皮质骨Ⅰ型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备

[目的] 探索一种较理想的皮质骨Ⅰ型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料.[方法] 以牛皮质骨为原料,经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉.通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉,经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原,SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征;再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料,扫描电镜观察其内部结构.[结果] 所得胶原经SDS-PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合Ⅰ型胶原特征;制备的支架材料外观呈圆柱状,内部为孔径均匀平行排列的微管结构,具有仿生效果.[结论] 皮质骨中能够获得纯度较高的Ⅰ型胶原,可用于胶原材料的制作.     

从四种生物原料中制备高纯度I型胶原的比较

[目的]比较从4种生物原料中制备高纯度Ⅰ型胶原,以满足骨组织工程应用的需要。[方法]分别以牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱和猪皮为原料,采用酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法提取Ⅰ型胶原,并用紫外吸光度、氨基酸分析、SDS-PAGE电泳进行鉴定,计算提取率、纯度,同时与Sigma公司产品进行比较。[结果]本法所提胶原的最大紫外光吸收波长为230nm,氨基酸分析、电泳鉴定符合Ⅰ型胶原特征。牛皮质骨所提胶原纯度最高（96.12%）,优于Sigma公司产品,而牛腱胶原提取率最高（75.34%）,超过常规方法。[结论]限制性酶解法可以从4种生物原料中制备高纯度、高提取率的Ⅰ型胶原产品,其中以牛皮质骨胶原最好,具有良好的应用前景。     

脱钙骨基质在鼻整形手术中的临床应用进展

脱钙骨基质为异体骨经脱脂、脱水、脱钙、冻干等处理后所得,是具备低抗原性及诱导新骨形成能力的同种异体移植物。脱钙骨基质在骨科及颌面部整形中已获得成熟应用,但在鼻整形中的应用尚有限。现简述脱钙骨基质的作用机制,并着重探讨用于鼻整形时的手术并发症与吸收率。     

异体冻干脱钙骨基质隆鼻的实验研究及临床应用初步报告

为了研究异体冻干脱钙骨基质在隆鼻术中的应用效果，作者利用正常新鲜四肢骨干皮质骨经脱脂、脱钙、清毒、冷冻干燥等过程，制备成冻干脱钙骨基质。动物实验中观察到将该种材料植于骨膜下和皮下时均有成骨现象，且植于骨膜下的成骨量优于皮下。临床上利用冻干脱钙骨基质进行隆鼻术，将该材料植于鼻骨表面，对１５例受术者中的８例进行了５～１８个月的随访，取得了较满意的效果。作者认为冻干脱钙骨基质有良好的诱导成骨作用，同时该材料易于雕刻修整，不发生排斥反应，能够长期保存，因此作为隆鼻衬垫材料具有可行性     

转基因骨髓间质干细胞在组织工程承载体中生长及成骨转化的研究

[目的]观察经携带人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的复制缺陷重组腺病毒(Ad-BMP-2)转染的兔骨髓间质干细胞(MSCs)在以兔脱细胞脱钙骨基质作为组织工程承载体中的生长情况及转基因前后细胞成骨能力的变化。[方法]用携带有人BMP-2基因片段的复制缺陷重组腺病毒(Ad-BMP-2)转染兔骨髓间质干细胞并将其种植在兔脱细胞脱钙骨基质支架中,扫描电镜观察转基因细胞在支架中的黏附生长情况;并通过检测培养上清中的碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)含量及Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)的分泌量来评估转基因对MSCs成骨能力的影响。[结果]转基因骨髓间质干细胞在组织工程支架中黏附生长良好,转基因组细胞的ALP、BGP含量及Ⅰ型胶原的分泌量与对照组比较差异有显著性意义。[结论]转基因骨髓间质干细胞在兔脱细胞脱钙骨基质支架中能很好的黏附并立体生长,转基因细胞在目的基因所表达的BMP-2蛋白作用下成骨能力明显增强。     

脱钙皮质骨基质的拉伸力学性能研究

目的探讨脱钙皮质骨基质厚度与拉伸力学性能的关系,为将其作为组织工程支架材料奠定实验基础。方法取市售新鲜小牛胫骨,常规快速脱钙制备脱钙皮质骨基质,大体观察其颜色、质地等物理性状,并进行脱钙检测。将脱钙皮质骨基质沿径向纵切成不同厚度的片材,并根据厚度分为4组(n=16),分别为A组100～300μm,B组300～500μm,C组500～700μm,D组700～1 000μm;对每组标本进行拉伸性能和组织学观测。结果大体观察显示脱钙皮质骨基质经H2O2处理后呈乳白色,柔韧性好,富有弹性。脱钙皮质骨基质的脱钙率达97.6%。A组强度及弹性模量明显小于B、C、D组(P<0.05),B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);脱钙皮质骨基质刚度随厚度增加呈逐渐增大趋势,A组刚度显著低于B、C、D组(P<0.05),B、C组低于D组(P<0.05),B、C组间差异无统计学意义(P>0.05);各组极限应变差异均无统计学意义(P>0.05)。组织学观察各组均可见典型骨单位结构,其最大直径范围为102～325μm,平均最大直径为182μm。结论骨单位的完整性对脱钙皮质骨基质的力学性能有重要影响;脱钙皮质骨基质作为组织工程支架材料,在厚度>300μm时可保持其拉伸力学性能。     

