脐带血造血干细胞的分离和冷冻保存研究

目的探讨为临床移植有效地分离和冷冻保存无关供者脐带血中的造血干细胞的方法。方法将由普通或改进的两种不同采集袋采集的脐带血,用两步离心法分离、浓缩脐带血中的有核细胞,用BioArchive System(生物档案系统)或常规的程控降温系统将之冷冻,保存在-196℃液氮中。用流式细胞术和细胞培养法检测脐带血中的CD34+细胞和造血祖细胞含量。结果脐带血用改进的采集袋分离后,有核细胞和红细胞的回收率分别为86.4%±4.6%和44.2%±9.6%,而普通采集袋的回收率为78.4%±7.9%和49.8%±11.7%;将富含有核细胞悬液的体积浓缩到20 ml时,有核细胞和红细胞的回收率分别为74.62±9.3%和34.9%±19.1%,浓缩体积为32 ml回收率为86.4%±4.6%和45.1%±7.8%/但两者的CD34+细胞和造血祖细胞的回收率无统计学意义;冷冻脐带血融化后有核细胞、CD34+细胞和CFU-C回收率分别为84.2%±10.1%、96.0%±21.8%和115.1%±23.3%。苔盼蓝拒染率93.8%±4.4%。结论改进的采集袋能够明显提高有核细胞回收率。采用两步离心法和两种冻存方法能够有效地富集和冻存脐带血中的造血干细胞。     

成人骨髓间充质干细胞对造血干细胞体外增殖的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（MSC）对脐带血（CB）CD34^＋细胞体外增殖和造血重建能力的影响。方法取人骨髓单个核细胞贴壁培养．梭形细胞完全融合后传代，用流式细胞仪检测免疫表型；将CBCD34^＋细胞接种到MSC或其他培养液中．比较不同培养条件对造血干细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响。结果在加入IL-3的培养体系中．在MSC和细胞因子作用下，CD34^＋细胞扩增7d和14d后，有核细胞（NC）、CD34^＋细胞和CDl33^＋细胞数，实验组均显著多于对照组。CD34＋细胞在未加入IL-3的培养体系中培养8d后，实验组NC、CD34^＋细胞、CD34^＋CD38-细胞和造血祖细胞集落扩增倍数均显著高于对照组。扩增后CD34^＋细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无显著变化。结论MSC可为造血干细胞（HSC）体外扩增提供适宜的微环境，有助于CD34^＋细胞体外增殖并抑制HSC分化，保持其造血重建潜能和归巢能力。     

造血干细胞体外扩增的研究进展

造血干细胞数量限制了其临床应用.随着各种造血调控因子的问世、细胞分选技术的进步及体外扩增技术的不断改进和完善,有望通过体外扩增技术来解决成人HSC移植的数量问题.造血干细胞体外扩增主要因素包括细胞园子调控造血,滋养层细胞支持造血,三维空间立体培养优化造血等影响因素.     

人脐血造血干细胞体外扩增方法初探

目的 建立人造血干细胞(HSC)体外大量扩增的最佳培养模型.方法 采用模拟骨髓微环境的成骨细胞共培养法、条件培养基及模拟微重力效应三维培养等方法进行人脐带血来源HSC体外扩增.结果 在用含15%的条件培养基与成骨细胞共培养条件下,HSC的扩增倍数最高,第7天和第14天扩增倍数分别为6.46和14.82倍.在此条件下进行集落形成实验对扩增后造血干细胞多能性的功能检测发现,粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)及红系集落形成单位(BFU-E)数目也最多.结论 以成骨细胞作为饲养层细胞,添加15%的条件培养基不仅能使HSC在体外大量增殖,并且具有维持HSC自我更新和多向分化潜能.     

