应用RNA探针检测流感病毒特异性RNA

插入流感病毒Ａ／Ａｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）ＮＰ ｃＤＮＡ的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ＾＋质粒，分别经Ｘｃｍ Ｉ和ＢｓｐＭＩ线性化之后，以此为模板用Ｔ７和Ｔ３ＲＮＡ多聚酶合成了同位素标记的正链和负链ＲＮＡ探针。流感病毒在狗肾传代细胞（ＭＤＣＫ）生长良好，而在其变异株ＭＤＣＫ－Ｌ细胞生长受阻。为了分析比较两种细胞中流感病毒基因复制情况，作者应用上述ＲＮＡ探针，检测了接种流感病毒的两种细胞中病毒ＲＮＡ（ｖ     

快速一步法抽提心肌组织细胞总RNA

用快速一步法（简称快速法）抽提心肌组织细胞总ＲＮＡ，产量达２．１９±０．２９ｕｇ·ｍｇ＾－１心肌组织，纯度指标（Ａ２６０／２８０）为１．９３±０．０３；各指标均高于ＡＧＰＣ法（Ｐ〈０．０１）。操作时间由４ｈ缩短至２．５ｈ。心肌组织细胞总ＲＮＡ置普通琼脂糖凝胶上电泳，可见２８Ｓ，１８Ｓ和５Ｓ（５．８Ｓ）三条清晰的区带。Ｎｏｒｔｈｅｎ杂交证明该法抽提的总ＲＮＡ无ＤＮＡ污染，不降解。快速法可取代ＡＧＰＣ     

现代分子生物学技术系列讲座之四反义核酸技术

现代分子生物学技术系列讲座之四──反义核酸技术杜卫东（生物化学与分子生物学研究中心）反义核酸技术是利用人工合成的特异性反义寡核苷酸定向抑制或封闭同的基因（ＤＮＡ或ＲＮＡ）表达的技术。它包括三方面的内容：（１）反义及ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ），...     

病毒性心肌炎患者的病原及病毒抗体和抗原核酸的研究

目的：探讨病毒性心肌炎患者１２９例，对照组４０例，血甭中柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）的中和抗体、ＩｇＭ抗体及其核糖核酸（ＲＮＡ）基因的关系。同时对白细胞（ＷＢＣ）、咽拭子、尿、血清中的ＲＮＡ阳性检测率的比较。方法：咽拭子分离病毒；微量法测血清中和抗体，间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测ＩｇＭ抗体；用反转录－结合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测ＣＢＶ特异性核糖核酸（ＲＮＡ）。结果：分离出病毒３２株     

一种去除牛血清白蛋白中RNA酶的方法

本文建立了一种简便、快速的去除牛血清白蛋白（ＢＳＡ）中微量核糖核酸（ＲＮＡ）酶的方法。未经高岭土处理的ＢＳＡ有ＲＮＡ酶活性，于一定量ＲＮＡ３７℃温浴２小时后部分ＲＮＡ被水解；而应用高岭土吸附后ＢＳＡ中ＲＮＡ酶的活性明显降低，３７℃２小时内未表现出ＲＮＡ酶活性。ＢＳＡ回收率达６６．３％。     

人肝癌及癌周组织中总RNA和NOS的表达与改变

目的：探讨一氧化氮合酶（ＮＯＳ）在人肝癌发生过程中的表达及作用机制。方法：以病理组织学和分子生物学方法，分析１６例自身配对的肝癌，癌旁组织和远癌组织中总ＲＮＡ浓度，并以重氮法和硝酸还原酶法分别定量不同组织中ＮＯＳ的比活性和一氧化氮（ＮＯ）浓度。结果：经病理组织学证实的１６例肝癌，癌旁和远癌组织中：①从癌灶→癌旁→远癌组织中，总ＲＮＡ浓度呈逐步升高活性改变与肝总ＲＮＡ浓度、或与ＮＯ水平呈明显正相关，     

