OPN基因RNAi对U87胶质瘤细胞生长和侵袭的抑制作用

目的:探讨靶向骨桥蛋白基因(osteopontin,OPN)的siRNA片段对U87胶质瘤细胞生长和侵袭力的影响及其可能的作用机制.方法:根据OPN基因序列设计并合成的siRNA片段(OPN-RNAi)转染U87细胞.MTT法检测U87细胞增殖;Western blotting检测OPN及基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)2、MMP9蛋白的表达;Transwell小室侵袭实验检测U87细胞的侵袭力;明胶酶谱法检测MMP2、MMP9的酶活性.结果:体外合成的OPN-RNAi能有效抑制U87细胞中OPN蛋白的表达(P＜0.05),OPN-RNAi同时还能下调MMP2、MMP9蛋白的表达(P＜0.05)及其酶活性(P＜0.01),并抑制U87细胞的增殖(P＜0.05)和侵袭力(P＜0.05).结论:OPN-RNAi能够有效抑制U87胶质瘤细胞的生长及其侵袭力,其机制与其抑制OPN下游基因MMP2、MMP9的表达和酶活性有关.     

miR-126下调MMP-2抑制人脑胶质瘤细胞侵袭

目的初步探讨miR-126抑制人胶质瘤细胞侵袭的可能机制。方法化学合成miR-126,脂质体转染人脑胶质瘤U87细胞,应用RT-PCR、Western blot检测MMP-2基因和蛋白的表达情况,并应用Transwell小室检测转染前后细胞侵袭力的变化。结果miR-126上调后U87细胞的MMP-2基因和蛋白表达降低,并且细胞侵袭力明显降低。结论化学合成的miR-126在抑制人胶质瘤细胞侵袭过程中发挥重要作用,可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

辛伐他汀对胶质瘤U251细胞侵袭及其MMP2表达的影响

目的:研究辛伐他汀(simvastatin,SMV)在体外对胶质瘤U251细胞侵袭迁移及其金属基质蛋白酶2(MMP2)的表达影响。方法:采用MTT法观察辛伐他汀对U251细胞黏附能力的影响;Transwell侵袭小室测定法检测辛伐他汀对U251细胞侵袭能力的影响;明胶酶谱实验和RT-PCR方法观察辛伐他汀对金属基质蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,MMP2)在U251细胞中表达的影响。结果:辛伐他汀能够降低U251细胞黏附,Transwell实验表明药物处理组穿膜细胞数明显低于对照组(P<0.01),明胶酶谱与RT-PCR结果表明辛伐他汀不但降低MMP2前体蛋白的表达,而且影响其mRNA的表达。结论:辛伐他汀能够有效抑制胶质瘤U251细胞的侵袭迁移,其作用机制可能与辛伐他汀下调胶质瘤U251细胞中MMP2的表达有关。     

OPN基因RNAi对U87胶质瘤细胞生长和侵袭的抑制作用

目的：探讨靶向骨桥蛋白基因(osteopontin,OPN)的siRNA片段对U87胶质瘤细胞生长和侵袭力的影响及其可能的作用机制。方法:根据OPN基因序列设计并合成的siRNA片段（OPNRNAi）转染U87细胞。MTT法检测U87细胞增殖;Western blotting检测OPN及基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP）2、MMP9蛋白的表达;Transwell小室侵袭实验检测U87细胞的侵袭力;明胶酶谱法检测MMP2、MMP9的酶活性。结果：体外合成的OPNRNAi能有效抑制U87细胞中OPN蛋白的表达（P<0.05）,OPNRNAi同时还能下调MMP2、MMP9蛋白的表达（P<0.05）及其酶活性（P<0.01）,并抑制U87细胞的增殖（P<0.05）和侵袭力（P<0.05）。结论：OPNRNAi能够有效抑制U87胶质瘤细胞的生长及其侵袭力,其机制与其抑制OPN下游基因MMP2、MMP9的表达和酶活性有关。     

VHL基因对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响

  目的   研究VHL基因对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响   方法   使用VHL表达质粒转染胶质瘤细胞,采用RT-PCR检测VHL mRNA表达,Western blot检测VHL、MMP-2、MMP-9蛋白表达,应用Transwell体外侵袭实验、划痕实验检测上调VHL基因后对U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响。使用VHL表达质粒处理后的U251细胞建立裸鼠颅内模型,利用免疫组织化学染色法对颅内模型组织切片中VHL、MMP-2、MMP-9蛋白表达进行检测。   结果   VHL表达质粒转染胶质瘤细胞后VHL mRNA、VHL蛋白表达增高,MMP-2、MMP-9蛋白表达下降;并抑制U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力。对染色后的组织切片进行分析,VHL表达质粒处理组中VHL的表达较对照组明显升高,MMP-2、MMP-9蛋白较对照组表达减少。   结论   VHL基因能够有效抑制U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力,VHL基因可成为治疗胶质瘤的一个有效靶点。      

