依达拉奉保护H9c2心肌细胞对抗化学性低氧引起的损伤

目的探讨新型的自由基清除剂依达拉奉(EDA)能否保护H9c2心肌细胞对抗化学性低氧引起的损伤。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理H9c2心肌细胞以建立化学性低氧损伤模型。应用CCK-8比色法检测细胞存活率;Hoechst 33258核染色法检测凋亡细胞的形态学及数量变化;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照像测定细胞内活性氧(ROS)水平;JC-1染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP)。结果应用100～1000μmol/L CoCl2处理H9c2心肌细胞24 h,呈浓度依赖性地降低细胞存活率;在12～36 h范围内,800μmol/L CoCl2呈时间依赖性地抑制细胞存活率;10～40μmol/L EDA或500～2000μmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC,为ROS的清除剂)预处理H9c2心肌细胞1 h呈浓度依赖性地对抗CoCl2对细胞存活率的抑制作用;在800μmol/LCoCl2处理H9c2心肌细胞前1 h,应用40μmol/L EDA预处理细胞不仅可明显的抑制CoCl2诱导的细胞内ROS生成增多,还能抑制CoCl2的致细胞凋亡作用及MMP的损伤作用。结论 EDA能保护心肌细胞对抗CoCl2诱导的损伤作用,此心肌细胞保护作用可能与其抗氧化作用及保护MMP有关。     

氧化应激通过抑制胱硫醚-γ-裂解酶介导阿霉素的心肌毒性

目的探讨氧化应激是否通过抑制胱硫醚-γ-裂解酶的表达及活性介导阿霉素的心肌毒性。方法应用阿霉素处理大鼠胚胎H9c2心肌细胞以建立阿霉素心肌毒性的细胞模型。在阿霉素处理前60 min用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸预处理H9c2心肌细胞以观察氧化应激在阿霉素心肌细胞损伤中的作用。应用CCK-8检测心肌细胞存活率;双氯荧光素酶染色及荧光显微镜照相术检测细胞内活性氧水平;Western blot检测胱硫醚-γ-裂解酶的表达;亚甲基蓝显色法检测胱硫醚-γ-裂解酶活性。结果 5μmol/L阿霉素处理H9c2细胞24 h引起明显的心肌毒性,使细胞存活率降低。阿霉素在促进细胞内活性氧生成的同时,还抑制胱硫醚-γ-裂解酶的表达及活性。N-乙酰半胱氨酸不仅抑制阿霉素对活性氧生成的促进作用,还减弱阿霉素的心肌毒性,并能阻断阿霉素对H9c2心肌细胞胱硫醚-γ-裂解酶表达及活性的抑制作用。结论活性氧可通过抑制心肌细胞胱硫醚-γ-裂解酶的表达及活性介导阿霉素的心肌毒性。     

热休克蛋白90在硫化氢对抗化学性缺氧引起的心肌细胞损伤中的作用

目的 探讨热休克蛋白90在硫化氢保护H9C2心肌细胞对抗氯化钴诱导的损伤中的作用.方法应用不同浓度的氯化钴处理H9C2心肌细胞,建立化学性缺氧诱导心肌细胞损伤的实验模型.硫氢化钠(硫化氢的供体)在氯化钴处理H9C2心肌细胞前30 min加入培养基中,作为预处理.应用细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;Hoechst 33258染色荧光显微镜照相术检测凋亡心肌细胞的形态学改变;免疫印迹法检测热休克蛋白90的表达.结果 在600～1000 μmol/L浓度范围内,氯化钴处理H9C2心肌细胞24 h,呈剂量依赖性地抑制细胞存活率.在应用不同浓度氯化钴处理H9C2心肌细胞前30 min,应用400 μmol/L硫氢化钠可分别显著地抑制600、800、1000μmol/L氯化钴对心肌细胞的损伤作用,使细胞存活率明显升高.400 μmol/L硫氢化钠可促进H9C2心肌细胞的HSP90表达,在硫氢化钠作用6～9 h时,HSP90表达最多,作用18 h时表达恢复到基础水平.2 μmol/L热休克蛋白90抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素自身对H9C2心肌细胞无损伤作用,但是能加重氯化钴对心肌细胞的损伤作用,并能明显地阻断硫化氢抑制氯化钴对心肌细胞的损伤作用,使H9C2心肌细胞存活率降低,凋亡细胞数量增多.结论 硫化氢能保护心肌细胞对抗氯化钴诱导的损伤作用,并能上调热休克蛋白90表述.热休克蛋白90介导硫化氢的心肌细胞保护作用.     

