靶向表皮生长因子受体的RNA干扰技术对非小细胞肺癌细胞株A549细胞抑制及顺铂敏感性的研究

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术,将携带表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)同源基因的重组质粒稳定转染非小细胞肺癌细胞株A549细胞,观察其对A549细胞生长抑制作用及对顺铂敏感性的变化.方法 根据RNAi原理,体外设计并合成靶向EGFR特异性干扰片段,即h-EGFR,以pGensil-1为载体,构建重组质粒pGensil-1-EGFR,以Lipofectamine 2000介导转染肺腺癌细胞株A549细胞,经G418筛选后挑选出稳定转染的单克隆细胞.将所挑选出的单克隆细胞大量培养后加入不同浓度顺铂(40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L),采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞活力,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡的变化,观察RNAi对A549细胞抑制作用及是否与顺铂有协同作用.结果 与对照组、阴性对照组相比,从第2天起实验组生长缓慢,吸光度有统计学差异(P＜0.05);顺铂或联合dsRNA-EGFR对A549细胞有抑制作用,且随着浓度的增加和时间的延长抑制作用增强,dsRNA-EGFR联合顺铂与等浓度顺铂吸光度有统计学差异(P＜0.05),顺铂作用24 h后40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂抑制率分别提高了7.8%、30.70%、34.42%.实验组G0/G1细胞百分比较对照组增加了13.84%,较阴性对照组增加了14.65%,进入S期的细胞百分比较对照组减少了19.10%,较阴性对照组减少了18.68%;40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂处理细胞24 h后,与对照组相比,凋亡率明显增高(P＜0.05),且浓度越高,凋亡率越高;同一浓度顺铂作用下转染pGensil-1-EGFR的A549细胞凋亡率较A549细胞增高(P＜0.05).结论 dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞生长,使细胞阻滞在G0-G1期,顺铂可有效诱导细胞凋亡,RNAi与顺铂具有协同效应,提高细胞对顺铂的敏感性,RNAi技术为非小细胞肺癌基因治疗提供了新策略.     

益肺解毒方联合顺铂对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的探讨益肺解毒方联合顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法 (1)应用血清药理学方法制备益肺解毒方药物血清。60只SD大鼠,分为低、中、高剂量组及空白血清组,每组15只。给予低、中、高剂量益肺解毒方煎剂及等体积生理盐水灌胃3 d,然后腹主动脉取血,制备益肺解毒方药物血清。(2)应用噻唑蓝(MTT)法检测益肺解毒方含药血清、顺铂及将两者协同后对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用。益肺解毒方药物血清组分为3个剂量组(低、中、高剂量组)、空白血清组、顺铂组;联合组(低、中、高剂量益肺解毒方与空白血清联合顺铂)。将顺铂设为5个浓度梯度(1、2、4、8、16 mg/L)。另设空白对照组、空白调零组。每组设6个复孔,实验重复3次。计算各组对人肺腺癌A549细胞增殖抑制率。结果低、中、高剂量益肺解毒方药物血清对人肺腺癌A549细胞增殖均具有抑制作用(P<0.05),且剂量与抑制率呈一定量效关系。顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖亦具有抑制作用,且随着浓度的增高,抑制率逐渐增高,作用呈现浓度依赖效应。中、高剂量益肺解毒方药物血清与顺铂协同,协同指数>1.15,数据结果提示益肺解毒方可以协同顺铂增加其疗效。而应用低剂量益肺解毒方则与顺铂协同效应为单纯相加。结论益肺解毒方联合顺铂对肺腺癌A549细胞具有协同增效作用。     

