体外组织工程血管支架内皮化的实验研究

目的：研究兔血管内皮细胞种植于组织工程血管支架内腔面的生长状况。方法：（1）将聚羟基乙酸（Plyglycolic acid,PGA)纤维无纺网和胶原纤维相混合，设计构建组织工程血管支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔血管内皮细胞并传代，纯化，接种于组织工程血管支架的内腔面，体外培养，并行电镜等观察。结果：该支架具有一定弹性和韧性，内皮细胞在其内表面形成较完整内皮细胞层，生长状况良好。结论：胶原包埋处理的PGA支架可以作为组织工程人工血管研究的较理想支架材料。为组织工程方法构筑具有分层结构的组织工程血管打下实验基础。     

组织工程技术预制血管实验研究的初步报告

目的:探讨利用组织工程技术,用自体血管壁组织培养预制血管的可行性。方法:取杂种犬12只,各切取右侧颈动脉2cm,将血管腔内残留血液冲洗干净,去除外膜纤维组织,用锐器切割和粉碎至匀浆状态,均匀种植于口径为3mm、长40mm的无纺聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)管状支架上;埋植于实验犬的腹直肌内。3月后,取出标本进行大体、组织学和超微结构观察。结果:PGA血管支架已完全被吸收和降解,种植的血管组织已完全生长成酷似血管的管状结构。电镜观察发现:外膜较薄,为疏松结缔组织;中膜较厚,主要由成纤维细胞、平滑肌细胞和胶原纤维等成分组成;内膜最薄,可见内皮细胞覆盖。结论:利用组织工程技术,将犬的动脉组织匀浆种植于PGA支架上,3月后支架完全降解和吸收,形成酷似血管的管状结构。     

血管内皮细胞与平滑肌细胞复合构建组织工程人工血管的实验研究

目的：构建既具有活性血管平滑肌细胞（VSMC）中膜层，又有血管内皮细胞（VEC）内皮化的复层结构组织工程血管支架材料。方法（1）将聚羟基乙俊（PGA）纤维无纺网，VSMC和胶原纤维相混合，设计构建VSMC活性的组织工程血支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔VEC并传代，纯化，接种于组织工程人工血管支架的内腔，体外培养，并行电镜观察。结果：构建的支架材料具有一定弹性和韧性，VEC在其内表达形成较完整内皮细胞层，且VSMC能够保持活性，生长状况良好。结论：经胶原包埋处理的PGA支架可作为组织工程化人工血管研究较理想支架材料，为组织工程方法构建具有分层结构的组织工程血管奠定实验基础     

组织工程人工血管支架的预构

目的：探讨具有血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）活性的组织工程人工血管支架的构建方法。方法：①将聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合，构建组织工程血管。②将VSMCs置入胶原凝胶中，观察VSMCs的生长状况。③观察VSMCs胶原悬液滴入该支架材料中的生长。结果：①VSMCs在胶原凝胶中的位置固定，分布于不同层次，约3－4h逐渐形成多个胞质突起。随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈梭形、纺锤形。②VSMCs胶原悬液滴入胶原包埋处理的PGA支架中后，大部分细胞随胶原凝胶状态的形成，滞留于支架材料网孔中，细胞可沿PGA纤维表面生长。结论：胶原包埋处理的PGA纤维无纺网是良好的携带VSMCs的多孔生物降解材料。     