不同级别人胶质瘤组织中miR-10b表达变化的研究

背景与目的:人miR-10b编码基因位于染色体2q31HOXD8基因之间,有研究显示其特异性地高表达于多种肿瘤中,并与肿瘤的侵袭、迁移和远距离转移有关。本研究对不同级别胶质瘤组织及非肿瘤对照脑组织中miR-10b的表达水平进行检测和比较。方法:采用组织微阵列及锁定寡核苷酸原位杂交技术检测56例不同级别胶质瘤及10例非肿瘤对照脑组织中miR-10b的表达水平。结果:对照脑组织及WHOⅠ~Ⅱ级、Ⅲ级及Ⅳ级胶质瘤组织中miR-10b阳性标记指数(LI%)分别为36.87±20.63、18.86±14.04、12.13±11.56及4.93±6.45,4组间差异均有显著性(P<0.05~0.001),miR-10b LI%与肿瘤的良恶性分级呈显著负相关(rs=-0.61,P<0.001)。结论:miR-10b的表达水平与胶质瘤病理分级呈负相关。     

基质金属蛋白酶及其抑制剂在边缘系统胶质瘤侵袭中的作用

 目的 探讨基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及其组织抑制因子(TIMP-2)在边缘系统胶质瘤侵袭中的作用。方法 利用免疫组织化学技术SP法检测MMP-2、MMP-9及TIMP-2在35例高、低级别胶质瘤和20例脑良性肿瘤(脑膜瘤)中的表达。结果 ①Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤MMP-2、MMP-9蛋白的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ级，Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤MMP-2、MMP-9蛋白的表达明显高于脑膜瘤，其两两之间比较具有显著性差异。②高级别胶质瘤组TIMP-2蛋白表达明显低于低级别组，低级别组TIMP-2蛋白表达明显低于脑膜瘤组，其两两之间比较具有显著性差异。③35例胶质瘤和20例脑膜瘤中MMP-2与MMP-9呈正相关(y=0．86，P<0．01)，MMP-2与TIMP-2呈负相关(γ=-0．65，P<0．01)，MMP-9与TIMP-2呈负相关(γ=-0．58，P<0．01)。结论 ①MMP-2、MMP-9蛋白的表达与胶质瘤的恶性程度有关，可能成为胶质瘤恶性程度、侵袭能力和预后的判断指标。②TIMP-2是MMP-2的抑制因子，两者之间失衡是促进胶质瘤侵袭的重要因素之一。     

二甲双胍对神经胶质瘤生长的抑制作用及其机制研究

目的:探讨二甲双胍对神经胶质瘤细胞生物学活性的影响及其作用机制。方法:以0、5、10、20mmol/L四种浓度的二甲双胍分别对人胶质细胞瘤细胞系U251和T98G进行体外干预,MTT法检测其对细胞增殖的影响;Transwell法检测其对细胞侵袭性的影响;Annexin V/双染法检测其对细胞凋亡的影响;Western blotting检测AMP活化蛋白(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路相关蛋白的表达水平。结果:二甲双胍可显著抑制神经胶质瘤细胞的增殖,促进细胞的凋亡,而对细胞的侵袭影响不大;Western blot结果表明二甲双胍可增强细胞内AMPK、p38 MAPK的磷酸化蛋白表达水平,同时特异性的p38 MAPK通路阻断剂可抑制二甲双胍的促细胞凋亡作用。结论:二甲双胍可能通过激活神经胶质瘤细胞内的AMPK信号传导通路促进肿瘤细胞的凋亡,以期对临床预防及治疗神经胶质瘤提供理论依据。     

