阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义核酸在K562细胞的摄入和胞内分布的影响

目的探讨阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义寡核苷酸(反义核酸)细胞摄入和胞内分布的影响. 方法采用阳离子脂质体介导WT1反义核酸转染K562细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,RT-PCR检测处理前后WT1 mRNA表达水平. 结果 (1)脂质体提高K562细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达70.9%,平均荧光强度提高6倍以上;脂质体介导转染反义核酸时其细胞浆中类核内体或溶酶体中的点状结构较非脂质体处理时大,胞核内有明显的荧光物质分布;(2)脂质体介导WT1反义核酸可下调WT1 mRNA水平. 结论阳离子脂质体可提高反义核酸的细胞摄入并改变其胞内分布,这可能是它增强反义核酸生物活性的机制.     

阳离子脂质体Lipofectin^TM对WT1反义酸在K562细胞的摄 …

目的 探讨阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ＾ＴＭ对ＷＴ１反义寡核苷酸（反义核酸）细胞摄入胞内分布的影响。方法 采用阳离子脂质介导ＷＴ１反义核酸转染Ｋ５６２细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,ＲＴ－ＰＣＲ检测处理前后ＷＴ１ｍＲＮＡ表达水平。结果 （１）脂质体提高Ｋ５６２细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达７０．９％,平均荧光强度提高６倍以上;脂质体介导转染反义核酸对其     

阳离子脂质体增加造血系统恶性肿瘤细胞株对寡核苷酸G3139的摄入

目的观察阳离子脂质体DOSPER介导或Bcl-2反义寡核苷酸G3139直接作用时,造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入,为阳离子脂质体和反义寡核苷酸的进一步应用提供依据.方法利用异硫氰酸荧光素标记的G3139,流式细胞仪(FCM)测定造血系统恶性肿瘤细胞株HL60、K562、U937、CA46和CEM细胞内的平均荧光强度.结果 G3139直接作用于细胞时,细胞内荧光强度U937>HL60>CA46>K562>CEM(P<0.05);DOSPER介导转染时,各细胞内的荧光强度均显著高于直接转染时(P<0.01),而且当DOSPER/G3139(μg/μg)为2～3∶1时,转染效率最佳,但此时各细胞间细胞内平均平均荧光强度无明显的差别(P>0.05).结论不同造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入不同,阳离子脂质体DOSPER可普遍提高细胞对G3139的摄入.     

Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响。方法：本实验分6组，分别以脂质体介导反义寡核苷酸、无义寡核苷酸及RPMI 1640培养液作为空白的对照组，转染人乳腺癌MCF-7细胞系，采用Realtime RT-PCR，Western blot方法检测各组MCF-7细胞Survivin蛋白及mRNA的表达情况，测定转染后细胞贴壁率变化，研究Survivin反义寡核苷酸对MCF-7细胞的生长抑制作用。结果：脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染人乳腺癌MCF-7细胞后，细胞内Survivin蛋白及mRNA表达显著降低，通过Realtime RT-PCR检测MCF-7细胞经作用后其Survivin mRNA起始拷贝数明显下降；同时细胞贴壁率降低达32．96％，细胞生长抑制率最高达73．62％，ASOND／LiP组与NODN／LiP组和LiP组差异有显著性（P＜0．05）。结论：脂质体介导转染的反义寡核苷酸可在Survivin蛋白及mRNA水平有效地降低乳腺癌MCF-7细胞内Survivin的表达，并能够有效抑制乳腺癌细胞的增殖活性，提示Survivin靶向治疗可能成为乳腺癌综合治疗的一种重要方法。     