人参皂苷增加顺铂抗肺癌A549细胞活性的机理研究

目的观察人参皂苷与顺铂联合作用肺癌A549细胞的细胞毒作用,探索相关作用机制。方法 MTT实验检测人参皂苷、顺铂对人肺癌A549细胞的细胞毒作用;提取药物处理细胞总蛋白,Western blot检测细胞survivin蛋白的表达变化;Annexin V/PI双染、流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。结果人参皂苷和顺铂对肺癌A549细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别为(43.26±3.27)和(2.34±0.15)μmol/L;20、40μmol/L人参皂苷与顺铂联合作用A549细胞,顺铂对A549细胞的IC50值减少为(1.42±0.33)、(0.61±0.04)μmol/L,P<0.01。Western blot检测显示人参皂苷剂量依赖性的降低肺癌A549细胞survivin蛋白的表达。流式细胞仪凋亡检测显示人参皂苷使顺铂诱导的细胞凋亡增加(P<0.01)。结论人参皂苷可以显著增加顺铂对肺癌A549细胞的致凋亡作用,下调survivin蛋白表达可能是其增敏的主要机制。     

蛋白酶体抑制剂MG132联合顺铂诱导肺癌A549细胞凋亡的机制

目的探讨蛋白酶体抑制剂(MG132)与顺铂(DDP)联合诱导肺癌A549细胞凋亡的机制及作用。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度MG132、DDP对肺癌A549细胞的最适作用时间以及抑制率;通过Hochest33342染色法检测细胞形态变化;应用流式细胞术(FCW)检测MG132、DDP及两药联合作用于肺癌A549细胞的凋亡率;采用Western印迹检测药物干预前后细胞中促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase)9、核转录因子(NF-κB)的表达情况。结果 MTT结果显示MG132、DDP能有效抑制细胞的增殖,呈浓度及时间依赖性;FCW结果显示MG132与DDP联合用药组作用于肺癌A549细胞凋亡率为(68.27±0.31)%,与MG132(22.13±0.36)%、DDP(25.76±0.25)%单用药组相比,细胞凋亡率明显提高(P<0.05)。Western印迹结果显示,与单用药组相比较,联合用药组凋亡相关蛋白caspase9表达明显增强,NF-κB表达显著减少。结论 MG132与DDP联合应用可明显提高细胞凋亡率,其机制可能是通过提高促凋亡蛋白caspase9的表达,并降低细胞NF-κB的表达而实现的。     

RNAi技术对人肺腺癌细胞A549内源Survivin基因表达的影响

目的 为Survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法的临床应用提供依据.方法 应用RNA干扰技术(RNAi)将靶向Survivin的基因片段插入载体后构建重组质粒,将其导入A549细胞,MIT法检测转染前后A549细胞增殖情况, RT-PCR及Western blot法分析转染前后Survivin mRNA和蛋白表达情况.结果 成功构建重组质粒pGenesil1.1-Survivin.转染重组质粒后Survivin mRNA和蛋白的表达明显降低,抑制率分别为65%和71%,细胞增殖受抑.结论 RNAi技术构建的重组质粒可明显抑制A549细胞内源Survivin的表达和mRNA转录,其在肿瘤基因沉寂疗法中可能起重要作用.     

低氧对顺铂损伤A549细胞的影响

目的 探讨低氧条件对顺铂损伤人非小细胞肺癌A549细胞的影响.方法 实验分为两大组:常氧组(正常对照组、顺铂10 μmol/L组、顺铂20μmol/L组);1％低氧组(正常对照组、顺铂10 μmol/L组、顺铂20μmol/L组).应用MTT法检测顺铂在常氧和低氧条件下对A549细胞增殖率的影响;MDC染色检测细胞自噬空泡的变化;Hoechst33342染色检测细胞核变化.结果 与对照组相比,顺铂能降低A549细胞增殖率,并呈剂量依赖性,细胞自噬空泡无明显积聚,但细胞核发生显著皱缩;低氧条件下细胞内出现大量自噬空泡积聚,且低氧明显降低了顺铂对A549细胞增殖率的影响,降低了顺铂对细胞的损伤作用.结论 顺铂能够诱导A549细胞损伤,而低氧条件引起了细胞自噬过程,并降低了顺铂的损伤作用.推测低氧时的细胞自噬在顺铂损伤A549细胞过程中可能是一种保护作用.     