造血干/祖细胞的体外扩增培养研究

利用旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel,RWV)体外培养脐带血干细胞,使其大量扩增,以满足临床应用对造血干/祖细胞的数量与质量要求。从脐带血分离得到的单个核细胞(Mononuclear cells,MNC)在T-flask中培养24h,之后接种到RWV反应器中,培养200h。每24h细胞计数,测量培养基的pH和渗透压变化;在144h和197h测CD34 细胞含量并做CFU-GM半固体培养。有核细胞(Nucleated cells,NC)与CD34 细胞在第197h,分别扩增了435.5±87.6倍和32.7±15.6倍,CFU-GM(Colony-forming unit-granulocyte/macrophage)细胞扩增了21.7±4.9倍。整个培养过程中,RWV反应器中的pH和渗透压都保持在造血细胞最佳的扩增条件内,pH基本保持在7.2~7.4之间,渗透压基本保持在290~310mmol/kg之间。由于旋转壁式生物反应器(RWV)结构上的特殊性,可以保证细胞在悬浮流动的状态下生长,很好地模拟了脐带中的造血微环境,使脐带血造血干细胞在该反应器中短期内得到大量扩增。     

人正常骨髓CD34^＋造血细胞体外扩增形成粒单系造血祖细胞 …

ＣＤ３４＾＋造血细胞以其独特的生物学功能正成为造血调控，造血干细胞移植和基因治疗最理想的靶细胞本文探讨人正常骨髓ＣＤ３４＾＋造血细胞在体外扩增形成单个核细胞（ＭＮＣ）及粒单系集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）的能力，采用ＣＩＭＳ－１００新型免疫磁性无菌分离术可获得纯度〉９０％的ＣＤ３４＾＋造血细胞，其直接形成ＣＦＵ－ＧＭ的能力要较骨髓ＭＮＣ提高６５倍，并有在含ＥＧＩＩＳ组合造血生长因子的无基质液培养系统     

细胞因子在人造血干细胞体外扩增培养中的作用研究进展

自体或异体造血干细胞移植被广泛地应用于临床治疗。因此,将造血干细胞进行体外扩增培养也成为一项极具挑战的实验技术。大量实验证据表明,在体外液体培养体系中加入适当的细胞因子,可以使造血干细胞得以扩增,同时可以调节其生长,即维持静止状态、自我更新、分化、凋亡、在微环境中的迁移等。笔者主要回顾了正向及负向调节细胞因子对造血干细胞体外扩增的作用,总结了几年来使用较多的几种细胞因子组合及造血干细胞体外扩增检测方法。     

造血干细胞体外扩增影响因素的研究进展

造血干细胞的体外扩增是在模拟体内造血系统的基础上,通过添加造血生长因子和其它有利于扩增的成分,来实现HSCs体外的生长和扩增.近年来,随着对造血干细胞生物学特性研究的不断深入,对HSCs体外扩增影响因素的研究取得了较大进展.就HSCs体外扩增影响因素的进展作一综述.     

造血干细胞体外扩增影响因素的研究进展

造血干细胞的体外扩增是在模拟体内造血系统的基础上,通过添加造血生长因子和其它有利于扩增的成分,来实现HSCs体外的生长和扩增.近年来,随着对造血干细胞生物学特性研究的不断深入,对HSCs体外扩增影响因素的研究取得了较大进展.就HSCs体外扩增影响因素的进展作一综述.     

骨髓基质细胞对造血的调控作用

骨髓基质细胞是组成骨髓造血微环境的细胞 ,是一个杂合的细胞群体 ,包括成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞等多种细胞成分。骨髓基质细胞通过分泌细胞因子以及与造血细胞直接接触参与对造血干 /祖细胞增殖与分化的调节。     

早期作用造血因子对人脐血CD34^＋细胞的体外扩增作用

为了观察早期作用造血细胞因子ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＴＰＯ单独及联合应用,对脐血ＣＤ３４＋细胞的体外扩增作用。我们用吸附单克隆抗体一磁珠分离系统富集人脐血ＣＤ３４＋细胞,在体外液体培养体系中加入不同的细胞因子扩增４周,每周取样计数有核细胞总数及集落形成细胞（ＣＦＣ）数。结果表明：用磁性细胞分离议富集脐血ＣＤ３４＋细胞纯度为８０％～８７％;一些细胞因子有明显的协同效应,其联合应用的扩增作用显著高于单因于作用：ＳＣＦ＋ＦＬ存在下,ＩＬ－３是有效扩增有核细胞总数及ＣＦＣ的关键因子了;细胞因子ＳＣＦ＋ＦＬ＋ＩＬ－３和ＳＣＦ＋ＦＬ＋ＩＬ－３＋ＩＬ－６组合对有核细胞总数及ＣＦＣ均有良好的扩增效应,培养２周时对ＣＦＣ的扩增倍数分别为３８．３±４．４和２９．６±２．７倍,可满足成人移植及基因治疗等的需要。     