miR-29a对胶质瘤细胞CDC42表达及迁移和侵袭的影响

  目的  探讨胶质瘤miR-29a与CDC42表达的相互关系及其对肿瘤细胞侵袭迁移的影响。  方法  采用组织微阵列及锁定寡核苷酸原位杂交技术, 检测60例不同级别胶质瘤及10例非肿瘤对照脑组织中miR-29a的表达水平, 采用qRT-PCR、Westernblot及Transwell培养, 分别检测U251及其稳定表达miR-29a和无义对照序列的亚细胞系(U251-miR-29a及U251-scr)miR-29a、CDC42 mRNA及蛋白的表达及其迁移和侵袭能力, 并分析其相互关系。  结果  各级别胶质瘤miR-29a表达水平均显著低于对照脑组织, 并随肿瘤级别升高而减少, 差异均有统计学意义(P < 0.01)。U251-miR-29a的miR-29a表达量明显高于U251和U251-scr(P < 0.001), 其CDC42 mRNA和蛋白表达量明显降低(P < 0.05);CDC42 mRNA与其蛋白表达量呈正相关(r=0.834, P < 0.01), 而与miR-29a表达量呈负相关(r=-0.979, P < 0.01)。U251-miR-29a的迁移和侵袭能力明显低于U251和U251-scr(P < 0.001), 并均与CDC42蛋白表达量呈正相关(r=0.828, P < 0.01)。  结论  miR-29a表达水平是评价胶质瘤良恶性的重要参考指标, 胶质瘤细胞miR-29a表达异常减少是CDC42上调及迁移侵袭能力增强的重要因素, 补充外源性miR-29a可抑制靶基因CDC42表达, 阻止其侵袭迁移, 提示恶性胶质瘤基因治疗中具有重要的潜在应用价值。      

人脑胶质瘤MMP2、MMP9和Ki-67的表达及其相关性的探讨

目的:探讨人脑胶质瘤基质金属蛋白酶MMP2、MMP9和Ki-67的表达及其相关性.方法:应用MMP2、MMP9表达水平代表胶质瘤的侵袭活性,应用Ki-67标记指数代表胶质瘤的增殖活性;用免疫组化方法观察了6例正常脑组织、50例胶质瘤标本和2例恶性胶质瘤体外细胞系的MMP2、MMP9和Ki-67表达,并分析其相关性.结果:在胶质瘤中MMP2、MMP9的阳性表达率和Ki-67 LI均随肿瘤恶性程度增加而增加并与胶质瘤分级呈正相关;相关分析发现,MMP2、MMP9和Ki-67LI的表达两两相关.结论:增殖和侵袭在恶性胶质瘤的分子生物学演进过程中相互协同、共同促进肿瘤细胞的恶性进展.     

miR-146b-5p inhibits glioma migration and invasion by targeting MMP16

miR-146b-5p is frequently down-regulated in solid tumours, including prostate cancer, pancreatic cancer, and glioblastoma. However, the tumour-suppressive effects of miR-146b-5p in malignant gliomas have not been investigated thoroughly. Here, we found that decreased miR-146b-5p expression was strongly correlated with chromosome 10q loss in gliomas, especially glioblastomas. The overexpression of miR-146b-5p in glioblastoma cell lines led to MMP16 mRNA silencing, MMP2 inactivation, and the inhibition of tumour cell migration and invasion. Our results suggest that the restoration of miR-146b-5p expression may be a feasible approach for inhibiting the migration and invasion of malignant gliomas.     

miR-146b-5p通过抑制ATR通路诱导肺癌A594细胞凋亡

目的:研究miR-146b-5p对ATR的靶向抑制、诱导A594细胞凋亡的作用.方法:CCK8实验、克隆形成实验检测对照组、miR-146b-5p类似物转染组和阴性转染组,观察A594细胞增殖和存活能力;TargetScan7.1与miRanda软件预测miR-146b-5p靶向ATR.实时定量PCR检测对照组、miR-146b-5p组和Negative mimics组ATR mRNA表达变化 设计ATR 3'UTR突变序列(ATR-3'UTR-mut)和荧光报告载体实验验证miR-146b-5p对ATR的靶向作用;Western Blot实验检测各组癌细胞中ATR通路蛋白ATR、Chk1、p53表达变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡.结果:CCK8实验和克隆形成实验结果:与对照组比较,miR-146b-5p组细胞数降低,克隆形成率从0.98±0.01降低到0.57±0.03,差异显著(P＜0.05);Negative mimics组细胞数和克隆形成率0.92±0.03均无显著差异(P＞0.05).实时定量PCR结果与对照组比较,miR-146b-5p组ATR mRNA表达从0.96±0.02降低到0.38±0.03,差异显著(P＜0.05);无义序列组ATR mR-NA表达为0.94±0.02,差异不显著(P＞0.05);荧光报告载体实验结果:ATR 3'UTR miR-146b-5p组ATR mRNA降低到0.36±0.03,差异显著(P＜ 0.05);ATR 3'UTR-mut miR-146b-5p组ATR mRNA表达量为0.96 ±0.02,差异不显著(P＞0.05).Western Blot结果显示miR-146b-5p组ATR、Chk1、p53蛋白表达降低.流式细胞仪结果显示miR-146b-5p组细胞凋亡率增加(26±2.18)％,差异显著(P＜0.05).结论:miR-146b-5p通过抑制ATR信号通路诱导肺癌A594细胞凋亡.     