去蛋白脱钙皮质骨基质微颗粒用于骨髓基质干细胞体外培养的相关研究

目的 比较牛去蛋白脱钙皮质骨基质(bDpDBM)微颗粒和牛脱钙皮质骨基质(bDBM)微颗粒用于体外干细胞培养的优缺点,探讨其作为微载体制备候选材料的可行性. 方法 冷冻粉碎牛四肢皮质骨,筛选出直径为200 ～ 500μm的微颗粒,按照常规方法进行脱脂、脱钙、脱蛋白处理.设bDpDBM和bDBM微颗粒为研究对象,用于静态条件下骨髓基质干细胞(BMSCs)的培养,比较两组微颗粒对干细胞增殖及功能保持的影响,分析其用于BMSCs培养的可行性. 结果 两组微载体进行培养第14天后显示bDpDBM组细胞扩增较bDBM组快,差异有统计学意义(P＜0.05).经bDBM组培养的BMSCs的ALP定量及胞内钙含量明显较bDpDBM组多,差异有统计学意义(P＜0.05).而bDpDBM颗粒培养的BMSCs经诱导可向成骨、成脂及成软骨三系分化. 结论 bDpDBM由于去除了脱钙骨基质中的活性诱导成分,培养增殖效率增高,可较好地保持干细胞表型,适宜用作体外大量扩增BMSCs的微载体候选材料.     

皮质骨连续植块培养成骨细胞的生物学特性比较

[目的]通过比较皮质骨2次连续植块培养所获细胞的体外培养和成骨特性,探讨皮质骨连续植块培养的可行性。[方法]取3个月龄新西兰大白兔上肢皮质骨,用组织块法对皮质骨块进行连续植块培养。取第4代细胞进行实验,倒置相差显微镜下观察和结晶紫染色比较细胞形态、噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖曲线、对硝基酚法测碱性磷酸酶(ALP)活性、酶免法测定骨钙素(BGP)活性及观察钙结节的产生等。[结果]普通显微镜下2次连续植块培养的细胞在形态学上无显著差异,呈长梭形、三角形或者不规则形;2次植块培养的细胞在增殖能力方面无明显差异,在ALP、BGP和钙结节等成骨特性上有明显的表达,二者成骨特性亦无明显差异。[结论]皮质骨来源的成骨细胞成分相对单纯,2次连续植块细胞的增殖和成骨能力相当,可以进行连续植块培养以重复利用骨块,达到节省经费、节约时间的目的。     

75%酒精超声清洗工艺对同种脱钙骨基质性能的影响

目的研究75%酒精超声清洗对同种脱钙骨基质(DBM)结构及成骨性能的影响。方法制备2组DBM,A组(75%酒精超声清洗处理),B组(常规处理),通过HE染色观察脱钙骨基质结构变化。建立裸鼠异位诱导成骨试验模型,通过拍摄X线片观察成骨情况,进而行大体观察和组织形态学观察,并进行成骨反应的组织学评分。结果结构观察:A组和B组均可见骨胶原结构保持完整,无明显破坏,2组无差异。X线观察:术后当天,裸鼠后腿部为正常肌肉显影,术后28 d双侧均可见较亮的显影。大体观察:术后观察裸鼠活动自如,切口愈合良好,脱钙骨基质被肌肉包裹,无肌肉坏死。A、B组无差异。组织形态学观察:术后28 d,HE染色可见A组:植入部位炎症反应较小,肌肉无坏死,脱钙骨基质有少量降解,周围或中间空隙可见一些透明软骨细胞,软骨细胞活跃,并开始分泌形成软骨基质。脱钙骨基质周围甚至有新生骨基质形成,可见成熟的骨细胞。B组与A组组织形态学观察结果大体一致。经组织学评分显示,2组差异无统计学意义(P0.05)。结论 75%酒精超声清洗30 min不会对同种脱钙骨基质结构及性能造成损失,可作为脱钙骨基质制备的一道程序。     

骨胶原的制备及作为骨形成蛋白载体修复骨缺损的研究

在提取BMP的过程中,从废去的中间产物骨基质胶中同时提取胶原作为BMP的载体用于修复兔颅骨缺损.40只大白兔随机分为A、B两组,在兔颅顶骨两侧对称各制造直径为1cm的圆形骨缺损,A组兔颅顶骨缺损左侧植入骨胶原/BMP,右侧植入单纯骨胶原,B组兔左侧植入BMP,右侧空白对照,组织学检查显示:植入后7夭,骨胶原/BMP组即有软骨细胞岛出现,旦在各期的成骨面积均大于单纯BMP组和胶原组.另外,移植材料内的灰量测定结果及X线摄片结果也表明,骨胶原/BMP的成骨量明显大于单纯骨胶原组和BMP组(P<0.01),认为骨胶原作为BMP的载体有更多的优越性.     