转染IL-21的CD34~+脐血造血干细胞抗裸鼠卵巢癌作用研究

目的 探讨IL-21转染的脐血造血干细胞(CD34~+UBSC·IL-21)对荷卵巢癌裸鼠的治疗作用.方法 从脐血分离CD34~+造血干细胞,体外培养扩增后用于重组体pIRES2-IL-21-EGFP转染.以肿瘤大小、荷瘤鼠生存期判断CD34~+UBSC-IL-21对荷瘤裸鼠的治疗效应.以RT-PCR、免疫荧光、ELISA、Western blot、脾细胞增殖试验及免疫组化法分别鉴定CD34~+UBSC和肿瘤组织中IL-21的表达及活性.裸鼠脾细胞中NK细胞含量及脾细胞的杀伤效应、血清中IFN-γ和TNF-α水平分别用FCM与ELISA检测.结果 pIRES2-IL-21-EGFP成功转染CD34~+UBSC.CD34~+UBSC-IL-21能抑制肿瘤生长,延长荷瘤裸鼠生存期,治疗鼠肿瘤局部能表达IL-21、血清IFN-γ和TNF-α水平升高,NK细胞含量及NK细胞杀伤活性明显增强,与其他组相比,差异有统计学意义(P<0.01).结论 转染IL-21的CD34~+UBSC有良好的抗裸鼠卵巢癌作用,该结果为临床使用UBSC为载体的基因治疗卵巢癌研究奠定了基础.     

脐血细胞神经分化与移植的研究进展

自20年前Nakahata等发现人脐血中含有丰富的造血干细胞以来,脐血造血干,祖细胞的研究取得了很大的进展,并已成为一个新的造血干细胞来源。近来研究表明,脐血中的部分细胞在体外培养或体内移植后可分化为神经细胞,并可促进受损动物的神经功能恢复,本文将对脐血源神经细胞的研究进展进行探讨。     

人脐血单个核细胞向神经细胞分化

目的：观察培养前后人脐血单个核细胞(MNCs)的形态学及免疫反应性变化,探讨其能否向神经细胞的分化及机制。方法：密度梯度离心脐血中单个核细胞,接种并用。EGF和bFGF刺激细胞生长,倒置显微镜下观察培养前后细胞形态变化,并行免疫细胞化学鉴定。结果：培养前脐血MNCs胞体小呈圆形,nestin阳性细胞、AP2阳性细胞散在分布(阳性率为1．5％和3．4％)无GFAP阳性细胞着色。培养14d后,细胞群中相邻细胞突起连成网状;AP2、GFAP染色阳性细胞成片状分布(阳性率33．5％和24．6％),未见nestin阳性细胞。结论：脐血细胞中可能有多能干细胞,经体外培养后能分化为具有一定形态的神经细胞。     

脐血干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症

目的比较假肥大型肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)患者经脐血干细胞移植治疗前后其肌肉再生、抗肌萎缩蛋白表达和运动功能的改变;以及评价治疗的安全性。方法对1例经基因分析和肌肉活检及抗肌萎缩蛋白检测确诊的、已丧失行走能力的DMD患儿,经HLA配型,在脐血库中寻找到一个全相合的脐血供体。采用白消安+环磷酰胺+兔抗胸腺淋巴细胞球蛋白预处理后进行异基因脐血干细胞移植;术后采用环孢素A和骁悉方案预防移植物抗宿主反应(graftversushostreaction,GVHD)。同时定期检测原发病的生化指标如血清肌酸激酶(creatinekinase,CK)、造血重建的植入证据(血型转变、肌肉和血液系统的聚合酶链反应短串联重复序列分析)、缺陷基因是否纠正、新生肌肉是否出现、肌肉中抗肌萎缩蛋白是否表达和运动功能是否改善。结果(1)中性粒细胞在脐血干细胞移植后第15天(+15天)达到0.5×109/L,白细胞在+25天达正常水平;血小板于+22天达到20×109/L;血红蛋白维持于85～100g/L。术后140天骨髓穿刺提示三系生长旺盛;(2)移植后140天血型转为供体AB型。至今没有出现移植物抗宿主反应。(3)术后18天、30天、43天、55天、74天、233天患者外周血DNA和术后140天、183天、235天骨髓细胞DNA经PCRSTR检测为供者独立植入;(4)患儿术后60天取外周血做基因分析,显示19号缺失的外显子得到完全纠正,患儿转变为正常基因型;(5)患儿在移植后75天的肌肉活检可见新生肌管形成,抗肌萎缩蛋白免疫组化呈弱阳性,少数为强阳性反应,DNA分析:供者基因DNA占1%～13%;移植后126天抗肌萎缩蛋白免疫组化检测显示阳性的肌纤维明显增多,供者基因DNA上升至2.5%～25%;(6)患儿血清CK从移植治疗前的5735U/L降至274U/L;(7)术后100天体检发现患儿肌力略有改善,肢端温暖。结论异基因脐血干细胞移植治疗DMD,可在移植后短期内重建造血功能、血清CK显著下降、肌肉抗肌萎缩蛋白表达,患儿运动有所改善,提示造血干细胞移植将有益于DMD的治疗。     