生物可降解材料聚乳酸/聚羟基乙酸复合壳聚糖在人工冠状动脉血管支架制备中的应用

第一代金属裸支架和第二代涂层支架介入治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)已得到广泛应用。由于长期存在金属支架异物刺激及其携带的药物扰乱血管壁各层细胞生长,引起支架内再狭窄和血管栓塞,远期仍有较多的主要心血管不良事件发生和需要再血管化治疗。因此,由聚酯、聚碳酸酐及聚磷酸酯等高分子材料制备的完全可生物降解吸收支架及药物洗脱支架应运而生,其中聚乳酸(poly-lactic acid,PLA)、聚羟基乙酸(poly-glycolicacid,PGA)、壳聚糖、聚己内酯(poly-caprolactone,PCL)及一些共聚物如聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)材料制备的心血管植入支架的安全性、组织及血液相容性已得到证实,然而这些支架具有各自的缺点,如PLA降解较慢质硬易断裂柔韧性不足,PGA降解较快质软支撑力不足,支架降解太快或者太慢,均难以达到有效支撑,支架植入后容易出现血管损伤、弹性回缩,导致血管再狭窄及血栓形成,远期效果不佳。通过优化组合不同摩尔比的PLA和PGA及壳聚糖涂层,可以获得具有更好的生物相容性、适度的降解速率(约3～6个月完全降解)、足够的机械强度、较低的炎症反应和伸展度良好的复合材料,从而为制备完全生物可降解冠状动脉支架奠定实验基础。     

含内皮祖细胞的组织工程皮肤体外构建及裸鼠移植研究

目的构建含内皮祖细胞（EPC）和成纤维细胞的组织工程复合皮，初步研究EPC在组织工程皮肤移植中促血管发生的作用。方法采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CD133＋血管内皮祖细胞，以聚羟基乙酸（PGA）为真皮基质，接种EPC和成纤维细胞，其上覆盖表皮细胞膜片，构建组织工程复合皮，覆盖裸鼠背部全层皮肤缺损创面。结果EPC和成纤维细胞能均匀贴附于PGA支架纤维材料上，并逐渐伸展为梭形或多极状。裸鼠移植实验表职，实验组创面愈合早于对照组，可见EPC参与大量新生小血管形成，真皮支架5周完全降解。结论EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。应用PGA＋纤维蛋白凝胶，制备含EPC和成纤维细胞的活性真皮替代物，具有良好的生物相容性、降解特性。     

不同比例的PLA—PGA支架对软骨细胞复合的影响

目的研究经聚乳酸（PLA）包埋后的不同比例PLA-聚羟基乙酸（PGA）组织工程支架对软骨细胞复合的影响及原因。方法分离培养小猪软骨细胞，并以5×10^7cells／mL的密度接种在经PLA包埋的不同比例PGA—PLA支架材料上，4h后检测软骨细胞在支架材料上的流失率。24h后检测软骨细胞在支架材料上的粘附率，并对支架材料进行电镜扫描，分析原因。结果随着支架材料中PLA比例的提高，软骨细胞的接种流失率上升，支架材料的接种负荷下降，24h时软骨细胞粘附率无明显差异。扫描电镜证实其原因。结论PLA包埋的PGA支架材料会降低对软骨细胞的接种负荷，但细胞粘附率无变化。     

组织工程血管模型体外构建的实验研究

目的：在体外环境下，探索构建分别含内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞的三层结构的组织工程化血管，三种细胞相互作用，相互支持，形成一个在形态和功能与正常血管近似的组织工程化血管。方法：通过用胶原分别包埋处理的三个管径大小不同，但能相互嵌套的聚羟基乙酸（PGA）管形支架，并种植人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞进行三维立体生长培养，观察细胞生长分化情况。采用酶消化法和组织块法分离培养人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞并传代，纯化，将聚羟基乙酸（PGA）无纺网用胶原溶液包埋，真空冷冻干燥，形成多孔状PGA＋胶原管型支架；接种3代－7代人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞及人成纤维细胞与其内腔面，采用动脉旋转培养技术体外培养3周，行扫描电镜观察。结果：构建后的血管模型，层与层结构紧密，内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞分泌细胞外基质，相互进行物质交换，类似于生理条件。结论：该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状。此方法的进一步应用组织工程方法构筑具有分层结构的人造血管打下基础。     