自噬相关基因Beclin 1沉默对人肺癌A549细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨应用RNAi技术沉默Beclin 1基因对人肺癌A549细胞顺铂(DDP)耐药性的影响。方法应用真核细胞转染技术将Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒转入人肺癌DDP耐药A549/DDP细胞,通过RT-PCR和Western印迹检测Beclin-1基因表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞对DDP的耐药性及细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与空白对照组及空质粒对照组相比,重组质粒组Beclin 1mRNA及蛋白表达下降,凋亡率增加,对DDP的敏感性增加(均P<0.05)。结论 Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1转染人肺癌A549细胞后,可有效抑制Beclin-1基因的表达,增加人肺癌A549细胞对DDP的敏感性,促进细胞凋亡。     

补中益气汤干预肺腺癌A549细胞移植瘤Wnt/β-catenin信号通路对顺铂敏感性的影响

目的 探讨补中益气汤干预肺腺癌A549细胞移植瘤Wnt/β-catenin信号通路对顺铂敏感性的影响。方法 体外培养A549细胞,接种于BALB/cnu裸鼠腋窝皮下,8 d成瘤,隔天开始分别给予低剂量(1.46 g/kg)、中剂量(2.91 g/kg)、高剂量(5.82 g/kg)补中益气汤治疗25 d。30只裸鼠随机分为5组：对照组、顺铂组、顺铂+低剂量补中益气汤组、顺铂+中剂量补中益气汤组、顺铂+高剂量补中益气汤组。测量移植瘤质量并计算药物抑瘤率;Western印迹检测细胞质中p-糖原合成激酶(GSK)-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹法检测移植瘤组织β-catenin、Survivin蛋白的表达。结果 给药25 d后,顺铂联合不同剂量补中益气汤使移植瘤质量均显著缩小(P<0.05),抑瘤率均显著增加(P<0.05),且呈剂量依赖性。与对照组相比,顺铂联合不同剂量补中益气汤组可显著下调移植瘤细胞质p-GSK-3βser9蛋白的表达(P<0.05),并显著下调β-catenin、Sur...     

RNA介导Survivin基因沉默对胰腺癌细胞Panc-1细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对胰腺癌细胞株Panc-1增殖和凋亡的影响，探讨survivin基因在胰腺癌的发生、发展中作用：方法设计2对survivin-shRNA，体外转录制备shRNA。利用脂质体转染技术将survivin-shRNA转染胰腺癌细胞株（Panc-1），RT-PCR检测survivin-mRNA水平；MTT法检测细胞生长情况并绘制细胞生长曲线；细胞形态学观察及流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染2对survivin-shRNA可分别使Panc-1细胞survivin-mRNA水平下降54．86％，52．19％；MTT法检测结果显示：转染两对survivin-shRNA24、48、72小时对细胞增殖无明显影响（P〉0．05）；细胞形态学观察及流式细胞仪分析结果显示：转染两对survivin-shRNA 24、48、72小时对细胞凋亡无明显影响（P〉0．05）。结论应用RNAi技术，将survivin-shRNA转染胰腺癌细胞（Panc-1），能成功介导survivin基因沉默，达到部分靶向封闭survivin的目的：部分靶向封闭survivin对胰腺癌细胞株Panc-1凋亡及增殖无明显影响。提示：survivin在胰腺癌细胞增殖与凋亡调控中所起的作用可能并非关键性的。因而以survivin为靶基因的基因治疗对胰腺癌可能无效。     

GRP78的表达非小细胞性肺癌细胞A549对顺铂的敏感性

目的探讨下调GRP78的表达后是否增强非小细胞性肺癌细胞对顺铂的敏感性。方法通过蛋白印记的方法检测内质网应激后GRP78的表达变化;用流式细胞仪检测用siRNAGRP 78抑制GRP 78的表达上调后凋亡细胞的数目;用A549肿瘤细胞对裸鼠进行了皮下荷瘤,在体内检验GRP78的表达水平对顺铂耐药的影响;运用免疫组织化学的方法检测肺癌患者的肿瘤组织中GRP78的表达水平。结果内质网应激能上调GRP78的表达;抑制内质网应激诱导的GRP78的表达上调后,细胞对顺铂的敏感性增加;将GRP78基因表达干扰后,荷瘤组织的生长明显受到顺铂的抑制;20例肺癌患者的肿瘤组织与癌旁组织相比,存在GRP78的高表达。结论 GRP78的表达水平上调降低非小细胞性肺癌细胞对顺铂的敏感性,具体的参与调控的信号通路需要进一步的机制研究。     

