重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL-10／pET32a,测序正确后转化E.coli BL21（DE3）,不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10,MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx,有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

小鼠IL-33的原核表达、纯化及鉴定

目的: 在大肠杆菌中表达具有生物学活性的白细胞介素-33(mIL-33).方法: 用PCR技术扩增小鼠IL-33成熟蛋白的编码区, 与原核表达载体pET-44连接, 构建pET-44-mIL-33表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达, 镍柱亲和层析法纯化目的蛋白, SDS-PAGE分析表达产物, MTT法测定纯化IL-33的生物学活性.结果: 成功构建了pET-44-mIL-33原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达出可溶性mIL-33, SDS-PAGE分析纯化产物纯度为95%, 表达产量为95 mg/L.细胞增殖实验表明IL-33有抑制P815细胞增殖的活性.结论: 获得了有活性的重组IL-33蛋白纯品, 为后续功能研究奠定了基础.     

病毒白细胞介素-10的基因克隆与原核表达

目的:构建病毒白细胞介素IL-10(vIL-10)基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:以EB病毒B95-8细胞培养上清为模板,用PCR扩增EB病毒BCRF1基因。PCR产物经EcoRI和XhoI双酶切后,克隆至原核表达载体pET-28a中,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,在IPTG诱导下表达目的蛋白。结果:以终浓度为100μmol/L的IPTG于30℃诱导6h后,重组菌可高效表达相对分子质量(Mr)约为24000的His-vIL-10融合蛋白。结论:成功地克隆vIL-10的编码基因并在大肠杆菌中高效表达,为制备抗vIL-10单克隆抗体(mAb)、分析vIL-10结构与功能的关系提供了条件。     

重组天花粉蛋白的原核表达纯化和免疫原性分析

目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性.方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达.用金属螯合层析法纯化重组蛋白.薄层扫描及Bradford法检测纯化后重组蛋白的纯度和含量.间接ELISA法检测重组蛋白和天然蛋白产生的多克隆抗体效价.Western blotting检测重组蛋白与抗天然蛋白抗体之间的免疫反应性.结果 1.双酶切鉴定结果表明,pET-29b-TCS成功构建;2.30℃,1 mmol/L的IPTG诱导4 h,重组蛋白的表达量最高（占细菌总蛋白量的36%）,主要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中;3.His-tag特异性结合树脂纯化后,获得了纯度达95%的重组蛋白,纯化后的蛋白含量为1.2 g/L;4.间接ELISA法检测天然蛋白和重组蛋白产生的抗体效价分别为1：4 960和1：5 120;5.Western blotting测纯化的重组蛋白与抗天然蛋白的多克隆抗体之间有特异反应性.结论本实验成功构建了高效表达载体pET-29b-TCS,携带的天花粉蛋白基因无N端和C端编码序列.重组蛋白的抗体效价显著低于天然蛋白,表明天然蛋白的糖基化与其免疫原性之间有一定的关系.     

hTrx基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建携带人Trx(硫氧还蛋白 )基因的逆转录病毒载体。方法 :用DNA重组技术 ,将人Trx基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN ,用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定。以磷酸钙转染法 ,将重组的逆转录病毒载体转染入包装细胞系PA317,并用G4 18筛选的方法测定转染细胞上清中病毒的滴度。结果 :构建了重组逆转录病毒载体 ,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切 ,电泳出现两个条带 ,分别为 0 .3kb和 5 .9kb。转染细胞上清中病毒滴度为 5 .5× 10 9cfu/L。提示构建携带人Trx基因的逆转录载体成功。结论 :携带人Trx基因的逆转录病毒载体成功构建为Trx基因的治疗、实验研究奠定了基础     