反义RNA对培养的红系细胞βIVS—2—654C→T基因剪接缺陷的纠正

目的观察反义ＲＮＡＡ２对培养的红系细胞中βＩＶＳ－２－６５４Ｃ→Ｔ（β６５４）突变基因剪接异常的纠正作用。方法将构建的反义核酸真核表达载体通过脂质体介导转染培养的成人红系细胞（ｈＡＥ），应用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）定量测定β珠蛋白ｍＲＮＡ及微量珠蛋白生物合成技术分析转染前后ｈＡＥ细胞内珠蛋白基因表达的变化。结果β６５４／β４１－４２基因型ｈＡＥ细胞内，正常剪接的βｍＲＮＡ占总βｍＲＮＡ的比例从转染前的０．０２４上升到第８天的０．３８０；β６５４／βＡ基因型ｈＡＥ细胞从０．３９６上升到０．８８３；与此相应，新合成的β珠蛋白链也出现升高：β６５４／β４１－４２基因型ｈＡＥ细胞β／α比值从０．０５２升至０．３５９，β６５４／βＡ基因型ｈＡＥ细胞从０．６２４升至０．８２０；正常人ｈＡＥ细胞珠蛋白基因表达不受反义ＲＮＡ的影响。结论反义ＲＮＡＡ２能有效地纠正ｈＡＥ细胞内β６５４ｍＲＮＡ前体异常剪接，进而明显地升高β珠蛋白链的合成，为β６５４地中海贫血的反义ＲＮＡ治疗提供了科学依据。     

核糖核酸阻抑家兔肝纤维化的作用机制探讨

通过电镜，生化，免疫学等方法观察了ＲＮＡ对感染尾蚴兔的作用，结果表明，ＲＮＡ能使感染尾蚴兔肝细胞核仁增大，粗面内质网及其颗粒增多，肝ＲＮＡ含量增加，血浆ＴＮＦα降低，分析结果提示ＲＮＡ是通过其模板作用和基因调控作用，免疫调节作用等阻换兔肝化进展加重的。     

针吸直肠肿瘤细胞DNA及RNA的定量研究

应用流式细胞分析技术对２９例直肠癌针吸细胞的ＤＮＡ和ＲＮＡ含量进行定量分析，结果：针吸细胞行流式细胞ＤＮＡ，ＲＮＡ分析成功率为１００％（直肠癌诊断准确率为１００％）２９例术前针吸组织和手术切除组织的ＤＮＡ，ＲＮＡ含量，Ｓ期细胞比无统计学差异（Ｐ〉０．０５），提示术前针吸直肠癌组织细胞行ＤＮＡ，ＲＮＡ含量分析是可行的，可为直肠癌的诊断治疗提供新参数。     

逆转录—多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒RNA方法的建立及实…

对逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ）的方法学进行了探讨，逆转录与多聚酶反应是否在同一反应管内进行，对ＨＣＶＲＮＡ检测结果没有明显影响，但在操作难易程度，ＴａｑＤＮＡ聚合酶的选择等方面有差别，在防止污染的前提下，套式ＰＣＲ可提高ＨＣＶＲＮＡ检出率（７．８３％）这对于极低水平ＨＣＶ感染的诊断十分重要，本文对受检标本的贮存方法也进行了初步探讨。     

槲皮素对人早幼粒白血病细胞体外核转录活性影响

分别用４，２０，１００μｍｏｌ／Ｌ槲皮素处理培养的ＨＬ－６０细胞２ｄ，或用２０μｍｏｌ／Ｌ槲皮素处理０－４ｄ。分离纯化细胞核进行体外核转录实验，测定总ＲＮＡ聚合酶活性和ＲＮＡ聚合酶Ⅱ活性。结果显示这项槲皮素处理ＨＬ－６０细胞后，体外核转录活性降低，总ＲＮＡ聚合酶活性尤其是ＲＮＡ聚合酶Ⅱ活性受抑制，并呈时间和剂量依赖关系。推测槲皮素抑制ＨＬ－６０细胞ＲＮＡ聚合酶活性，特别是抑制ＲＮＡ聚合酶Ⅱ活性，可     

反义RNA技术及其应用

反义ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ）是一类能与特异ｍＲＮＡ互补的小分子量、可扩散的ＤＮＡ转录物,它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达。由于反义ＲＮＡ能够选择性地关闭特定基因,因而它已成为一种极有价值的研究工具,是被科学家们广泛用来同病毒性疾病、恶性肿瘤、寄生虫感染和遗传性疾病等作斗争的最引人注目的新武器,也是科学家们用来调节基因表达和观察基因表达的有效手段和方法。随着天然反义ＲＮＡ的发现,人工构建反义ＲＮＡ来调节基因表达的策略应运而生,并已经取得了较大进展。本文拟…     

慢性肝病患者庚肝病毒RNA检测分析

应用逆转录酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）对９６例慢性肝病患者进行ＨＧＶ ＲＮＡ检测,结果：慢性肝炎９例,肝硬化５６例,肝癌３１例中ＨＧＶ ＲＮＡ阳性分别为１例,６例,３例,总检出率为１０．４２％（１０／９６）在ＨＢＶ感染６３例,ＨＣＶ感染,８例及ＨＢＶ＋ＨＣＶ重叠感染１１例中,ＨＧＶ ＲＮＡ阳性分别为８例,１例和１例,在慢性肝病中ＨＧＶ ＲＮＡ阳性与阴性组间,ＡＳＴ,ＡＬＴ水平无显著性差异（Ｐ〉０．     