硫化氢通过调控JNK通路对抗高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤

目的 研究JNK通路在高糖诱导的心肌细胞损伤中的作用及硫化氢是否通过调控JNK通路保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤.方法 应用高浓度葡萄糖处理H9c2心肌细胞以建立高糖损伤的细胞模型.应用CCK-8比色法测定细胞存活率,DCFH-DA染色荧光显微镜照相测定细胞内活性氧水平,Rh123染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位,Western blot测定JNK蛋白的表达.结果 高浓度葡萄糖对H9c2心肌细胞具有明显的损伤作用,表现为细胞存活率降低,活性氧生成增多和线粒体膜电位丢失,并能促进心肌细胞内磷酸化JNK的表达;N-乙酰-半胱氨酸和JNK抑制剂SP600125预处理30 min均能阻断高浓度葡萄糖引起的细胞毒性;400 μmol/L NaHS预处理30 min,不仅能抑制高糖引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高、活性氧生成减少以及线粒体膜电位丢失减少,还能抑制高糖对心肌细胞磷酸化JNK表达的上调作用.结论 活性氧和JNK通路介导高糖引起的H9c2心肌细胞损伤;硫化氢可通过抑制氧化应激和JNK通路保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤.     

血清-葡萄糖剥夺抑制热休克蛋白90致心肌细胞损伤

目的 探讨热休克蛋白90(HSP90)表达下调是否参与血清-葡萄糖剥夺(SGD)引起的心肌细胞损伤.方法 用血清-葡萄糖剥夺处理H9c2心肌细胞,建立缺血性心肌细胞损伤的体外模型;在血清-葡萄糖剥夺处理前,应用HSP90选择性抑制剂17-AAG预处理心肌细胞60 min;CCK-8比色法检测细胞存活率;Fluo-3AM染色结合荧光显微镜照相术检测细胞内游离钙水平;Western blot检测HSP90和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达.结果 血清-葡萄糖剥夺处理24h可明显抑制H9c2心肌细胞内HSP90的表达,诱导细胞内钙超载及上调内质网应激蛋白GRP78的表达.选择性HSP90抑制剂17-AAG预处理不仅可以加重血清-葡萄糖剥夺引起的心肌细胞存活率降低,而且进一步加重血清-葡萄糖剥夺引起的H9c2心肌细胞内钙超载及内质网应激蛋白GRP78的表达上调.结论 抑制HSP90可能是血清-葡萄糖剥夺损伤心肌细胞的重要机制之一.     

活性氧与ATP敏感性钾通道的相互作用参与高糖对

目的　研究活性氧（ROS）和ATP敏感性钾通道（K_ATP通道）的相互作用在高糖（HG）引起的心肌细胞损伤中的作用。方法　应用Western　blot检测心肌细胞K_ATP通道蛋白、Cleaved　Caspase-3的表达水平;双氯荧光素染色荧光显微镜照相检测胞内ROS水平;细胞计数盒测定心肌细胞存活率;Hoechst　33258核染色荧光显微镜照相测定凋亡细胞数量的变化;JC-1染色法测定线粒体膜电位。结果　应用高糖（35　mmol/L葡萄糖）处理H9c2心肌细胞24　h能明显下调K_ATP通道蛋白的表达水平,1000　μmol/L　N-乙酰半胱氨酸（ROS清除剂）预处理心肌细胞60　min可阻断HG对心肌细胞K_ATP通道蛋白表达的下调作用。100　μmol/L二氮嗪（线粒体K_ATP通道开放剂）和50　μmol/L吡拉地尔（非选择性K_ATP通道开放剂）预处理均显著抑制HG引起的心肌细胞ROS的堆积。1000　μmol/L　N-乙酰半胱氨酸、100　μmol/L二氮嗪和50　μmol/L吡拉地尔均能抑制HG引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量、Cleaved　Caspase-3表达及线粒体膜电位丢失减少。结论　在HG状态下,心肌细胞的ROS和K_ATP通道存在相互作用,两者在HG引起的心肌细胞损伤中发挥重要作用。     