猪骨形态形成蛋白(BMP)的实验研究

本文报告从猪骨基质中提取BMP的方法及其生物活性测定结果。在猪骨BMP提取过程中,每100g湿骨可得到24g脱钙骨,经进一步处理得到17g骨基质明胶,利用氯化钙、尿素作为提取剂,每100g可提取到0.24gBMP。所得BMP经SDS—PAGE测定,其分子量范围≤20KD。研究表明,猪BMP能在异种动物体内诱导间充质细胞向成软骨、成骨细胞分化,并产生新骨。     

成型脱钙骨基质移植重建完全半月板缺损的实验研究

[目的]探索成型脱钙骨基质作为完全半月板缺损后替代假体的可行性，并进行移植假体引导自体组织再生效果的评价。[方法]脱钙骨基质按照Urist方法制备，并依据半月板的形状预制成型。48只新西兰大白兔随机分为脱钙骨基质移植组和脱细胞同种异体移植（冻融处理）对照组，并将两组按照三个不同时期分为3个配伍组。将各组动物分作关节功能评价，大体观察，组织学和免疫学观察；并进行统计分析。[结果]脱钙骨基质组回缩较小，细胞组织的增殖活性更高；两组总体和各期在移植体回缩率，免疫组织化学检查均有统计学意义。[结论]成型脱钙骨基质作为半月板假体较脱细胞同种异体半月板具有更好的性能结构和增殖活性。     

I型胶原C末端肽的检测方法和临床运用

I型胶原是人体最丰富的胶原蛋白形式 ,是骨中唯一的胶原成分 ,占骨基质的 90 %以上。在骨组织骨基质的不断重建中 ,I型胶原被降解 ,小片段释放入血 ,部分出现于尿液中。测定血、尿中这些小片段的含量和变化可评价骨吸收状态 ,既有助于代谢性骨病的诊断 ,也能监测和评价抗骨吸收药物的疗效。I型胶原 C末端肽 (C— terminal telopep-tides of type I collagen,CTX) ,又称为 Cross-laps,是这些小肽片段中的一种。Bonde于 1 994年建立 CTX的检测方法 [1] ,并率先应用它作为骨吸收的指标。同传统的骨吸收指标尿羟脯氨酸 (Hydroxyproline,H…     

异种脱蛋白骨管复合不同移植材料修复大段骨缺损的实验研究

目的 应用异种脱蛋白骨管复合骨基质明胶(BMG)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨膜细胞与复合脱钙骨基质(DBM)、自体红骨髓(RBM)作比较,观察修复猪大段骨缺损的成骨差异.方法 建立猪双侧胫骨大段骨缺损模型.24只成年猪,随机分成2组,实验组A:异种骨管+BMG、BMP、骨膜细胞;实验组B:异种骨管+DBMLRBM;两组均采用锁定钢板及异种皮质骨板固定.分别于术后4、8、12、24周时通过大体标本观察.放射学及组织学观察评估其修复猪大段骨缺损的成骨情况.结果 植入后24周,异种骨管复合BMG、BMP、骨膜细胞完全修复.成骨活跃程度,骨再生量和重建髓腔结构等方面均显著;复合脱钙骨基质、自体红骨髓成骨能力较弱.结论 异种脱蛋白皮质骨管复合骨基质明胶、骨形态发生蛋白及骨膜细胞能够有效修复大段骨缺损.     

同种异体骨基质明胶治疗鞍鼻畸形的疗效观察

目的：研究同种异体骨基质明胶治疗鞍鼻畸形的可行性。方法：无菌下取人体四肢长骨骨皮质，液氮冷冻10min。骨皮质经氯仿、甲醇脱脂，盐酸脱矿，氯化钙、乙二胺四乙酸、氯化锂处理制备成骨基质明胶。23例患者接受了骨基质明胶植入鼻成形术，其中先天性鞍鼻畸形16例，外伤性鞍鼻畸形7例。结果：经0．5-6年的随访，骨基质明胶植入物无变形或免疫排斥反应，虽有轻微吸收，但外形满意。结论：骨基质明胶植入治疗鞍鼻畸形有临床应用价值。     