具有野生起点的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶表达质粒的构建

目的 构建具有野生起点的丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶表达载体。方法 根据疏水性分析选定待表达的丙型肝炎病毒非结构基因５ｂ区大部分基因。以聚合酶链反应扩增泛素基因,逆转录－聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶基因。限制性酶切长度多态性分析重组克隆,并以ＤＮＡ序列分析方法最终确认。     

肝脏中肾综合征出血热病毒感染与c—myc基因的表达以及免…

观察比较人和动物肝脏感染肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒后病变的异同。方法以原位分子杂交和免疫组化检测ＨＦＲＳ尸检及自然感染大鼠肝脏中病毒ＲＮＡ，病毒抗原及免疫球蛋白（Ｉｇ）的定位和分布及尸检肝脏中ｃ－ｍｙｃ基因。结果：尸检肝脏中病毒ＲＮＡ，病毒抗原和Ｉｇ的阳性率分别为８４．２１％，８８．２３％和５３．５０％，大鼠肝脏阳性率分别为９２．９０％，９３．１０％和５４．５０％，尸检肝脏ｃ－ｍｙｃ基因阳性率     

HCC癌组织和癌旁组织中HCVRNA检测及半定量分析

ＨＣＶ相关ＨＣＣ癌组织能检出ＨＣＶＲＮＡ负链，但许多学者检测不到或对其检测方法的准确性产生怀疑。作者收集１３例ＨＣＶ相关ＨＣＣ标本，采用严格的负链检测方法和ＰＣＲ半定量方法系统地比较了ＨＣＣ癌组织和癌旁组织中ＨＣＶ总ＲＮＡ和负链的检出情况及其数量关系。ＨＣＣ癌组织和癌旁组织中，ＨＣＶＲＮＡ负链检出率分别为３０．８％（４／１３）和６９．２％（９／１３），平均滴度分别为３．５和２９．２，两者平均相差８．４倍（０－１００倍）。癌组织中ＨＣＶＲＮＡ负链只有癌旁组织中ＨＣＶ总ＲＮＡ的１／９１．６。本研究结果提示，ＨＣＣ癌组织中的确能检出ＨＣＶＲＮＡ负链，但水平较低。这种可能存在的低水平ＨＣＶ复制对ＨＣＣ的影响可能不大。因而，临床观察和流行病学研究所揭示的ＨＣＶ与ＨＣＣ相关的基础可能存在于ＨＣＣ发生过程的早期，即启动或早期克隆扩增阶段。     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

日本血吸虫表面膜抗原23KDa的克隆及其鉴定

根据已报道的２３ＫＤａ基因序列，设计了２个寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应技术，将提取的日本血吸虫成虫的总ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ进行扩增（ＲＴ－ＰＣＲ）。扩增的基因克隆到质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中，重组质粒转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１，在ＬＢ（Ａｍｐ＋）平板上挑阳性克隆经酶切分析，ＰＣＲ扩增及测序鉴定等含完整２３ＫＤａ基因的重组质粒     

正常人肝细胞中HBV—PHSA受体基因表达的研究

作者根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｄｒ型ＰｒｄＳ２基因序列设计合成一对聚合酶链反应（ＰＣＲ）引物，经特异性试验后，用于扩增正常人肝细胞中多聚人白蛋白受体（ＰＨＳＡｒ）基因转录产物。结果：ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＮＡ－ＰＣＲ扩增结果均为阳性，而相应骨骼肌总ＲＮＡ扩增结果呈阴性，提示乙型肝炎病毒ＰｒｅＳ２区与ＰＨＳＡｒ基因外显子序列具有一定程度的同源性；同时表明ＰＨＳＡｒ基因在肝组织中处于表达状态，而对ＨＢＶ不     

荧光定量PCR技术在检测HCV—RNA中的应用

目的 评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值,探讨ＰＢＭＣ中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的意义。方法 采用荧光定量ＫＲ及ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测８７例血液透析患者的血清和淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果血清、淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４９．４％、６９．０％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ阳性率（３３．３％、３５．６％）（Ｐ ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率,荧光定量ＰＣＲ法（３１．０％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（６．９％）（Ｐ＜０．００１）． 荧光定量ＰＣＲ法,淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ检出率高于血清（Ｐ＜０．０１）。结论 与 ＲＴ－ＰＣＲ相比,荧光定量ＰＣＲ技术检测 ＨＣＶ－ＲＮＡ敏感性较高,对ＰＢＭＣ内ＨＣＶ－ＲＮＡ检测有利于提高ＨＣＶ检测的阳性率。