杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5'上游序列的克隆与序列分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5'上游序列,并对其进行测序和序列分析.方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamH I、EcoR I、Hind Ⅲ、Pst I、Sal Ⅰ及Xbal Ⅰ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL.采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5'上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序.结果:从HL里扩出约1 200 bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序.该序列的3'端与已知NR基因cDNA 5'端序列完全一致.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV 等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列.结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA 周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5'上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列.     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因跨内含子DNA序列的克隆和鉴定

目的：克隆杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶(DCA1)和碳酸酐酶(CA1)基因跨内含子基因组DNA序列。方法：利用跨内含子PCR方法,从杜氏盐藻基因组中克隆DCA1和CA1基因跨内含子基因组DNA序列。结果：DCA1基因跨内含子长度为4407bp,含7个外显子,由此推定的氨基酸序列长度为555个氨基酸残基;而CA1基因跨内含子长度为4473bp,含8个外显子,其推定的氨基酸序列长度为498个氨基酸残基。这2种基因的所有外显子一内含子交接点处序列都遵守GT—AG规律。结论：首次克隆得到了杜氏盐藻DCA1和CA1基因跨内含子DNA序列。     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列驱动bar基因的表达

目的:探讨杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5'上游序列(Pnr)是否可以驱动外源基因在杜氏盐藻中的表达.方法:利用改进的重叠区扩增基因拼接法(SOEing),将杜氏盐藻NR基因5'上游序列(Pnr)与除草剂抗性基因bar融合.同时将NR基因3'端序列(Tnr)与克隆载体pEGM-7zf连接,构成中间载体pEGM-7zf-Tnr.最后将融合片段Pnr-Tnr与中间载体连接,构建含Pnr-bar-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NBT.电击法转化杜氏盐藻,通过草丁膦培养筛选转化藻株后对其进行分析.结果:转化藻株总RNA的RT-PCR结果扩增出与bar基因序列完全一致的目的片段.结论:杜氏盐藻NR基因Pnr能够驱动外源基因bar的转录.     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其进行测序和序列分析。方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamHI、EcoRI、HindⅢ、PstI、SalⅠ及XbalⅠ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL。采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5′上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序。结果:从HL里扩出约1200bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序。该序列的3′端与已知NR基因cDNA5′端序列完全一致。该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列。结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5′上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列。     

杜氏盐藻RbcS基因cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆杜氏盐藻-，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(RuBisCO)小亚基RbcS cDNA片段。方法：根据莱茵衣藻、团藻、玉米等真核生物的RuBisCO小亚基RbcS氨基酸的高度保守序列ETRSYLPP和MNKLPMFG，设计一对简并引物，采用RT—PCR方法及该简并引物克隆杜氏盐藻RbcS cDNA。PCR产物经T—A克隆与T-vector相连，转化大肠杆菌JM109，随机挑取数个菌落，筛选鉴定，对阳性克隆进行测序分析。将测序结果推导成氦基酸序列进行同源性比较。结果：得到的cDNA长度为209bp，编码69个氨基酸。推导的氦基酸序列与团藻、Chloromonas sp．ANT3、衣藻、伞藻、菠菜、玉米的Rbc S相比较，同源性分刖为85％、84％、82％、76％、70％、69％。结论：所克隆的序列为杜氏盐藻RbcS DNA片段。     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶5'端cDNA片段的快速扩增

目的：根据已扩增的杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA的部分序列，利用5’RACE的方法扩增其5’上游未知片段。方法：根据盐藻硝酸盐还原酶cDNA已知的部分序列，设计一条磷酸化反转录引物、2对特异性反向PCR引物。提取盐藻细胞mRNA，利用5’RACE的方法反转录成cDNA，然后利用PCR方法扩增5’上游序列，产物与T载体连接后转化至大肠杆菌JM109中，经筛选后测序，将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果：在盐藻中所获得的cDNA片段，核苷酸长度为431bp，编码143个氨基酸。推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较：Dunaliella tertioleclta为83％，衣藻为68％，团藻为66％，小球藻为64％。结论：所克隆的序列为杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。     

杜氏盐藻叶绿体16S rRNA基因的克隆

目的：克隆和鉴定杜氏盐藻叶绿体16Sr RNA基因。方法：根据衣藻、小球藻等绿藻叶绿体16Sr RNA基因序列,利用软件分析找出其高度保守区,据此设计引物,PCR扩增杜氏盐藻叶绿体16Sr RNA序列,并与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivide进行同源性比较。结果：序列分析表明所克隆的序列1110bp与莱茵衣藻、普通小球藻、绿肾藻和原始绿藻Mesostigma Vivjde 4种绿藻的序列同源性分别为85．0％、79.9％、81．3％和81．6％。结论：本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻的叶绿体16S rRNA基因。     