生物合成支架材料的研究进展

皮肤组织工程就是应用组织工程学技术的基本方法 ,将组织细胞 (表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等 )经体外培养扩增后 ,黏附于一种生物相容性良好并可被人体逐步降解吸收的真皮支架上 ,进行人工皮肤构建和培养。其中 ,真皮支架为细胞的增殖、繁衍提供三维空间 ,使之进行营养和气体交换、排除废物 ,因此真皮支架材料的性能直接影响着体外构建人工皮的质量和移植后的创面愈合质量。目前 ,用于制备真皮支架的材料种类较多 ,难以明确分类 ,一般多根据材料的来源大体分为天然生物材料和合成生物材料两大类。天然生物材料包括胶原、葡糖胺聚糖、壳聚糖、明胶等。合成生物材料主要由乳酸(LA)、羟基乙酸 (GA)、β 羟基丁酸、ε 羟基己酸等聚合而成 ,由于来源广泛、可塑性强、可生物降解、适合于规模化生产 ,因此其有可能成为组织工程的重要材料来源 ,可作为真皮支架应用于皮肤组织工程。本文就合成生物材料的种类和特点作一综述。一、合成生物支架材料的种类目前常用的合成生物支架材料主要是脂肪族聚酯类 ,包括聚乳酸 (PLA)、聚羟基乙酸 (PGA)、聚乳酸 羟基乙酸 (PLGA)、聚己内酯 (PCL)[1]。下面分别予以简要介绍。1.PLA:又称聚丙...     

复合可降解基质膜片制备及血管内皮细胞在其吸附生长的实验研究

目的　制备几种复合可降解基质膜片 ,观察血管内皮细胞在其上的生长情况。方法　用胶原酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞 (VEC) ,另采用两步盐析法提取牛骨 型胶原。将交联胶原包埋处理聚羟基乙酸 (PGA)、聚乳酸 (PL A)及聚β羟基丁酸 (PHB)形成可降解基质材料膜片 ,并接种牛 VEC,采用 MTT法比较 VEC在几种可降解基质材料膜片的生长情况。结果　胶原、PGA/胶原、PL A/胶原膜质地均匀柔韧 ,固定成形 ,具有一定弹性和吸水性 ;MTT比色实验表明 VEC在胶原、PGA/胶原、PL A/胶原上均生长良好 ,优于 PHB/胶原组。尤以 PGA/胶原所形成的基质材料固定成形 ,弹性和韧性好 ,VEC在其上贴附生长良好。结论　通过生物材料与人工可降解材料有机结合 ,PGA/胶原物理性能互补 ,是组织工程再造血管较理想的基质材料之一。     

应用脂肪干细胞构建组织工程化小口径血管平滑肌层的实验研究

目的探索利用脂肪干细胞在生物反应器内构建组织工程血管平滑肌层的可行性。方法用抽吸的脂肪获取脂肪干细胞,在生长因子TGF-β1和BMP4作用下诱导成平滑肌细胞,然后将诱导的平滑肌细胞接种于PGA上,将细胞-材料复合物置于生物反应器内进行培养,在模拟胚胎发育血流动力学的刺激下(搏动频率:75次/分;扩展量<5%),构建小口径的血管平滑肌组织。培养8周后,取材行组织学和生物力学检测并与正常血管对比。结果脂肪干细胞在TGF-β1和BMP4的诱导下,细胞呈现平滑肌细胞特有的"波峰-波谷"样生长特点,并表达平滑肌细胞的特异性标记物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC;反应器内培养8周后,构建的管状组织胶原分泌旺盛,具有一定的力学强度和弹性。结论利用脂肪干细胞可在体外生物反应器内构建组织工程化小口径血管平滑肌层,为临床上小血管病变的修复提供了一种新的可能的途径。     

应用生物反应器构建组织工程化血管的实验研究

目的探讨利用生物反应器体外构建具有完整结构的组织工程化血管的可行性。方法从6月龄毕格犬颈总动脉获取平滑肌细胞,颈外静脉获取内皮细胞,经体外培养扩增。然后,先将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上,形成细胞—材料复合物,将该复合物置于生物反应器内培养。模拟成年哺乳动物循环系统的参数,予以动态力学刺激(搏动频率:75次/分;扩张量<5%)。8周后,在其上接种内皮细胞,对照组不接种内皮细胞,培养5d后取材检测。结果组织学染色显示,平滑肌纤维成分排列较规则,有层次感,内皮细胞完整;对照组未见内皮细胞层结构。结论利用生物反应器可在体外构建具有完整结构的组织工程化血管。     