RNA干扰在基因表达调控研究中的应用

在功能基因组学研究中，阐明各种蛋白的结构和生物学功能是其核心任务，这不仅是生物学的主要研究方向，而且也是医学研究的主要内容，毕竟细胞的功能和表型是由细胞中的蛋白来主导的，许多疾病都是蛋白结构与功能、表达水平与调节的异常引起的。研究蛋白的功能，常常通过改变蛋白的表达水平，观察细胞的生物学特性的变化来实现。这种研究策略包括强制性地升高特定蛋白的表达水平，也包括蛋白表达水平的缺失。研究表明，在功能基因组研究中，功能缺失策略具有特殊重要地位。     

RNA干扰Ref-1表达对肝癌顺铂敏感性的影响

目的建立表达氧化还原因子-1（Ref-1）小分子干扰RNA的重组逆转录病毒载体pmscv/siRef-1,观察人肝癌细胞株HepG2下调内源性Ref-1后对顺铂的敏感性变化。方法采用基因重组技术构建逆转录病毒载体pmscv/siRef-1。包装逆转录病毒,感染HepG2。RT-PCR及Western blot法检测感染后细胞内Ref-1 mRNA和蛋白表达,MTT法检测HepG2细胞下调Ref-1表达后对顺铂的敏感性变化。结果pmscv/siRef-1能有效被包装并感染靶细胞,感染pmscv/siRef-1病毒的HepG2细胞Ref-1蛋白与mRNA表达量明显降低,细胞对顺铂敏感性显著增加（P〈0.05）。结论成功构建以逆转录病毒为基础的抑制内源性Ref-1表达的RNA干扰载体;RNA干扰Ref-1基因可显著提高HepG2细胞对顺铂的敏感性。     

RNA干扰Survivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展

Survivin(生存素)作为IAP家族成员之一,被认为是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子.以siRNA干扰Survivin的表达靶向观察其对大肠癌细胞基因的表达及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制.     

Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines

In eukaryotes, double-stranded (ds) RNA induces sequence-specific inhibition of gene expression, referred to as RNA interference (RNAi). In invertebrates, RNAi can be triggered effectively by either long dsRNAs or 21- to 23-nt-long short interfering (si) duplex RNAs, acting as effectors of RNAi. siRNAs recently have been shown to act as potent inducers of RNAi in cultured mammalian cells. However, studies of RNAi activated by long dsRNA are impeded by its nonspecific effects, mediated by dsRNA-dependent protein kinase PKR and RNase L. Here, we report that the RNAi response can be induced effectively by long dsRNA in nondifferentiated mouse cells grown in culture. Transfection of dsRNA into embryonal carcinoma (EC) P19 and F9 cells results in a sequence-specific decrease in the level of proteins expressed from either exogenous or endogenous genes. dsRNA-mediated inhibition of the reporter gene also occurs in mouse embryonic stem cells. The RNAi effect is mediated by siRNAs, which are generated by cleavage of dsRNA by the RNaseIII-like enzyme, Dicer. We demonstrate that extracts prepared from EC cells catalyze processing of dsRNA into approximately 23-nt fragments and that Dicer localizes to the cytoplasm of EC and HeLa cells.     

RNA干扰技术及其在血吸虫基因功能研究中的应用

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是近年来发展起来的一种干扰基因表达和进行功能性基因组筛选的方法。它利用dsRNA与靶基因mRNA上一段序列互补结合并将其降解,从而使基因表达受到抑制。RNAi目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等领域取得了令人瞩目的进展,其在医学领域的应用有着广阔的前景。血吸虫病作为危害人畜健康的重要公共卫生问题之一,已经受到了全球的关注,了解血吸虫基因的功能,可以为发现药物靶标和研发候选基因疫苗开辟广阔的前景。