｐ ＞ ０．０５） 。结论　ＢＧＰ 是Ｇｒａｖｅｓ 骨病病情控制与否的一项较敏感性指标,Ｇｒａｖｅｓ 病骨转换受ＦＴ３ 、ＦＴ４ 影响,而与机体免疫状态无相关。提示老年Ｇｒａｖｅｓ 病的防治主要是以抗甲亢治疗为基础Ｔ３ 、Ｔ４ 恢复至正常水平后才能使骨转换率尽快得到控制。     

β─胡萝卜素对促癌剂抑制细胞间隙连接通讯的影响

研究了β－胡萝卜素（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）在ＳｗｉｓｓＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的代谢情况及其对促癌剂ＴＰＡ（１２－ｏ－ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ－１３－ｐｈｏｒｂｏｌ－ａｃｅｔａｔｅ）抑制ＮＩＨ／３Ｔ３细胞间隙连接通讯（ＧＪＩＣ）的影响。结果显示：β－胡萝卜素在ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中不能转化为视黄醇，对ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＧＪＩＣ功能有诱导作用，同时对ＴＰＡ抑制ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＧＪＩＣ功能有不同程度的拮抗作用。提示β－胡萝卜素的抗癌作用可能与细胞ＧＪＩＣ功能变化有关。     

IL－1α诱导牛脑微血管内皮细胞释放血小板衍生性生长因子

目的：研究白细胞介素－１α（ＩＬ－１α）诱导牛脑微血管内皮细胞（ＢＣＭＥＣ）释放血小板衍生性生长因子（ＰＤＧＦ），以及药物对由之引起的牛脑微血管平滑肌细胞（ＢＣＭＳＭＣ）增殖的拮抗作用。方法：体外培养ＢＣＭＥＣ和ＢＣＭＳＭＣ，结晶紫染色法测定细胞增殖。结果：ＩＬ－１α不能直接促进ＢＣＭＳＭＣ的增殖；但经ＩＬ－１α刺激的ＢＣＭＥＣ培养上清能显著地促进ＢＣＭＳＭＣ的增殖。这种增殖作用与ＩＬ－１α剂量呈正相关，并且可被抗ＰＤＧＦ抗体中和。欧芹素乙（Ｉｍｐ），异欧芹素乙（ｉｓｏ－Ｉｍｐ），６－（α，α－ｐｈｅｎｙ－ｌａｃｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ－５－ｍｅｔｈｙｌ－４，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－３（２Ｈ）－ｐｙｒｉｄａｚｉｎｏｎｅ（ＰＭＤＰ）不影响ＩＬ－１α诱导ＢＣＭＥＣ释放ＰＤＧＦ，但对ＰＤＧＦ促ＢＣＭＳＭＣ增殖呈剂量依赖的拮抗。结论：ＩＬ－１α促进ＢＣＭＥＣ释放ＰＤＧＦ。ＩＬ－１α对ＢＣＭＳＭＣ增殖的促进作用需经ＰＤＧＦ等生长因子的介导。Ｉｍｐ，ｉｓｏ－Ｉｍｐ，ＰＭＤＰ拮抗ＰＤＧＦ引起的ＢＣＭＳＭＣ增殖。     

血小板生长因子在NIH3T3成纤维细胞和MT3转化细胞应答中的作用

血小板生长因子(PDGF)通过促进细胞外Ca~(2 )内流,增加细胞内Ca~(2 )浓度,但在亲代NIH3T3成纤维细胞和转化的MT3细胞中,却表现出不同的作用。在亲代NIH3T3成纤维细胞中,PDGF能够抑制舒缓激肤介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加,未能见到细胞内Ca~(2 )波动现象;而在转化的MT3细胞中,PDGF丧失了对舒缓激肽介导的细胞内Ca~(2 )浓度增加的抑制作用,常常引起细胞内Ca~(2 )波动现象。对于DNA的合成,PDGF在两种细胞中,也表现出有时程的差异。     

人类乳头瘤病毒16型DNA诱导NIH 3T3细胞的恶性转化

用人类乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）１６型ＤＮＡ，通过磷酸钙沉淀技术在体外成功地使ＮＩＨ３Ｔ３细胞发生恶性转化，转化细胞克隆后分析表明存在如下特征：转化细胞形态上变宽，呈多角状生长并形成集落；细胞的停泊依赖性下降；能在含１％小牛血清培养基中良好生长。转化细胞的密度依赖性下降。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交发现ＨＰＶ１６ＤＮＡ以整合状态存在于ＮＩＨ３Ｔ３细胞ＤＮＡ中。     