miR-146b-5p mediates p16-dependent repression of IL-6 and suppresses paracrine procarcinogenic effects of breast stromal fibroblasts

Increasing evidence support the critical roles of active stromal fibroblasts in breast cancer development and spread. However, the mediators and the mechanisms of regulation are still not well defined. We have shown here that the tumor suppressor p16^INK4A protein inhibits the pro-carcinogenic effects of breast stromal fibroblasts through repressing the expression/secretion of IL-6. Indeed, p16^INK4A suppresses IL-6 at the mRNA and protein levels. This effect is mediated trough miR-146b-5p, which inhibits IL-6 expression through a specific sequence at the IL-6 3′UTR. In addition, we present clear evidence that miR-146b-5p inhibition is sufficient to transactivate breast stromal fibroblasts, which promote epithelial-to-mesenchymal-transition in breast cancer cells in a paracrine manner. By contrast, ectopic expression of miR-146b-5p in active fibroblasts abrogated their pro-carcinogenic effects. The physiological importance of miR-146b-5p inhibition was revealed by showing that the levels of pre-miR-146b-5p as well as its mature form are reduced in cancer-associated fibroblasts as compared with their normal adjacent counterparts from cancer-free tissues isolated from the same patients. Interestingly, treatment of active breast stromal fibroblasts with curcumin increased the level of the p16^INK4A coding CDKN2A mRNA and miR-146b-5p and suppressed IL-6, which confirms the repressive effect of these two tumor suppressor molecules on IL-6, and shows the possible “normalization” of cancer-related active fibroblasts. These results show that miR-146b-5p has non-cell-autonomous tumor suppressor function through inhibition of IL-6, suggesting that targeting this microRNA in breast stromal fibroblasts could be of great therapeutic value.     

miR-516b-5p靶向ATM调控鼻咽癌细胞HONE1DNA修复的机制研究

目的 探讨鼻咽癌细胞HONE1中抑制DNA修复的潜在机制.方法 使用ETP处理鼻咽癌细胞HONE1造成DNA损伤后,通过高通量测序检测鼻咽癌细胞HONE1中miRNA的表达谱.过表达差异miRNA后,通过基于I-PpoI的可诱导DSB系统检测DNA双链断裂处(DNA double-strand breaks,DSB)的...     

miR-146b-5p functions as a tumor suppressor by targeting TRAF6 and predicts the prognosis of human gliomas

Down-regulation of miR-146b-5p contributes to tumorigenesis in several human cancers. However, the relevance of miR-146b-5p to prognosis, proliferation and apoptosis in gliomas remains unknown. In the present study, we demonstrated that miR-146b-5p expression was inversely correlated with grades and Ki-67 index in 147 human glioma specimens, but positively correlated with patients’ survival. Furthermore, two distinct subgroups of patients with grade I-IV gliomas with different prognoses were identified according to miR-146b-5p expression in our specimens. Cox regression showed that miR-146b-5p was an independent predictor for patients’ survival. Overexpression of miR-146b-5p dramatically suppressed glioma cell proliferation and induced apoptosis. Mechanistically, we validated TRAF6 as a direct functional target of miR-146b-5p and found that miR-146b-5p overexpression significantly decreased phosphorylated TAK1 and IκBα, the pivotal downstream effectors of TRAF6. Moreover, TRAF6 expression was positively correlated with glioma grades and Ki-67 index but inversely correlated with miR-146b-5p expression and predicted poor prognosis of glioma patients. In glioblastoma cell lines, silencing of TRAF6 could mimic the anti-tumor effect of miR-146b-5p. Our findings identify miR-146b-5p as a tumor suppressor and novel prognostic biomarker of gliomas, and suggest miR-146b-5p and TRAF6 as potential therapeutic candidates for malignant gliomas.     