重组hcmvIL-10的表达纯化及免疫抑制活性研究

目的:探讨重组人巨细胞病毒白细胞介素10(hcmvIL-10)对单核细胞的免疫抑制活性及分化相关基因表达的影响。方法:将重组的原核表达质粒pMal-c2X-hcmvIL-10和pMal-c2X-hIL-10转化受体菌E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,采用Amylose-resin亲和层析纯化重组蛋白,并用葡聚糖凝胶(Sephadex G-75)进行二次纯化。纯化的重组蛋白hcmvIL-10和人白细胞介素10(hIL-10)分别与THP-1细胞作用后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养细胞上清液TNF-α水平;实时荧光定量PCR与流式细胞术分别检测THP-1细胞HLA-DR mRNA及HLA-DR分子的表达;采用功能分类Th1-Th2-Th3 PCRARRAY检测分化相关基因表达谱。结果:重组蛋白hcmvIL-10和hIL-10经SDS-PAGE及Western blot鉴定与目的相符;不同浓度(2、10和50 ng/ml)重组hcmvIL-10和hIL-10分别与经PHA诱导的THP-1细胞作用48小时后,培养上清液中TNF-α的浓度分别为:(3.8±0.96)pg/ml、(1.95±0.51)pg/ml、(1.6±0.45)pg/ml和(2.49±0.43)pg/ml、(1.77±0.38)pg/ml、(0.98±0.16)pg/ml,除2 ng/ml重组hcmvIL-10处理组外,其它处理组与对照组比较均明显降低(P<0.01);不同浓度重组hcmvIL-10和hIL-10分别与THP-1细胞作用48小时后,HLA-DR mRNA相对表达量分别为:0.86±0.025、0.76±0.023、0.75±0.017和0.73±0.017、0.61±0.017、0.55±0.015,HLA-DR分子的表达分别为:(11.5±0.44)%、(10.1±0.30)%、(9.1±0.38)%和(10.9±0.10)%、(9.7±0.50)%、(7.5±0.32)%,除2 ng/ml重组hcmvIL-10处理组外,其它处理组与对照组比较均明显降低(P<0.01);功能分类Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY共检测84个分化相关基因,hcmvIL-10处理组共有8个基因差异表达,上调基因为IL-12RB2、NFATC2、SOCS2、TYK2、GFI1和CEBPB,下调基因为CD80和CTLA4;hIL-10处理组共有5个基因差异表达,上调基因为SOCS2,下调基因为CD80、CD28、CTLA4和IL-6。结论:重组蛋白hcmvIL-10可抑制THP-1细胞分泌TNF-α,下调THP-1细胞HLA-DR分子的表达,类似hIL-10的免疫抑制功能;重组蛋白hcmvIL-10可影响THP-1细胞相关基因的表达,其差异表达基因与hIL-10不同。     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

IL-2上重组表达研究现状及发展趋势

IL-2对某些恶性肿瘤的显著治疗作用为恶性肿瘤的生物治疗带来了希望,发展高纯度、高活性、高产量的IL-2基因工程产品也成为近年来研究的热点。本文比较了大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞及昆虫细胞表达体系的优缺点和它们在IL-2重组表达中的应用,并对其发展趋势作了 预测。     

牙周病患者血清hs-CRP、IL-8和IL-10检测的临床意义

目的：探讨牙周病患者血清hs-CRP、IL-8和IL-10水平的变化及临床意义。方法：应用放射免疫分析、酶联法和免疫比浊法对32例牙周病患者进行了血清hs-CRP、IL-8和IL-10检测,并与35名正常人作比较。结果：牙周病患者在治疗前血清hs-CRP、IL-8和IL-10水平均非常显著地高于正常人组（P〈0.01）,经治疗1个月后与正常人组比较仍有显著性差异（P〈0.05）。结论：检测血清hs-CRP、IL-8和IL-10水平的变化,对探讨牙周病发病机制、预防和指导治疗均有一定的临床价值。     

重组人白细胞介素-10诱导瘤细胞凋亡

目的 研究重组人白细胞介素-10诱导瘤细胞凋亡的作用。方法利用基因工程技术制备的rhIL-10,分别作用于体外培养的ScaBer、NCIS446、U937瘤细胞,观察瘤细胞的形态改变,MTT法检测rhIL-10对瘤细胞增殖的抑制作用,电泳观察rhIL-10诱导瘤细胞凋亡的情况,TUNEL法检测瘤细胞凋亡百分率。结果电泳出现典型的DNA“lader”,ScaBe,、NCIS446、U937三种瘤细胞的凋亡率为48．5％、45．6％、47．1％,IC50分别为0．043、0．052、0．058mg／mL。结论rhIL-10具有显著抑制瘤细胞生长活性、诱导瘤细胞凋亡的作用。     

大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素原核表达载体的构建及表达

目的 构建大鼠γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因的原核融合表达载体,并对其表达进行鉴定.方法 通过PCR获得本实验所需要的IP-10基因片段,通过酶切含有PE38KDEL的质粒PRKL459K获得绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因 ,再通过适当的酶切及连接反应,构建IP-10与PE38KDEL融合基因的原核表达载体pET-32a ( )-IP-10-PE38KDEL,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后, 转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western-blotting分析证实其相对分子质量和特异性.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入原核表达载体pET-32a( ),并在大肠杆菌中稳定表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符,且所表达蛋白可被抗PE的特异性抗体识别.结论 成功构建了原核表达载体pET-32a( )-IP-10-PE38KDEL,其融合基因在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其功能奠定了基础.     