杜氏盐藻FLA8基因全长的克隆及鉴定

目的:获得FLA8基因cDNA序列.方法:根据衣藻、小球藻等驱动蛋白-2亚基的氨基酸高度保守序列GYNGTIF、NEDPKDA设计一对简并引物,采用RT-PCR及3'RACE和5'RACE的方法扩增杜氏盐藻FLA8基因的全长.结果:克隆得到的杜氏盐藻FLA8基因cDNA全长序列为2 612 bp,序列分析显示其包括90...     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段的克隆与分析

目的：获得杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。方法：根据Dunaliella tertiolecta、衣藻、团藻等生物硝酸盐还原酶(nitrate reductase,NR)高度保守序列EGWWFKP、WNVMGMM设计一对简并引物,以含硝酸盐培养基培养的的盐藻cDNA为模板,进行PCR扩增,产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列,并与Dunaliella tertiolecta、团藻、衣藻、小球藻等进行同源性分析。结果：在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为381bp,编码127个氨基酸。推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较：Dunaliellal teriolecta为88．2％同源,团藻为78％,衣藻为67％,小球藻为59％。结论：所克隆的序列为盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。     

杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析

目的:克隆杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白片段.方法:根据多种生物MAR结合蛋白氨基酸的高度保守序列EWYGWHF和KYGLIYQ,设计一对简并引物,以杜氏盐藻的cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR产物与T载体相连,转化大肠杆菌JM109后,筛选鉴定,对阳性菌落进行测序分析.将测序结果推导成氨基酸序列,与GenBank上其他物种MAR结合蛋白序列进行同源性分析.结果:在杜氏盐藻中得到的cDNA片段,核苷酸长度为474 bp,编码158个氨基酸(GenBank收录号为DQ124215).推导的氨基酸序列与稻、莲、拟南芥、豌豆、烟草、酵母、果蝇和蟾的MAR结合蛋白相比较,同源性分别为74%、73%、73%、73%、71%、70%、68%和67%.结论:所克隆的序列可能为杜氏盐藻MAR结合蛋白片段.     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶缺陷型突变株的筛选与鉴定

目的:制备杜氏盐藻氯酸盐抗性突变株库并从中筛选出硝酸盐还原酶(NR)缺陷型突变株,测定其NRcDNA全长序列,分析其突变位点.方法:①用乙基亚硝基脲(ENU)对杜氏盐藻进行诱变,得到突变株库.然后用氯酸盐抗性筛选方法获得氯酸盐抗性藻株,经复筛和不同氮源生长试验,获得了氯酸盐抗性突变株库.再用96孔板法进行单藻培养,获得氯酸盐抗性突变株单藻群.用磺胺比色法测定各个单藻群的NR活性,挑选出NR活性完全丧失的突变株.然后用氯酸盐抗性实验和不同氮源生长实验验证其NR突变的稳定性.②根据已知的盐藻NR全长序列,设计3对PCR引物,提取突变株盐藻细胞mRNA,反转录成cDNA,分3段扩增其NR cDNA的全长序列,产物与T载体连接后转化至大肠杆菌JM109中,经筛选后测序,测序结果与野生型盐藻NR eDNA序列比较,分析其突变位点.结果:序列分析表明,3株突变株共有11处相同的突变,其中的3处点突变引起了氨基酸性质的改变.它们均在近3'端有一段相同的移码突变,造成19个氨基酸的完全改变.此外,2株还分别由于在1 235和1 639的位点突变而产生了一个终止密码子.结论:筛选出了3株杜氏盐藻NR完全缺陷型突变株.     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶缺陷型突变藻株的分离和初步鉴定

目的：分离制备杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)缺陷型突变藻株并进行初步鉴定。方法：①杜氏盐藻经乙基亚硝基脲(ENU)诱变后，利用氯酸盐抗性筛选方法获得氯酸盐抗性藻株，经复筛和不同氮源生长实验，获得NR缺陷型突变藻株。②用磺胺比色法测定酶反应生成的亚硝酸盐(NO2^-)的浓度，从而计算出盐藻NR活性。比较突变藻株与野生型杜氏盐藻NR活性，作出初步鉴定。结果与结论：共获得30株NR缺陷型突变藻株，共有6株NR活性显著降低。杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株成功建立。     

杜氏盐藻核基质的制备

目的：制备盐藻核基质,进而分离核基质结合区(matrix attachment regions)。方法：采用体积分数0．5％ TritonX—100破碎细胞,体积分数15％Percoll分离盐藻细胞核,二碘水杨酸锂(1ithium diiodosalicylate,LIS)抽提核蛋白,SDS—PAGE电泳分析蛋白质成分。结果：分离出了高纯度的盐藻细胞核,电泳分析表明绝大部分核蛋白已被去除。结论：体积分数0．5％TritonX—100能有效破碎盐藻细胞,体积分数15％Percoll可分离高纯度的盐藻细胞核,25mmol／L LIS抽提可除去盐藻绝大部分核蛋白获得核基质。