5′-荧光素标记的RelA反义脱氧寡核苷酸在人白血病细胞HL-6O中的分布及稳定性

目的　比较修饰型及未修饰型 Rel A反义脱氧寡核苷酸 ( AS- ODN)在人白血病细胞 HL- 60中的分布及稳定性。方法　将荧光素 ( FAM)标记的硫代磷酸酯修饰型及未修饰型 AS- ODN经脂质体介导或直接转染人 HL- 60细胞 ,应用荧光显微镜及流式细胞仪观察细胞内荧光的时相分布。结果　发现 1μm ol/ L 修饰型 AS- ODN进入细胞后 ,细胞内荧光强度 6h达到高峰。在有脂质体存在时 ,细胞内荧光明显增强 ,12 h后荧光减弱并逐渐消失 ;而 AS- ODN直接转染细胞 ,细胞内特别是核内荧光强度明显比脂质体组弱。未修饰型 AS- ODN直接或经脂质体介导转染 ,细胞内荧光强度均很弱 ,滞留时间不超过 4h。结论　脂质体可以提高细胞对 AS- ODN的摄取及核聚积 ,而硫代磷酸酯修饰型 AS-ODN具有更好的稳定性     

脂质体介导Bcl-2反义脱氧寡核苷酸对人卵巢癌细胞作用的研究

目的 探讨bcl-2反义脱氧寡核苷酸体外转染卵巢癌细胞后,对癌细胞bcl-2基因表达调控作用、诱导其凋亡的作用以及对顺铂敏感性的影响.方法 体外培养顺铂耐药的人卵巢上皮性癌细胞系CAOV3,以阳离子脂质体为载体,将bcl-2反义脱氧寡核苷酸片断作用于CAOV3细胞.应用逆转录聚合酶链反应(BT-PCR)技术检测bcl-2基因的表达;流式细胞仪(FACS)检测转染后CAOV3细胞调亡的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验检测转染后CAOV3细胞对顺铂敏感性的影响.结果 脂质体介导的bcl-2反义脱氧寡核苷酸作用于CAOV3细胞后,bcl-2基因mRNA 表达水平显著低于对照组(P<0.01),并可诱导卵巢癌细胞凋亡,增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性.结论 脂质体介导的bcl-2反义脱氧寡核苷酸作用于CAOV3细胞,可下调bcl-2基因的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡,并增强CAOV3细胞对顺铂的敏感性.     

5‘—荧光素标记的ReLA反义脱氧寡核苷酸在人白血病细胞HL—60中的分布及稳定性

目的 比较修饰型及未修饰型ReLA反义脱氧寡核苷酸（AS-ODN）在人白血病细胞HL-60中的分布及稳定性。方法 将荧光素（FAM）标记的硫代磷酸酯修饰及未修饰型AS-ODN经脂质体介异工直接转染入HL-60细胞，应用荧光显微镜及流式细胞仪观察细胞内荧光的时相分布。结果 发现1μmol/L修饰型AS-ODN进入细胞后，细胞内荧光强度6h达到高峰。在有脂质体存在时，细胞内荧光明显增强，12h后荧光减弱并逐渐消失。而AS-ODN直接转染细胞，细胞内特别是核内荧光强度明显比脂质体组弱。未修饰型AS-ODN直接或经脂质体介导转染，细胞内荧光强度均很弱，滞留时间不超过4h。结论 脂质体可以提高细胞对AS-ODN的摄取及核聚积，而硫代磷酸酯修饰型AS-ODN具有更好的稳定性。     

量子点标记与绿色荧光素标记对survivin反义寡核苷酸生物功能影响的比较

目的 观察量子点和绿色荧光素分别标记的survivin反义寡核苷酸(ASODN)转染人乳腺癌细胞株MCF-7后,在标记存在时间、survivin的表达及细胞增殖、凋亡方面有无差异.方法 将量子点和绿色荧光素分别标记的survivin ASODN通过脂质体转染MCF-7,MTT法检测细胞生长抑制率,RT-PCR检测survivin mRNA,Western blot检测survivin蛋白表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率变化,荧光倒置显微镜观察细胞内荧光物质分布.结果 量子点与绿色荧光素分别标记的survivin ASODN作用MCF-7后,survivin mRNA和survivin蛋白表达均下降,但两者间无显著差异(P＞0.05).两者细胞生长抑制率、凋亡率间无显著差异(P＞0.05).转染后4 d绿色荧光素标记组细胞内荧光消失,而量子点标记组荧光1周仍存在.结论 量子点标记survivin ASODN与绿色荧光素标记比较,对survivin的表达及细胞增殖、凋亡方面无差异,而标记更稳定,存在时间更长.     