活性氧不参与二氯化钴诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖

目的 探讨活性氧是否参与二氯化钴诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)过度增殖.方法 用化学性缺氧模拟剂二氯化钴处理HPASMC,建立缺氧性肺动脉高压血管重塑的细胞模型 用外源性活性氧供体过氧化氢处理HPASMC,观察活性氧对细胞增殖的影响;活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理HPASMC,观察其对二氯化钴或过氧化氢诱导的细胞增殖的改善作用;应用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖,Western blot检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的表达,双氯荧光素染色和荧光照相术检测细胞内活性氧的含量.结果 在25 ～ 50μmol/L浓度范围内,二氯化钴处理24 h可诱导HPASMC增殖,50 μmol/L二氯化钴处理24 h可使细胞内HIF-1α的水平明显增加;与二氯化钴的作用类似,过氧化氢在12 ～ 25μmol/L浓度范围内处理24 h也可引起细胞增殖,但不改变HIF-1α的水平;在二氯化钴或过氧化氢处理前,用不同浓度的NAC预处理,在1 500 μmol/L浓度时,NAC预处理可明显抑制过氧化氢诱导的HPASMC过度增殖(P＜0.05),而对二氯化钴诱导的细胞增殖则无明显影响(P＞0.05);另外,50 μmol/L二氯化钴处理6～24 h对细胞内活性氧的含量无明显影响(P＞0.05).结论 化学性缺氧可诱导HPASMC过度增殖,其机制可能不依赖于活性氧.     

硫化氢通过抑制ROS-TLR4通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应

目的探讨外源性硫化氢(H2S)能否通过抑制活性氧(ROS)-Toll样受体4(TLR4)通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率,用试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,ELISA检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞数量,Western blot测定TLR4和Cleaved Caspase 3蛋白的表达水平,双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内ROS水平,罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(MMP)。结果应用35 mmol/L葡萄糖(高糖)作用H9c2心肌细胞24 h能上调TLR4的表达水平。在高糖作用前,应用1000μmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理60 min或400μmol/L硫氢化钠(Na HS)预处理30 min能明显减轻高糖对TLR4蛋白表达的上调作用。高糖作用心肌细胞24 h可引起心肌细胞损伤和炎症反应,使细胞存活率降低,LDH活性、凋亡细胞数量、Cleaved Caspase 3蛋白的表达、ROS生成、MMP丢失及IL-1β和TNF-α的分泌增加;400μmol/L Na HS预处理心肌细胞30 min后再予高糖作用24 h或30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和高糖共处理心肌细胞24 h能显著拮抗高糖引起的上述损伤和炎症反应。结论外源性H2S可通过抑制ROS-TLR4通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应。     

坏死性凋亡与活性氧的相互作用介导高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

目的探讨坏死性凋亡(Nec)与活性氧(ROS)之间的相互作用能否介导高糖引起的H9c2心肌细胞损伤。方法应用蛋白质免疫印迹试验(Western blot)检测心肌细胞RIP3蛋白的表达水平;细胞计数盒测定心肌细胞存活率;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜摄片测定线粒体膜电位(MMP);2’,7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色荧光显微镜摄片检测心肌细胞内ROS水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜摄片测定凋亡细胞的数量。结果应用高糖(HG,35 mmol/L葡萄糖)分别处理H9c2细胞0~24 h,其中3、6、9、12和24 h均能明显地上调RIP3蛋白的表达水平,24 h时RIP3蛋白表达上调最为明显。应用100μmol/L Nec的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1)共处理心肌细胞可对抗高糖引起的RIP3蛋白表达的上调作用。此外,100μmol/L Nec-1能显著地抑制高糖引起的细胞毒性、线粒体损伤及氧化应激,使细胞存活率升高,MMP丢失及ROS生成减少。1 000μmol/L ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理心肌细胞60 min,可明显地抑制高糖对心肌细胞RIP3蛋白表达的上调作用;此外,高糖诱导的细胞凋亡和细胞毒性作用,经NAC预处理后均能得到显著的抑制。结论 Nec与ROS之间的相互作用介导高糖对心肌细胞的损伤。     