人IL-10基因的克隆表达及表达产物活性的初步鉴定

目的:构建含人IL-10全基因序列的原核表达载体,并进行表达及产物活性的鉴定。方法:利用RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2的总RNA中扩增IL-10的全长编码序列。编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体PET-28 a( ),构建IL-10基因的重组原核表达载体。在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western blot和ELISA进行鉴定。结果:表达产物主要位于包涵体内。经Western blot分析和ELISA检测显示,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期的结果相符,有结合抗体活性。结论:成功地扩增人IL-10全基因序列,并构建了含该基因序列的原核表达载体,在大肠杆菌中高效表达的表达产物具有抗原活性,为下一步制备抗IL-10的单克隆抗体(mAb)提供了必要的前提。     

Immune complex-induced interleukin-6, interleukin-10 and prostaglandin secretion by human monocytes: a network of pro- and anti-inflammatory cytokines dependent on the antigen: antibody ratio

We have used two experimental models of immune complexes to study the secretion of interleukin (IL)-10, IL-6 and their connection with the immune complex-induced synthesis of prostaglandin (PG) E2 by human monocytes in vitro. Immune complexes formed of tetanus toxoid and polyclonal anti-tetanus toxoid antiserum as well as heat-aggregated human serum immunoglobulins induced the release of IL-6 and IL-10 in a dose- and antigen: antibody ratio-dependent manner. Antigen-antibody complexes formed near equivalence were most effective in induction of a cytokine response. PGE2 could augment the immune complex-induced IL-6 and IL-10 secretion, but alone, did not induce cytokine secretion. IL-10 was capable of down-regulating the release of IL-6 and PGE2. Additionally, we demonstrated that endogenously synthesized IL-10 limited the immune complex-induced secretion of proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and IL-1β. All three regulatory factors examined here share anti-inflammatory properties and are closely associated with the T helper type 2 (Th2) immune response. We conclude that immune complexes, besides their well-known ability no cause acute and chronic inflammation, can mediate immunosuppressive effects and influence the balance of Th1/Th2 responses.     

SARS-CoV基因重组质粒的构建与表达

目的　针对SARS冠状病毒 (SARS CoV)M、N、S和E蛋白 ,构建 4种重组真核表达质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E ,为研制SARSDNA疫苗奠定基础。方法　根据GenBank中SARS病毒基因序列分别设计M、N、S和E引物 ,用RT PCR方法从感染SARS病毒的Vero E6细胞中扩增得到M、N、S和E片段 ,构建重组质粒pVAX1 M、pVAX1 N、pVAX1 S和pVAX1 E。并以重组质粒转染COS 7细胞 ,用免疫细胞化学和Westernblot方法鉴定重组质粒体外的表达。结果　经酶切鉴定及DNA序列测定证实重组质粒构建正确 ,细胞转染实验表明 ,构建的 4种重组质粒均能在COS 7细胞内表达。结论　成功构建 4种SARS CoV 4种蛋白抗原真核表达质粒 ,并能在真核细胞内获得表达。     

人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达

目的构建人谷草转氨酶（AST）高效重组表达体系。方法优化编码人 AST的核苷酸密码子,合成人 AST新的基因,并将其克隆至 pRSF-Duet表达载体中,转化大肠杆菌 BL21,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白的表达,并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件,以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化,以 SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹鉴定蛋白的性质,对重组蛋白的活性及在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的 AST密码子在大肠杆菌中的使用频率均在10%以上;重组蛋白存在于上清和沉淀中,经表达优化,在 IPTG终浓度为2 mmol/L、25℃、150 r/min振摇8 h诱导条件下,可增加可溶性蛋白的产率,纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷草转氨酶,活性可达136000 U/L,且在含有蛋白酶抑制剂的血清中稳定存在。结论通过密码子优化,成功构建了重组 AST的高效表达系统,重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。     

人酪氨酸激酶6原核表达载体的构建、表达、纯化与鉴定

目的构建人络氨酸激酶6(PTK6)与His融合蛋白重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。方法通过PCR在编码PTK6的cDNA序列两端添加EcoR I和BamH I酶切位点,双酶切后将编码PTK6的cDNA序列亚克隆至原核表达载体PHUE构建重组蛋白表达载体PHUE/PTK。重组载体经鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导重组蛋白表达。收集菌体裂解后,用尿素洗涤和溶解包涵体。溶解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化产物。结果成功构建人PTK6重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为55 000,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度大于80%的目的重组蛋白。结论人PTK6 His融合蛋白的纯化为多克隆及单克隆抗体的制备以及结构和功能的研究奠定了基础。     

戊型肝炎病毒Ⅳ型的ORF3及ORF2蛋白的分片段表达、纯化及抗原性分析

目的：对戊型肝炎病毒（HEV）Ⅳ型ORF3的全长基因片段和4个覆盖全长ORF2的互相重叠的基因片段进行了表达，对表达产物进行了纯化及抗原性分析。方法：将O3、FB5、E4、F2－2和E5基因片段分别连接到融合性表达质粒pThioHis，用IPTG进行诱导表达，并用反向、分子筛、离子交换和亲和层析方法进行纯化，用纯化的蛋白分别制备检测抗HEV IgG的诊断试剂，用该试剂检测急性散发性的戊肝病人和非戊肝病人血清。结果：位于ORF2－N端的FB5蛋白在急性期的戊肝病人血清中具有最强的反应性；而且仍有部分被HEV I型或／和Ⅱ型的诊断试剂排除的急性非戊肝病人血清对HEV Ⅳ型的多肽吴阳性反应。结论：为早期诊断戊肝病毒的感染，其诊断试剂应含有HEVⅣ型的ORF2N－端的蛋白片段。