半乳糖配体介导C-myc反义锁核酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨针对增殖相关基因(C-myc)第二外显子翻译起始区的反义锁核酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计合成能特异性封闭C-myc基因mRNA第二外显子翻译起始区的反义寡核苷酸、硫代寡核苷酸和锁核酸,分别以阳离子半乳糖配体介导转染Hep G2细胞,采用RT-PCR法检测细胞内C-myc的mRNA表达变化;Western blot法检测细胞内C-myc的蛋白表达变化;流式细胞技术检测细胞凋亡情况;MTT法检测反义锁核酸的细胞毒性作用。结果转染第5 d后,反义锁核酸组C-myc mRNA相对表达量为(0.335±0.016),明显低于对照组(1.014±0.022),差异有统计学意义(P=0.015);C-myc蛋白相对表达量为(0.448±0.037),也明显低于对照组(1.00±0.00),差异有统计学意义(P=0.008);细胞凋亡比例为(32±6)%,显著高于对照组(0),差异有统计学意义(P=0.032)。结论针对C-myc第二外显子翻译起始区的反义锁核酸能有效抑制肝癌细胞增殖和促进细胞凋亡。     

bcl—2 mRNA反义寡核苷酸对胃癌SGC—7901细胞端粒酶活性的影响

目的 探讨bcl-2反义寡核苷酸（antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,ASODN)对胃癌SGC－7901细胞端粒酶活性的影响。方法 应用脂质体瞬时转染法介导bcl-2反义寡核苷酸,处理人胃癌细胞系SGC－7901后,分别采用Northern blot、Western blot检测bcl-2 mRNA、蛋白表达,用端粒微孔板杂交法检测端粒酶活性。结果 bcl-2 ASODN处理的胃癌SGC－7901细胞端粒酶活性明显受到抑制,并与ASODN的浓度和处理时间有关。结论 bcl-2反义寡核苷酸可抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

脂质体介导gp130反义寡核苷酸对PC-3细胞增殖影响的研究

目的:研究脂质体介导gp130反义寡核苷酸对人雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)细胞PC-3体外增殖活性的影响。方法:采用细胞计数及MTT比色法评价反义寡核苷酸对PC-3细胞体外增殖的影响,应用荧光免疫细胞化学法检测gp130基因的蛋白表达情况,流式细胞计数评价其对细胞周期的影响。结果:脂质体介导gp130反义寡核苷酸组与正义寡核苷酸组及对照组比较,PC-3细胞增殖活性受到明显抑制。转染48h后,gp130蛋白表达完全受到抑制,细胞周期明显阻滞于G0/G1期,细胞增殖抑制率为53.7%,细胞凋亡率高达51.28%。结论:脂质体介导gp130反义寡核苷酸可抑制人AIPC细胞PC-3体外增殖活性。应用反义技术为AIPC的基因治疗提供了新的思路和探索。     