瘦素-p38MAPK通路介导高糖对H9c2心肌细胞的损伤

目的 探讨瘦素-p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路在高糖损伤H9c2心肌细胞中的作用。方法 应用35 mmol/L葡萄糖处理H9c2心肌细胞以建立高糖损伤细胞模型。应用细胞计数试剂盒检测细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相测定胞内活性氧水平;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞形态与数量的改变;罗丹明123染色荧光显微镜照相测定线粒体膜电位;Western blot检测瘦素和p38MAPK蛋白的表达水平。结果 35 mmol/L葡萄糖处理H9c2心肌细胞明显促进瘦素的表达。在高糖处理H9c2心肌细胞前,应用50 μg/L瘦素拮抗剂预处理24 h明显抑制高糖对磷酸化p38MAPK表达的上调作用。瘦素拮抗剂预处理24 h或p38MAPK抑制剂（SB203580）预处理60 min均能抑制高糖对H9c2心肌细胞的损伤作用,使细胞存活率升高,凋亡细胞数量减少,活性氧生成及线粒体膜电位丢失减小。结论 瘦素-p38MAPK通路参与高糖对心肌细胞的损伤。     

Chelerythrine rapidly induces apoptosis through generation of reactive oxygen species in cardiac myocytes

The role of protein kinase C (PKC) inhibition in cardiac myocyte apoptosis has not been well understood. We investigated the mechanism, by which chelerythrine, a commonly used PKC inhibitor, induces potent myocyte death. Chelerythrine (6-30 microm) rapidly induced pyknosis, shrinkage and subsequent cell death in cardiac myocytes. Chelerythrine-induced myocyte death was accompanied by nuclear fragmentation and activation of caspase-3 and -9, while it was prevented by XIAP, suggesting that the cell death is due to apoptosis. Higher concentrations of chelerythrine caused necrotic cell death where neither cell shrinkage nor caspase activation was observed. Intravenous injection of chelerythrine (5 mg/kg) also increased apoptosis in adult rat hearts in vivo. Downregulation of the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-sensitive PKC failed to affect chelerythrine-induced apoptosis, while anti-oxidants, including N-acetyl-L-cysteine (NAC) and glutathione, inhibited it, suggesting that generation of reactive oxygen species (ROS) rather than inhibition of PMA-sensitive PKC mediates chelerythrine-induced cardiac myocyte apoptosis. Chelerythrine caused cytochrome c release from mitochondria, which was significantly inhibited in the presence of NAC, suggesting that ROS mediates chelerythrine-induced cytochrome c release. Partial inhibition of cytochrome c release by Bcl-X(L) significantly reduced chelerythrine-induced apoptosis. These results suggest that chelerythrine rapidly induces cardiac myocyte apoptosis and that production of ROS, possibly H(2)O(2), and subsequent cytochrome c release from mitochondria play an important role in mediating chelerythrine-induced rapid cardiac myocyte apoptosis.     

N-乙酰半胱氨酸通过抑制活性氧-p38通路减轻缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡

目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)抑制缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的机制.方法 心肌细胞培养48 h后随机分为对照组、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧+NAC组(100 p.mol/L)(H/R+NAC组).H/R组心肌细胞先缺氧6 h,随后复氧72 h,H/R+NAC组在H/R组细胞培养液中加NAC(100 μmol/L).采用锥虫蓝检测心肌细胞活性.流式细胞仪与Annexin V测定细胞早期凋亡.TUNEL检测细胞晚期凋亡.活性氧绿色荧光显色试剂检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度.RT-PCR检测bcl2、bax基因mRNA水平.Western blot检测bel2、bax、p38与pp38基因蛋白水平.结果 H/R组有活性的细胞数量为74.9%,显著低于对照组(93.5%,P<0.01),H/R+NAC组有活性的细胞数为89.9%,显著高于H/R组(P<0.01).H/R组早期凋亡的心肌细胞数为25.2%,显著高于对照组(6.5%,P<0.01),H/R+NAC组早期凋亡的细胞数为11.1%,显著低于H/R组(P<0.01).H/R组晚期凋亡的心肌细胞数为33.5%,显著高于对照组(3.5%,P<0.01),H/R+NAC组晚期凋亡的细胞数为13.5%,显著低于H/R组(P<0.01).H/R组心肌细胞ROS产生显著高于对照组,H/R+NAC组心肌细胞ROS产生显著低于H/R组.H/R组pp38/p38条带密度比值(13.40)也显著高于对照组(3.89).H/R+NAC组pp38/p38条带密度比值(1.95)显著低于H/R组(13.4),P<0.01.H/R组bcl2 mRNA与蛋白水平显著低于对照组,bax mRNA与蛋白水平显著高于对照组.H/R+NAC组bcl2 mRNA与蛋白水平显著高于H/R组.H/R+NAC组bcl2/bax mRNA水平比值(1.79)显著高于H/R组(1.22),P<0.05,但仍低于对照组(1.85).H/R+NAC组bcl2/bax条带密度比值(0.71)显著高于H/R组(0.50),P<0.05,但仍低于对照组(2.53).结论 NAC通过抑制ROS-p38通路减轻缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,这一作用具有潜在的临床应用价值.     