反应器内构建组织工程血管平滑肌层的实验研究

目的 探讨生物反应器内构建组织工程血管的可行性.方法 于6个月龄犬颈总动脉血管获取平滑肌细胞,经体外培养扩增后接种于聚羟基乙酸(PGA)上,形成细胞-材料复合物,并将其置于生物反应器内培养.实验组模拟成年哺乳动物循环系统的参数予以动态力学刺激培养(搏动频率:75次/分;扩张量＜5%);对照组为静态培养,其余与实验组相同,分别于3与6周后取材检测.结果 生物反应器内培养的血管大体观察具有良好的弹性,管腔圆,色泽光亮;HE染色显示平滑肌纤维成分排列较规则,有层次感;弹力纤维染色显示弹力纤维成分较多而密;免疫组织化学检测显示为棕黄色层状排列的平滑肌纤维.对照组弹性欠佳,管腔塌陷,色泽暗淡;平滑肌纤维与弹力纤维成分较少且排列紊乱,层次感差.结论 应用生物反应器可构建具有良好结构的血管样结构的平滑肌层组织.     

利用组织工程技术再生软骨组织的实验研究

目的 在有免疫力的动物体兔体内探索组织工程化软骨生成的影响因素。 方法 经不同物质修猸的聚羟基乙酸支架与软骨细胞体外培养,观察基质产生情况,并将细胞支架复合物体内回植,观察软骨的生成,并进行组织学及超微结构评价。结果 以孵磷脂、多聚赖氨酸及聚乳酸共同修饰的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养,结果基质产生旺盛,体内回植后软骨生成良好。 结论 细胞支架复合物体外培养期间有基质产生,是组织工程化软骨生成的前提     

Human elastic cartilage engineering from cartilage progenitor cells using rotating wall vessel bioreactor

Transplantation of bioengineered elastic cartilage is considered to be a promising approach for patients with craniofacial defects. We have previously shown that human ear perichondrium harbors a population of cartilage progenitor cells (CPCs). The aim of this study was to examine the use of a rotating wall vessel (RWV) bioreactor for CPCs to engineer 3-D elastic cartilage in vitro. Human CPCs isolated from ear perichondrium were expanded and differentiated into chondrocytes under 2-D culture conditions. Fully differentiated CPCs were seeded into recently developed pC-HAp/ChS (porous material consisted of collagen, hydroxyapatite, and chondroitinsulfate) scaffolds and 3-D cultivated utilizing a RWV bioreactor. 3-D engineered constructs appeared shiny with a yellowish, cartilage-like morphology. The shape of the molded scaffold was maintained after RWV cultivation. Hematoxylin and eosin staining showed engraftment of CPCs inside pC-HAp/ChS. Alcian blue and Elastica Van Gieson staining showed of proteoglycan and elastic fibers, which are unique extracellular matrices of elastic cartilage. Thus, human CPCs formed elastic cartilage-like tissue after 3-D cultivation in a RWV bioreactor. These techniques may assist future efforts to reconstruct complicate structures composed of elastic cartilage in vitro.     

Real-time measurement of blood vessel occlusion during microsurgery.

Measurement and feedback of vascular properties during microsurgery is generally not available. We carried out real-time in vivo measurement and analysis of microsurgical occlusion of 1-2-mm diameter arteries and veins in rodents. A pair of forceps mounted with strain gauges was designed for applying and directly measuring the force on tissue. Forces between 0 and 450 mN were applied, with the device having a resolution of 0.5 mN. We performed in vivo experiments on the rat femoral (n = 5) and abdominal (n = 8) blood vessels to measure the elastic restoration force of the tissue in response to radial compression at different levels of force. On average, the minimum occlusion force was 57 mN for the rat artery. During steady application of force, the perturbations in the blood vessel due to heartbeat are visible in the force data. These force oscillations ranged between 1 and 3 mN around the mean steady-state force applied. It was determined that the magnitude of the Fourier spectral peak corresponding to heartbeat frequency can be used as a measure of the patency of the blood vessel, and can provide feedback to microsurgeons to avoid damage to the vessel by application of excess force.