反义肽核酸阻断人神经母细胞瘤多药耐药相关蛋白P-糖蛋白的表达

目的探讨反义肽核酸(PNA)的细胞转染方法及其对体外培养的神经母细胞瘤多药耐药(MDR)相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法以人MDR-1基因mRNA为靶点设计合成两反义PNA序列,利用PNA-DNA杂交,阳离子脂质体介导转染神经母细胞瘤耐药细胞株SK-N-SH.采用流式细胞术、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和高效液相色谱等方法分别检测反义PNA的转染效率,转染前后细胞P-gp、MDR-1基因mRNA的表达及细胞内阿霉素(ADM)浓度.结果荧光标记的反义PNA转染肿瘤细胞后,细胞平均荧光强度显著增强,呈浓度依赖性.两反义PNA均使SK-N-SH细胞P-gp表达明显降低,MDR-1 mRNA表达轻度降低,细胞内ADM聚集浓度明显增加.结论PNA-DNA杂交阳离子脂质体转染法可有效增加细胞对PNA的摄取,特异序列的反义PNA可在一定程度上阻断神经母细胞瘤MDR相关蛋白P-gp的表达.     

脂质体介导的99mTc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究

目的探讨脂质体介导的99mTc标记癌基因c-myc mRNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.方法合成15 bp的癌基因c-myc mRNA的反义、正义及无义寡核苷酸,用99mTc标记后(简称99mTc-DNA),一部分用脂质体包裹,以不同放射性强度的99mTc-DNA及脂质体包裹的99mTc-DNA转染细胞,于转染后不同时间测定细胞摄取率,在转染后18 h测定细胞返流比率,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况,用流式细胞术测定癌蛋白的表达.结果在1～5 h内,细胞的摄取率随时间的延长而增加,脂质体包裹的99mTc-DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的99mTc-DNA.四唑盐比色实验,随着脂质体介导的99mTc-反义DNA剂量的增加,细胞数量逐渐减少,而正义、无义寡聚核苷酸组,细胞数量则没有减少的趋势.细胞的返流比率,反义、正义、无义寡核苷酸分别为39.51%、44.12%、63.92%.测定癌蛋白的荧光强度,反义寡核苷酸组2.9860±0.3733、正义寡核苷酸组4.2600±0.2218、无义寡核苷酸组5.2620±0.8562,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组.结论脂质体介导的99mTc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.     

HL-60细胞端粒酶活性的调控因素

目的 探讨HL－60细胞端粒酶活性的调控因素。方法 用脂质体介导法将LXSN－wt-p53逆转录病毒质粒导入人髓性白血病细胞系HL-60中,用c-myc,bcl-2基因反义脱氧寡核苷酸作用HL－60细胞,用全反式维甲酸（ATRA）诱导HL－60细胞分化后,采用TRAP－ELISA－PAGE法测定端粒酶活性,观察野生型p53基因、c-myc,bcl-2,全反式维甲酸（ATRA）对HL－60细胞端粒酶活性的影响。结果 野生型p53基因不影响HL－60细胞的端粒酶活性;bcl-2及c-myc反义寡核苷酸可下调HL－60细胞的端粒酶活性;ATRA在诱导HL－60细胞分化的同时,可使HL－60细胞的端粒酶活性降低。结论 HL－60细胞端粒酶活性受到c-myc,bcl-2,全反式维甲酸（ATRA）的调节。     

阳离子脂质体增加造血系统恶性肿瘤细胞株对苷酸G3139？…

目的 观察阳主子脂质体ＤＯＳＰＥＲ介导或Ｂｃｌ－２反义寡核苷酸Ｇ３１３９直接作用时,血系统恶性肿瘤细胞株对Ｇ３１３９的摄入,为阳离子腊质体的反义寡核苷权的进一步应用提供依据。方法 利用异硫氰酸荧光素标记的Ｇ３１３９,流式细胞仪（ＦＣＭ）测定造血系统恶性肿瘤细胞株ＨＬ６０、Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＣＡ４６和ＣＥＭ细胞内的平均荧光强度。结果 Ｇ３１３９直接作用于细胞时,细胞内荧光强度Ｕ９３７〉ＨＬ６０〉Ｃ     

