PCR-SSCP快速检测结核分支杆菌rPOB基因突变

结核分支杆菌的耐药性问题仍是人们长期关注的焦点问题。利福平是当今最主要的抗结核药物之一,如感染菌为利福平耐药,则治疗效果将受到严重影响。因此,利福平耐药性测定尤为重要。然而,由于结核分支杆菌生长缓慢,常规药敏试验需4～6周,不能满足临床之急需。分子生物学技术的不断发展给结核分支杆菌耐药性的快速检测带来了希望。近年的研究表明结核分支杆菌利福平耐药与rPOB基因突变有关,因此检测rPOB基因突变有助于了解利福平的耐药     

利用重组分支杆菌噬菌体快速筛选耐利福平结核分支杆菌

目的：采用基因工程技术构建的可表达荧光素酶的结核分支杆菌噬菌体进行结核分支杆菌利福平药敏试验研究,建立一种特异、灵敏、快速的利福平药敏试验方法。方法采用生物发光方法分别检测重组分支杆菌噬菌体对不同细菌在不同浓度利福平培养其中的发光水平,并与罗氏培养基进行药敏药比较。结果在不同细菌中,噬菌体均特异地对分支杆菌有发光反应,分支杆菌的养基进行药敏试验比较。结果在不同细菌中,噬菌体均特异对对分支杆菌有发光     

90株非结核分支杆菌耐药情况的分析

目的 观察分析我院１９８６￣１９９７年非结核分支杆菌的耐药情况。方法 对９０株非结核分支杆菌用传统的方法进行菌种鉴定及药敏试验。结果 非结核分支杆菌对ＰＡＳ呈高度的耐药性，对ＳＭ、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＥＢＭ等耐药性也较高，对ＫＭ、ＴＨ较敏感。堪萨斯分支杆菌对抗结核药物较敏感，鸟，胞内、次要、土地、偶然等分支杆菌对抗经物耐药的较多。另外，非结核分支杆菌除对ＰＡＳ的低浓度与高浓度的耐药率较一致外，对其它六     

结核分支杆菌五种耐药基因检测的临床应用及评价

目的　检测结核分支杆菌rpoBkatG、rpsL、pncA和embB耐药基因 ,评价其临床应用价值。方法　采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)分析和药敏试验 (比例法 ) ,了解 10 9例肺结核患者结核分支杆菌耐药情况 ,并分析、比较临床治疗效果。结果　 1/ 2以上的肺结核患者至少耐两种抗结核药物 ,对RFP、INH、SM、PZA和EB总耐药率分别为 80 7%、71 5 %、78 8%、5 7 7%和48 6%。rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变率分别为 76%、68%、71%、5 1%和 3 0 %。结核分支杆菌耐药基因突变率与耐药水平联系密切 ,多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药株 ,也有少数基因突变发生在低耐药株。根据药敏试验和耐药基因检测结果 ,6个月耐多药结核治愈率分别达到 5 4 8%和 62 8% ,治疗效果满意 ,两种方法差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,PCR SSCP方法敏感、特异 ,可以快速检测结核分支杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB耐药基因突变 ,可能会成为临床指导用药的好方法     

应用反向斑点杂交法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的　探讨快速检测rpoB基因突变的敏感方法 ,以期建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法　根据结核分支杆菌野生株序列 ,自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上 ,然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的rpoB基因片段 ,与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交 ,对突变位点进行快速检测 ,并与药敏试验及DNA测序结果进行比较。结果　应用反向斑点杂交法检测 36株耐药株和 2 2株敏感株rpoB基因的突变位点 ,并据此判断其对利福平的药敏特性 ,结果敏感性为 88.9% ,特异性为 86 .4 % ,药敏结果符合率为 87.9% ,与测序结果的符合率为 89.7%。结论　反向斑点杂交法可以快速、敏感地检测rpoB基因突变 ,进而早期判断结核分支杆菌对利福平的药敏特性。     

90株非结核分支杆菌耐药情况的分析

目的观察分析我院1986~1997年非结核分支杆菌的耐药情况?方法对90株非结核分支杆菌用传统的方法进行菌种鉴定及药敏试验?结果非结核分支杆菌对PAS呈高度的耐药性,对SM?INH?RFP?EBM等耐药性也较高,对KM?TH较敏感?堪萨斯分支杆菌对抗结核药物较敏感,鸟?胞内?次要?土地?偶然等分支杆菌对抗结核药物耐药的较多?另外,非结核分支杆菌除对PAS的低浓度与高浓度的耐药率较一致外,对其它六种药物低?高浓度的耐药率有较大差异?说明许多非结核杆菌对抗结核药物呈天然的抗药性?结论针对以上情况,有待解决的是研制新药与更有效的治疗手段。     

258例初始结核病人的耐药性分析

目的:了解我市结核病人的初始耐药情况.方法:对来我院就诊的门诊和住院的初治(未用药或用药史小于1月)结核病人,进行分支杆菌培养,阳性者做药敏试验,药敏试验采用绝对浓度间接法.     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