白血病病毒感染的SRSV/3T3细胞系DNA转化机制探讨

将SRSV/3T3细胞DNA转染NIH/3T3细胞,转染后17d,实验组出现18个集落,对照组出现4个集落。将实验组集落细胞接种于3只BALB/C裸鼠皮下,全部长成纤维肉瘤。将SRSV/3T3细胞DNA用EcoRI和BamHI酶切电泳,分别应用5种癌基因(v-myc、KJ-ras、v-src、v-sis和e-fos)作Southern印迹和分子杂交。发现SRSV/3T3细胞DNA的BamHI酶切片段与c-fos探针杂交后,在2.2～3.0 kb处出现阳性杂交带。应用c-fos单抗检测转化细胞,细胞核内呈阳性反应。表明SRSV/3T3细胞DNA含有fos样转化基因,在转化细胞内有此基因的过度表达。     

五种抗氧化剂对细胞膜紫外线损伤的防护作用

目的 研究5种抗氧化剂对细胞膜流动性的防护作用。方法 用粘附式细胞仪(ACAS570) 检测。结果与结论 紫外线（UVB）照射能迅速增高NIH3T3细胞中的脂质过氧化物。UVB照射10 min的NIH3T3细胞 (阳性对照组) 膜流动性明显低于阴性对照组(正常NIH3T3细胞,不用UVB照射)。超氧化物歧化酶（SOD）的保护作用不明显,加入该抗氧化剂的样本其细胞膜的流动性降低到与阳性对照组相同的数量级。维生素E、过氧化氢酶（CAT）、SOD+CAT、茶多酚的保护作用较明显,加入这些抗氧化剂的样本其细胞膜的流动性与阳性对照组比较,均高出一个数量级。     

Regularity of ultraviolet (UV)-induced NIH3T3 cell damage and characteristics of DNA cleavage in UV-induced NIH3T3 cells apoptosis

INTRODUCTIONThesolarspectrumonthesurfaceoftheearthcomprisesultraviolet(UV),visibleandinfraredradiation,withrelativeintensityof3%,37%and60%respectively.Inaddition,X--raysandradiowaveshavebeendetected,however,theirintensityisnegligiblylowllj.AlthoughUVradiationisaminorpartofthesolarspectrum,itisconsideredtobeveryeffective.Basedondifferencesinbiologicalresponses,UVradiationissubdividedintothreewavebands:UVC(100urn--280"m),UVB(180urn--320urn)andUVA(320urn--400"m)[ZJ.Inthisstudy,cytotox…     

钙整合素结合蛋白CIB真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建钙整合素结合蛋白(calcium- and integrin-binding protein, CIB)的真核表达载体,了解它在真核细胞中的表达及定位.方法 从人脑组织分离总RNA,采用RT-PCR获得CIB开放读框序列,克隆至真核表达载体pCMV-myc,构建表达带myc表达标签的真核表达载体pCMV-myc-CIB,将其转染至NIH3T3细胞中,免疫组化鉴定其在细胞中的表达及定位.结果 序列分析表明克隆的CIB序列与GeneBank报道的序列一致,脂质体转染入NIH3T3细胞中,用myc抗体检测到目的蛋白myc-CIB的表达.结论 pCMV-myc-CIB表达载体构建成功,并在真核细胞中得到了正确表达,CIB蛋白主要定位于细胞质中.     

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的：构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法：设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果：重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论：成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。     

人乳头瘤病毒16型基因组体外转化活性的研究

目的应用重组的人乳头瘤病毒16型（HPV－16）基因组体外转化NIH／3T3细胞，以评价HPV－16的转化活性。方法将HPV－16基因组正向括人pSV2／neo质粒，构建成pSV2－neo／HPV－16真核细胞表达质粒；用磷酸钙转染法，将其导人体外培养的NIH／3T3细胞；对经转化的细胞进行G418选择培养和核酸杂交分析。结果经选择培养获得了具有恶性表型的转化细胞，其主要表现为接触性抑制消失和非锚地依赖性生长；核酸杂交证明，转化细胞内含有HPV—16DNA序列。结论HPV—16基因组具有体外转化NIH/3T3细胞的活性。     

昆明山海棠诱导Jurkat等3个细胞株微核形成的研究

目的：为研究昆明山海棠（THH）的毒理作用。方法：使用流式细胞仪检测发现THH均可诱导Jurkat、CHE和NIH3T3细胞株微核形成和细胞凋亡。结果：3个细胞株表现出完全相似的变化规律,但Jurkat淋巴瘤细胞更为敏感,仅25μl/皿即在各时相点出现微核形成高峰,50μl/皿即出现细胞凋亡高峰。结论：THH对Jurkat肿瘤细胞比对CHE和NIH3T3细胞具有更大的细胞毒性。