血管内皮生长因子反义核酸与高三尖杉酯碱联用对白血病细胞的增敏效应

目的　探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸与高三尖杉酯碱(homoharringtonin ,H)联用,对HL6 0和K5 6 2细胞药物敏感性的影响。方法　采用实验筛选所得的最优反义核酸(A7) ,2 0mer,全硫代修饰;以脂质体介导进行转染2 4h开始加入高三尖杉酯碱,继续培养4 8h ,共72h ,用MTT法计算细胞生长活力,求IC50 值,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的浓度,用Giemsa染色观察细胞凋亡形态学改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数。结果　VEGF反义核酸可显著降低对HL6 0和K5 6 2细胞H的IC50 值,下调VEGF蛋白的表达,增加H诱导的HL6 0和K5 6 2细胞凋亡。结论　VEGF反义核酸与H联用对HL6 0和K5 6 2细胞具有增敏效应,VEGF反义核酸可增强H诱导的凋亡作用;同时反证内源VEGF蛋白具有降低HL6 0和K5 6 2细胞对H的敏感性。     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响

目的：探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响．．方法：采用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901细胞,以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后乙酰肝素酶mRNA、Fas mRNA和Bcl-2 mRNA表达的变化,采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果：脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸后,SGC7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA和Bcl-2 mRNA表达下降,FasmRNA表达上升,凋亡细胞比率由转染前的4．04％增加至转染后的16．00％。结论：转染后的乙酰肝素酶反义寡核苷酸可有效地诱导胃癌细胞发生凋亡。     

反义bcl-2 和反义survivin对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生长的作用

目的研究反义bcl-2和反义survivin(svv)对人神经母细胞瘤(NB)细胞系SK-N-MC细胞生长的作用.方法利用基因重组技术,采用定向克隆构建在真核细胞中能够稳定表达反义bcl-2 或反义svv 的逆转录病毒载体PBabe puro-Asbcl-2和PBabe puro-Assvv,并分别经脂质体LipofectamineTM介导转染人NB细胞株SK-N-MC细胞,经嘌呤霉素(2.0 μg/ml)筛选得到抗性克隆,同时以空载体Pbabe puro 转染SK-N-MC作为对照;以免疫组化和Western 印迹分析反义bcl-2、反义svv对细胞内源性Bcl-2、SVV蛋白质的表达抑制作用,应用MTT法研究细胞(5×103 /孔)的生长和增殖情况,并接种于裸鼠(3只/组),观察107 个细胞在6周时的成瘤情况,以研究反义bcl-2、反义svv对SK-N-MC细胞生长的作用.结果反义bcl-2转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Asbcl-2中的Bcl-2表达明显降低,反义svv转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Assvv中的SVV表达也明显降低;且这两种细胞均生长缓慢, 裸鼠移植瘤体积均明显小于SK-N-MC原始细胞或转染空载体的细胞接种形成的移植瘤.结论稳定表达的反义bcl-2、反义svv均能够有效抑制SK-N-MC细胞内源性相应蛋白质Bcl-2、SVV的表达,提示这两个基因在NB细胞的肿瘤形成中均具有一定的作用.     

反义EGFR寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ促VSMC增殖的影响

目的探讨脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸基因转染对血管紧张素Ⅱ促大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．方法用反义表皮生长因子受体寡核苷酸脂质体复合物转染Sprague—Dawley大鼠血管平滑肌细胞，通过RT—PCR、Western—Bloting分别检测转染后EGFRmRNA及蛋白的表达情况，用^3H—Tdr掺入率实验检测经反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染再用血管紧张素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞的增殖情况，结果反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染大鼠血管平滑肌细胞后，EGFRmRNA及蛋白的表达较正义组及对照组明显减少（P〈0．05）；用血管紧张素Ⅱ刺激后，反义组细胞的^3H—Tdr掺入较正义组及对照组明显降低，经方差分析两者有显著差异（P〈0．05），结论脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染减弱了血管紧张素Ⅱ的促血管平滑肌细胞增殖效应，证明了表皮生长因子受体在血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖中起重要作用．