聚合酶链反应－冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变

目的评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应－冷单链构象多态性（ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ）方法对８７株结核分支杆菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行分析。结果ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性为１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，属于分支杆菌特异。所有分离菌的ｒｐｏＢ基因ＰＣＲ扩增均为阳性。采用套式ＰＣＲ可使扩增敏感性提高１００倍。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ对８７株结核分支杆菌临床分离菌利福平耐药性的检测敏感性和特异性分别为８９．６％及１００％。２２份涂阳培阳痰标本中套式ＰＣＲ扩增阳性的６份均为高度利福平耐药，其ＳＳＣＰ结果也与相应分离株的药物敏感性试验相符。结论ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变快速、简便、易行，适用于结核分支杆菌分离株利福平耐药性的快速测定。如进一步提高引物增特异性及敏感性，该技术可望用于临床标本直接检测     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的：建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法，了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法：108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）和传统梯度药敏试验。结果：耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(KatG)基因突变率分别为78.5％，68.2％，70.5％，其中，高耐SM，RFP，INH分离株分别为86.5％，89.3％，84.3％；低耐分离株分别为28.5％，16.5％，7.1％。结论：结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系，绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株，少部分在低耐药株发生基因突变。     

应用硝酸盐还原试验快速检测结核分支杆菌耐药性的研究

目的 建立一种快速结核分支杆菌耐药性试验方法。方法 以绝对浓度法为“金标准”，对已知耐药的结核分支杆菌菌株及敏感株采用硝酸盐还原试验(NRA)检测其耐药性。结果 两种方法可比性好，与绝对浓度法比较，硝酸盐还原试验敏感性为96.5％以上，特异性100％；NRA法比绝对浓度法平均提前3周出结果。结论 硝酸盐还原试验可作为一种快速结核分支杆菌耐药性试验方法。     

三种结核分支杆菌耐药基因的检测方法

目的　建立3种结核分支杆菌耐药基因的检测方法,了解耐药基因突变和耐药水平的关系。方法 108例临床痰标本分离株均做聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP)和传统梯度药敏试验。结果 耐SM (rpsL)、RFP (rpoB)、INH (KatG)基因突变率分别为78.5%,68.2%,70.5%,其中,高耐SM,RFP,INH分离株分别为86.5%,89.3%,84.3%;低耐分离株分别为28.5%,16.5%,7.1%。结论 结核分支杆菌耐药基因突变与耐药水平有密切联系,绝大多数结核分支杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变。     

结核分支村菌耐药分子机制及快速检测的研究

目的：研究结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药的分子机制，探索快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性的分子生物学方法。方法：应用聚合酶反应－单链构象多态性（PCR-SSCP）检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药株与katG基因、rpoB基因突变。结果：46株结核分支杆菌临床分离株均未发现katG基因序列的缺失，30株异烟肼耐药株中，17株检测到katG基因突变，耐药株中katG基因的突变率为57％；87株结核分支杆菌利福平耐药临床分离株的PCR－SSCP结果显示，所有39株利福平敏感菌无突变检出，48株利福平耐药菌中，36株高度利福平耐药菌和7株低度利福平耐药菌检测量到rpoB基因突变；利福平耐药株中rpoB基因的突变检出率为89．6％。结论：证实katG和rpoB基因突变分别是结核分支杆菌异烟肼和利福平耐的主要分子机制。应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）可快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

应用线性探针分析快速检测耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变

目的：检测上海地区耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变,评估线性探针分析（LiPA)法快速检测突变位点的意义。方法：对58株结核分支杆菌rpoB基因片段进行PCR扩增及DNA测序,从中选取18株耐药株和10株敏感株并应用LiPA法检测其突变位点,结果：LiPA法准确地检测出18株耐药株中17株的rpoB基因突变,10株敏感株均无突变;LiPA法检测耐药菌的敏感性为94．4％,与药敏结果的符合率为96．4％,结论：LiPA法可用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因的快速检测,而且具有较高的敏感性。     

结核分支杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐利福平（ＲＦＰ）分离株ｒｐｏＢ基因突变情况，建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法通过聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＰＣＲ－ＤＳ）分析５０株结核分支杆菌临床分离株的ｒｐｏＢ基因。结果３株结核分支杆菌药物敏感株和２株非ＲＦＰ耐药株中，仅１株ｒｐｏＢＳＳＣＰ图谱异常的药物敏感株出现５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ突变。４５株ＲＦＰ耐药株中，１０株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析均未见ｒｐｏＢ突变，３５株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析异常，其中１４株为５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ或ＴＧＧ或ＴＡＣ突变，１４株为５２６位ＣＡＣ→ＴＡＣ或ＧＡＣ或ＣＣＣ或ＣＴＣ或ＧＴＣ突变，２株为５１６位ＧＡＣ→ＧＴＣ或ＴＡＣ突变，２株为５１６位和５２６位及５１５位和５１６位密码子双点突变，３株ｒｐｏＢ序列与结核分支杆菌不同。结论大多数结核分支杆菌耐ＲＦＰ是由于其ｒｐｏＢ基因突变所致，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定结核分支杆菌ＲＦＰ耐药基因型     