丙泊酚对过氧化氢诱导的H9c2细胞损伤的保护作用

目的观察丙泊酚对过氧化氢诱导的H9c2细胞损伤的保护作用。方法本实验通过使用过氧化氢（H2O2）在体外诱导H9c2细胞氧化应激反应,给予不同浓度的丙泊酚（5,10,20,50μM）作用后,分别测定细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）释放,细胞内活性氧（ROS）释放,超氧化物歧化酶（SOD）活性,过氧化氢酶（CAT）活性及蛋白表达量。结果处理丙泊酚（10,20μM）能够抑制由H2O2诱导的细胞死亡,提高细胞存活率（P〈0.01）;抑制LDH释放（P〈0.01）和细胞内ROS释放（P〈0.01）;提高SOD活性,提高CAT活性和蛋白表达量（P〈0.01）。结论丙泊酚可能是通过提高内源性抗氧化酶的活性及蛋白表达量,抑制氧化应激反应,从而产生心脏保护作用。     

Effect of inhaled N-acetylcysteine on hydrogen peroxide exhalation in healthy subjects

N-acetylcysteine (NAC) has antioxidant properties and its oral administration decreased H(2)O(2) exhalation in patients with chronic obstructive pulmonary disease. In this study we tested whether inhaled NAC could suppress H(2)O(2) levels in exhaled breath condensate (EBC) of eight healthy subjects that have never smoked (never-smokers). Original NAC solution (ACC vial, 300 mg NAC in 3 ml solvent), NAC-placebo (vehicle), sterile 0.9% NaCl or distilled water were nebulized via the pneumatic De Vilbiss nebulizer once daily every 7 days and H(2)O(2) and thiols exhalation was measured just before, 30 min and 3 h after the end of drug administration. Additional in vitro experiments were performed to evaluate NAC stability during nebulization, reactivity with H(2)O(2) and possible H(2)O(2) generation in aqueous NAC solutions. NAC almost completely abolished H(2)O(2) exhalation 30 min after inhalation (0.02+/-0.04 vs. 0.21+/-0.09 microM, p<0.001). However, 3 h later the H(2)O(2) levels raised 1.8-fold from baseline (p<0.01). Other inhaled solutions did not affect H(2)O(2) levels. Mean thiol concentration in EBC rose (p<0.05) after treatment with NAC and reached 1.03+/-0.48 microM at 3 h. Although, 25 and 50 mM NAC completely inhibited H(2)O(2)-peroxidase-luminol-dependent chemiluminescence, detectable amounts of H(2)O(2) were generated in NAC solutions. It was accompanied by moderate loss of -SH groups. Catalase and ascorbic acid prevented H(2)O(2) formation in NAC solutions. In conclusion inhaled NAC revealed biphasic effect on H(2)O(2) exhalation in healthy subjects, which depends on direct H(2)O(2) scavenging and H(2)O(2) generation related to drug oxidation. The net result of these processes may determine anti- or pro-oxidant action of inhaled NAC.     

Evaluation of the effects of oral N-acetylcysteine and a placebo in paraclinical and oxidative stress parameters of patients with chronic hepatitis B

Background and Aims

The treatment of chronic hepatitis B (CHB) is a challenging problem today, and previous study has shown that oxidative stress causes the collective pathophysiological conditions of many hepatopathies, so other new therapeutic approaches are needed. Hence, in this study the paraclinical and oxidative stress parameters of the efficacy of N-acetyl cysteine (NAC) as an antioxidant in the treatment of CHB have been evaluated.

Methods

In this double-blind placebo-controlled clinical trial study, 43 patients with CHB were enrolled in 2008 in Tehran, Iran. The patients were randomly assigned to receive either 1200 mg/day NAC or a placebo for 45 days. Paraclinical tests and oxidative stress parameters were measured on experimental day 0 and on day 45.

Results

Liver function tests, i.e. alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) levels were not significantly different in the NAC group and in the placebo group. A reduction in catalase (CAT) activity and an increase in glutathione concentration were statistically significant in the NAC group (P < 0.05).