表皮生长因子受体反义RNA抑制胶质瘤细胞生长增殖的体外试验

目的：研究表皮生长因子受体基因对于胶质瘤发生发展的作用，探索以ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ进行反义基因治疗胶质瘤的可行性。方法：将含ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ的质粒通过脂质体介导转入Ｃ６恶性胶质瘤细胞，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交鉴定外源基因整合情况，ＭＴＴ法测定细胞存活率，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、细胞原位ｍＲＮＡ杂交及ＥＧＦＲ免疫组化染色检测ＥＧＦＲｍＲＮＡ及蛋白表达，核仁组成区相关嗜银蛋白染色（ＡｇＮＯＲ计数）检测细胞增殖活性。结果：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明外源性反义ＥＧＦＲ基因（互补于ＥＧＦＲ基因全长及３端部分序列）分别在Ｃ６细胞中整合（分别命名为Ｃ－ｐＲ１和Ｃ－ｐＲ３），通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、原位杂交及细胞免疫组织化学检测均显示转染ＥＧＦＲ反义ＲＮＡ的Ｃ６细胞比转染前ＥＧＦＲｍＲＮＡ水平及ＥＧＦＲ蛋白水平有不同程度的降低。表达高水平反义ＲＮＡ的克隆在培养状态下细胞增殖活性较对照组有明显下降。结论：ＥＧＦＲ在恶性胶质瘤细胞的发生发展过程中起十分关键的作用，ＥＧＦＲ有可能成为基因治疗恶性胶质瘤的优选靶的之一。     

反义及显性负调节 AKT2 RNA对脑胶质瘤细胞增殖抑制作用的体外研究

背景与目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)下游的丝苏氨酸激酶2(serine/threoninE-kinase-2,AKT2)信号转导通路对肿瘤细胞的生存和凋亡具有十分重要的作用.本文研究了反义AKT2(antisensE-AKT2,AS-AKT2)和显性负调节AKT2(dominant negative AKT2,DN-AKT2)构建体对人脑胶质瘤细胞系TJ905的增殖和凋亡的调控作用.方法:脂质体介导AKT2构建体转染人脑胶质瘤细胞系TJ905,原位杂交和蛋白印迹法检查AKT2的表达水平,Ki-67标记指数和 MTT法检测细胞增殖能力,TUNEL法计算凋亡指数评价肿瘤细胞凋亡的变化.结果:对每种 AKT2构建体转染后随机选择3个扩增后进一步分析.原位杂交和蛋白印迹结果表明,转染AS-AKT2后AKT2表达显著抑制,转染DN-AKT2后AKT2表达无明显变化.MTT研究发现:AS-AKT2组和DN-AKT2组的6天细胞生存率分别为(49.30～ 51.46)％和(50.52～55.23)％,细胞存活率显著低于对照组和空载体组( P<0.001);AS-AKT2组和DN-AKT2组的标记指数(Ki-67 labeling index,Ki- 67 LI)分别为(57.50～59.33)％和(59.17～61.00)％,明显低于对照组(76.50％)和空载体组(74.83％)(P<0.001);TUNEL法凋亡分析表明:对照组和空载体组几乎没有凋亡细胞,AS-AKT2组(8.33％～8.83％)和DN-AKT2组( 7.50％～7.83％)的凋亡指数显著增加(P<0.001).结论:AKT2通路可以对胶质瘤细胞的增殖和凋亡发挥重要的调控作用.     

高危型HPV阳性患者血清中miR-130b-5p和miR-142-5p表达水平对宫颈癌发生的临床意义

目的 探讨血清miR-130b-5p和miR-142-5p在高危型人乳头瘤病毒(HPV)阳性的宫颈癌患者中的表达水平及其临床价值.方法 选取高危型HPV阳性宫颈癌患者76例,另选取80例高危型HPV阳性非宫颈癌患者为对照组.采用ELISA法检测2组的血清miR-130b-5p和miR-142-5p表达水平以及分析其与宫...     

脑胶质瘤细胞化疗耐药中p38MAPK信号通路的作用

探讨p38MAPK信号通路在脑胶质瘤细胞化疗耐药中的作用及相关机制。 方法 在 前期建立U251/TMZ胶质瘤耐药细胞株的基础上,用特异性阻断剂SB203580阻断耐药细胞株中 p38MAPK信号通路,替莫唑胺作用下检测耐药株的细胞活性变化,同时检测MDR1、TopoⅡ、BCL-2 等耐药相关基因的蛋白表达变化。 结果 阻断通路后替莫唑胺作用下细胞的抑制率明显低于未阻 断组,两组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）,阻断后耐药细胞中BCL-2、MDR1的表达明 显升高,TopoⅡ的表达明显降低,与未阻断的耐药细胞相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结 论 U251/TMZ胶质瘤耐药细胞中p38MAPK信号通路被阻断后细胞的耐药性增强,其机制可能与耐药 株中耐药相关基因BCL-2、TopoⅡ、MDR1的表达变化有关。