分支杆菌药物敏感性测定的几个问题

非结核分支杆菌病的治疗和药物敏感性测定最初是模仿结核病的治疗和结核分支杆菌药敏试验。但是,非结核分支杆菌在药物敏感性方面存在一些自己的特征。因此,与结核分支杆菌药敏试验方法有所不同。目前对分支杆菌药物敏感性研究尚欠深入,对其规律性认识不清,结果不令人满意。一、分支杆菌药物敏感性特征就其对药物敏感性而言,非结核分支杆菌存在三个特点:(1)药物敏感度幅度大,分布散。结核分支杆菌野生株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星等的最低抑菌浓度(ＭＩＣ)范围相差仅2～4倍,而鸟分支杆菌野生株对上述药物的ＭＩＣ范围则…     

耐多药结核病耐药分子机制的研究

目的 研究耐多药结核分支杆菌耐药的分子机理，建立快速检测耐药基因的分子药敏试验方法。方法 通过ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结构分支杆菌耐多药临床分离株的ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列。结果 ＰＣＲ分析耐药基因的敏感性为１－０ｐｇＤＮＡ；除ｒｐｏＢ基因引物ＰＣＲ扩增为属特异性外，余耐药基因引物ＰＣＲ扩增都具有较高的的特异性。２０株耐多药分离株中，９０％有２种以上耐药遗传标志改变，     

结核分支杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因突变的测序分析

乙胺丁醇 (EMB)是具有广谱抗分支杆菌活性的一线抗结核合成药物 ,被广泛应用于结核分支杆菌、鸟分支杆菌和堪萨斯分支杆菌等多种非结核分支杆菌的治疗。近年来 ,EMB在原发和复发结核病患者中的耐药率有上升趋势[1],我们应用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)银染技术和PCR 自动测序法对结核分支杆菌embB基因进行了检测 ,以探讨建立直接快速检测结核分支杆菌EMB药物敏感性的实验方法。材料与方法　结核分支杆菌H3 7Rv标准株来源于中国药品生物制品鉴定所 ;48株结核分支杆菌分离株来源于河南省结核病耐药检测收集的菌株 ,其中…     

110株结核分支杆菌对喹喏酮类药物的药敏试验分析

目的　分析110株结核分支杆菌对环丙沙星(CPLX)、氧氟沙星(OFLX)、左氧氟沙星(LVFX)、司帕沙星(SPFX)的药敏试验结果。方法 采用2倍稀释法,改良罗氏培养基进行药敏试验。结果 49例初治病人耐药率:CPLX4%,OFLX8%,LVFX2%,SPFX6%;52例耐多药菌株耐药率:CPLX52%,OFLX44%,LVFX22%,SPFX10%;110株结核分支杆菌总耐药率:CPLX26.2%,OFLX24.7%,LVFX10.5%,SPFX7.2%。交叉耐药率23.6%。结论 (1)初治结核病人,抗炎治疗尽量避免使用喹喏酮类药物;(2)复治结核病人要选择合理治疗方案,避免假联合用药;(3)应用喹喏酮类药物,剂量要足,疗程要够;(4)建议将喹喏酮类药列入结核分枝杆菌常规药敏试验中。     

噬菌体生物扩增法快速测定结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性的研究

目的 建立快速测定结核分支杆菌(MTB)丁胺卡那霉素耐药性的噬菌体生物扩增法,并探讨其在结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性测定中的应用价值.方法 应用噬菌体生物扩增法测定112株结核分支杆菌丁胺卡那霉素耐药性,并与绝对浓度法结果进行比较,对不符合的菌株采用Baetee MGIT960测定其最低抑菌浓度(MIG).结果 以细菌接种量为10-3mg/ml,药物浓度5μg/ml、37℃作用24 h为药敏试验条件.噬菌体法测定112株结核分支杆菌临床分离株丁胺卡那霉素敏感89株、耐药23株,绝对浓度法敏感91株、耐药21株;两法测定均为敏感87株、均为耐药19株.在6株噬菌体法与绝对浓度法测定结果 不符的菌株中,4株噬菌体法与MIC测定结果 相符合.如以绝对浓度法药敏结果 为判断标准,则噬菌体法测定丁胺卡那霉素耐药性的敏感性为90.48%(19/21),特异性为95.60%(87/91),阳性预测值为82.60%(19/23),阴性预测值为97.75%(87/89),准确性为94.64%(106/112).结论 噬菌体生物扩增法测定丁胺卡那霉素耐药性简便快速,只需2 d时间.操作不需特殊仪器设备,具有很高的敏感性和特异性,可作为MTB的丁胺卡那霉素耐药性快速筛选方法,建议临床推广应用.