Conclusions

According to our results, oral NAC is not an effective adjuvant treatment for patients with CHB, but further research with a larger population is needed for the evaluation of the effectiveness of NAC in these patients.     

miR-200c-3p靶向XIAP调控缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨miR-200c-3p对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响及作用机制。方法构建缺氧复氧(H/R)H9c2细胞。运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-200c-3p、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)信使核糖核酸(mRNA)的表达。将H9c2细胞分为H/R+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p组(转染anti-miR-200c-3p)、H/R+pcDNA组(转染pcDNA)、H/R+pcDNA-XIAP组(转染pcDNA-XIAP)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-NC组(共转染anti-miR-200c-3p和si-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-XIAP组(共转染anti-miR-200c-3p和si-XIAP),用脂质体法转染至H9c2细胞,再进行缺氧复氧处理。免疫印迹(Western blot)、噻唑蓝(MTT)、流式细胞术检测细胞中XIAP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病2 X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)的表达、细胞增殖、细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-200c-3p与XIAP的结合力。结果成功构建缺氧复氧H9c2细胞;与正常培养的H9c2细胞比较,H/R组H9c2细胞中miR-200c-3p表达明显上调,XIAP表达明显下调;抑制miR-200c-3p、过表达XIAP均可抑制H/R H9c2细胞的凋亡,下调cleaved Caspase-3、Bax,上调Bcl-2;miR-200c-3p可显著抑制XIAP 3′UTR野生型报告基因活性,并负向调控XIAP的表达;敲减XIAP可逆转抑制miR-200c-3p对H/R H9c2细胞的凋亡抑制作用。结论 miR-200c-3p可诱导缺氧复氧心肌细胞的凋亡,其机制与靶向XIAP有关,可为心血管疾病的治疗提供新靶点。     

体外转染Klotho基因对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注的影响

目的研究转染Klotho基因对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注的影响。方法培养H9c2(2-1)大鼠心肌细胞,建立模拟缺血再灌注模型,Fermentas转染试剂介导小鼠Klotho基因转染H9c2(2-1)大鼠心肌细胞。实验分4组:对照组(Control组)、缺血再灌注组(I-R组)、转染Klotho基因组(Klotho组)、转染Fermentas转染试剂空载体组(Vehicle control组)。各组进行缺血再灌注后RT-PCR及免疫荧光法检测Klotho mRNA及Klotho蛋白表达,MTT法检测细胞活性,测定上清液乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及Klotho含量。结果 Klotho组较I-R组和Vehicle control组Klotho mRNA、Klotho蛋白表达明显增加,LDH、MDA明显降低,细胞活性高(P<0.01)。结论 Fermentas转染试剂介导的Klotho基因转染H9c2(2-1)大鼠心肌细胞可保护H9c2(2-1)大鼠心肌细胞、减轻H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤。     

下调CopineⅠ抑制缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡

目的 研究Copine Ⅰ（CPNE1）对缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）诱导H9c2细胞凋亡的作用及可能的机制。 方法 以H9c2心肌细胞为研究对象,建立H/R模型,细胞被随机分为对照组（CON）、H/R组、阴性对照（NC）+H/R和CPNE1 siRNA+H/R组,阻断实验用NF-κB的阻断剂PDTC（10 μmol/L）预处理细胞30 min。RT-PCR和Western blot方法用于检测CPNE1表达水平。细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性采用ELISA方法检测。细胞经Annexin-V/PI染色后用流式细胞仪检测凋亡率,Western blot方法检测claved-caspase3（c-caspase3）、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。细胞中NF-κB活性采用ELISA方法检测。 结果 与CON组相比,H/R组CPNE1表达水平上调、LDH活性升高、凋亡率上升、c-caspase3和Bax蛋白表达升高、Bcl-2蛋白表达水平下降。与NC+H/R组相比,CPNE1 siRNA+H/R组细胞的LDH活性下降、凋亡率降低、c-caspase3和Bax蛋白表达减少、Bcl-2表达增多。此外,沉默CPNE1细胞核中NF-κB活性增强且蛋白表达上升,PDTC可逆转CPNE1 siRNA对细胞凋亡的抑制作用。 结论 下调CPNE1的表达能够抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡,其可能机制是通过增强NF-κB活性发挥心肌保护作用。