髓心减压及异体骨笼结合脱钙骨基质治疗股骨头坏死临床研究

[目的]回顾性分析髓心减压及异体螺纹骨笼结合脱钙骨基质和自体骨植入治疗早期股骨头坏死的临床疗效，探讨其影响因素。[方法]本院于2000年2月～2006年8月间收治早期股骨头坏死76例（78髋），均采用髓心减压及异体螺纹骨笼结合脱钙骨基质和自体骨植入，术后预防性的静脉给予抗生素及抗凝治疗，并限制负重。临床评估采用Harris评分系统，评估术后患髋功能的改善情况，并定期行X线检查。[结果]76例均获得随访（24—68个月），术后进行疗效评估。参考Harris评分系统，术前的平均Harris评分为62．8分，术后平均评分为81．6分。髋关节影像学表现稳定，股骨头无坏死进展。[结论]髓心减压及异体螺纹骨笼结合脱钙骨基质和自体骨植入术治疗早期股骨头坏死临床效果满意，有利于骨坏死的修复和重建，适合于Ⅰ期和Ⅱ期股骨头坏死的患者。     

纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞作为软骨组织工程支架的可行性及有效性,并为后续研究可注射性材料做基础。方法：体外分离培养软骨细胞后接种到纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料体外培养4周,然后植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察。并进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果。结果：大体观察4周后,实验组软骨缺损区可有乳白色组织修复,12周可修复完全,并无明显凹凸感。光镜下8周可见大量软骨细胞修复,并在TB染色下见Ⅱ型胶原比4周时明显增多。12周时软骨陷窝结构形成,细胞形态排列及Ⅱ型胶原与正常软骨组织相近。结论：纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。并为构建可注射性修复材料提供途径。     

不同方法处理的同种异体移植免疫学比较

为比较不同处理的同种异体骨移植的免疫反应，作者用新鲜骨，自消化抗原去除骨，骨基质明胶和脱钙骨基质分别植入小鼠肌肉，行免疫学和组织碱性碱酸酶检测。结果同种异体新发宿主抗体水平最高，在体外明显刺激淋巴细胞增殖，而后三种移植物引发的主抗水平较低，在体外抑制淋巴细胞增殖，结论：免疫异抑制移植物成骨，骨诱导活性物质抑制免疫反应。     

异种脱钙骨基质颗粒的生物相容性实验研究

目的 评价制备的异种脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)植入体内的生物相容性,为进一步实验研究和临床应用提供依据.方法 取猪四肢长管状骨皮质骨经理化处理后,制备脱脂脱钙(材料A)和脱脂脱钙去细胞(材料B)两种粒径为250～810 μm的DBM颗粒和浸提液,骨颗粒脱脂脱钙后测钙、磷含量.采用标准的毒理学方法进行急性毒性实验、皮肤刺激实验、热原实验、溶血实验、细胞毒性实验和肌肉植入实验.结果 未脱钙皮质骨钙、磷含量分别为(189.09±3.12)mg/g和(124.73±2.87)mg/g:DBM颗粒的钙、磷含量分别为(3.48±0.09)mg/g和(3.46±0.07)mg/g;DBM颗粒钙、磷含量分别为未脱钙皮质骨的1.87%和2.69%.急性毒性实验:各组小鼠活动正常,7 d内小鼠无死亡,各组动物未见中毒症状或不良反应;7 d后各组小鼠体重日平均增加差异无统计学意义(P>0.05).皮内刺激实验观察显示,注射材料A、B浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和皮肤坏死,极轻微刺激.热原实验两组动物体温升高最高均为0.4℃,符合<0.6℃的国家标准.材料A浸提液的溶血率为1.14%,材料B为0.93%,符合<5%的国家标准.异种DBM的细胞毒性为0～1级.肌肉内植入实验显示动物术后生存良好,各植入部位均未见组织坏死、积液及化脓感染.术后不同时间点植入材料A、B组局部细胞免疫定量评分比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 DBM颗粒的毒性程度为无毒,皮肤无刺激,无热原性,溶血率<5%,对细胞无明显毒性,具有良好的生物相容性和一定的骨诱导性.     

一种高效制备工艺对脱钙骨基质性能的影响

目的 目前脱钙骨基质生产工艺耗时长效率低,浪费资源和成本.本研究在保存骨诱导活性的前提下,显著缩短了脱钙骨基质的工艺时间.方法 采用动态脱钙和二次换酸工艺制备脱钙骨基质,对pH值、钙含量进行评价.用裸鼠体内植入实验评价这种脱钙骨基质骨诱导活性.结果 材料的pH值为6.2±0.3,呈弱酸性.钙含量为(0.6±0.2)％,符合＜6％的标准.裸鼠体内植入后创面一期愈合,无不良反应发生.其骨诱导活性阳性,4周时可见大量的新生骨组织、骨髓样组织和软骨化成骨现象.结论 该工艺可以提高脱钙骨基质生产效率,不影响材料活性.