脐带血间充质干细胞的研究进展

脐带血中存在着丰富的造血干细胞,在移植方面发挥重要作用,在脐血中是否还存在间充质干细胞却有争议,有的学者认为其中有间充质干细胞,且与骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)的形态、表面标志及分化潜能非常相似,有的学者认为含量较低,难以传代培养扩增,总结了近5年来国内外关于脐血间充质干细胞的研究情况,为脐血的充分利用提供更多的资料。     

人脐血树突状细胞分泌外来体的特性及其增强CTL杀伤活性的研究

目的探讨脐血树突状细胞(UBDC)及其分泌的亚细胞结构外来体(exosomes)的特性,以及他们对细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性的增强作用。方法分离脐血单个核细胞(UBMC),用rhSCF、rhGM-CSF及rhIL-4诱导12d,加入经反复冻融提取的肿瘤细胞膜抗原,继续培养2d。收集DC并从其培养上清中通过离心(1×105g)分离外来体。用流式细胞术、SDS-PAGE、透射电子显微镜(TEM)和MTT比色法,对DC和外来体的特性及其对CTL杀伤活性的增强作用进行分析。结果用3种细胞因子体外诱导UBMC12d,可使其扩增10倍,并出现DC典型的形态特征。负载肿瘤抗原后,细胞表面可高表达MHC-I、MHC-II、CD40、CD80、CD86、CD11c和CD54。利用超速离心法能从DC培养上清中分离出外来体。混合淋巴细胞反应(MLR)和CTL杀伤活性的分析表明,脐血DC分泌的外来体能有效地刺激T细胞增殖并增强CTL的杀伤活性。结论由UBMC可诱导出大量的DC并分泌外来体。后者可有效地向CTL细胞递呈肿瘤抗原使之活化并增强其杀伤活性。     

人脐带间充质干细胞抑制同种异体脐血淋巴细胞的转化

目的探讨人脐带间充质干细胞(UCMSCs)的生物学特性及其对同种异体脐血淋巴细胞转化的影响。方法从人脐带中分离、培养得到间充质干细胞,通过免疫细胞化学染色等方法对其进行表型鉴定;同时采用MTT法检测UCMSCs对同种异体脐血淋巴细胞转化的影响,以验证UCMSCs在免疫调控方面的作用。结果成功培养出UCMSCs,培养至第3代的UBMSCs形态为均一梭形,细胞倍增时间为51.6 h。细胞表面表达MSCs相关抗原CD29,但不表达造血细胞相关抗原CD34,细胞化学染色显示PAS(+)、NBE(+)、POX(-),表明此种自脐带中分离得到并诱导扩增的成纤维样细胞为间充质干细胞;UCMSCs对PHA刺激的脐血淋巴细胞,增殖反应具有免疫抑制作用,且该作用与UCMSCs接种数量有关,当接种量为2 000个/孔时,抑制率高达60.8%。结论 UCMSCs具有免疫抑制作用,能抑制同种异体脐血淋巴细胞的转化,且此种抑制作用与接种的脐血淋巴细胞数量有关。     

脐血来源间充质干细胞可抑制异体T细胞的反应

目的 研究脐血间充质干细胞(HUCB-MSCs)对异体T细胞的抑制作用.方法 体外培养HUCB-MSCs,流式细胞术测表面标记;取正常人外周血,免疫磁珠分离CＤ３+T细胞,将分离的CD3+T与HUCB-MSCs 1:1混合培养5d,PHA刺激或不刺激,采用3H-TdR掺入法观察T细胞增殖,ELISA方法检测细胞因子,流...