雌激素上调LRP16基因表达的研究

目的：鉴定LRP16基因的表达调控途径并探讨其可能机制。方法：对LRP16基因进行启动子序列顺式作用元件和信息学角度的SAGE(serial analysis of gene expression)谱分析，提示雌激素对其可能具有转录调控作用。为证实这一作用，构建了LRP16基因启动子序列(2．6kb)调控的荧光素酶报告子(pS0)，并与雌激素受体α和β(ERα，ERβ)真核表达载体共转染COS-7和MCF-7细胞，加入雌二醇(β-E2)培养，lueiferase assay方法测定相对荧光素酶活性。结果：报告子pS0与ERα真核表达载体共转染细胞的相对荧光素酶活性较非共转染组及pS0／ERβ表达载体共转染组显著升高，并且在两种细胞中的升高幅度接近。结论：LRP16是受雌激素调控的一个新识别的靶基因，具体调控途径由雌激素变构激活的ERα直接介导，其临床意义有待进一步研究。     

雌激素调控子宫内膜癌Ishikawa细胞中LRP16基因表达及其意义

目的:探讨子宫内膜癌Ishikawa细胞中雌激素(E2)对LRP16基因表达的调控作用,LRP16基因过表达对Ishikawa细胞增殖及侵袭生长能力的影响以及可能的分子机制. 方法:采用Northern blot方法检测细胞中LRP16基因mRNA表达水平. 双荧光报告系统检测相对荧光素酶活性. 胎盘蓝死活细胞计数方法观察LRP16过表达对Ishikawa细胞增殖的影响,Matrigel包被的Transwell方法观察LRP16 过表达对Ishikawa细胞侵袭生长能力的影响. Western blot方法检测Ishikawa细胞中的蛋白水平. 结果:雌二醇诱导了Ishikawa细胞中LRP16基因mRNA水平表达上调;而ICI 182 780则Ishikawa细胞中LRP16 mRNA水平下调. 增加ERα表达量促使Ishikawa细胞中LRP16基因上调. pGL3-S5与ERα共转染Ishikawa细胞的相对荧光素酶活性较单纯pGL3-S5转染组细胞升高30倍. 我们没有观察到LRP16基因过表达对Ishikawa细胞的促增殖效应. Transwell结果显示LRP16基因过表达Ishikawa细胞的侵袭率较对照组细胞增加了30%. LRP16基因过表达的Ishikawa细胞中E-钙粘合素的mRNA以及蛋白水平较对照组细胞下调了3倍,而没有检测到MMP2,MMP9以及CD44蛋白水平的变化. 结论:我结果表明E2通过激活ERα上调子宫内膜癌Ishikawa细胞中LRP16基因mRNA水平,LRP16表达水平依赖于雌激素. LRP16基因表达上调没有促进子宫内膜癌细胞的增殖,但可能通过抑制E-钙粘合素表达水平增加了细胞的侵袭能力.     

LRP16基因启动子的亚克隆及表达调控载体的构建

目的：为深入研究LRP16基因的表达调控机制，克隆及亚克隆了LRP16基因的启动子序列，构建LRP16基因启动子表达调控载体。方法：在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRPl6基因转录起始位点5′侧翼区约3kb的基因组序列设计PCR扩增引物，从健康外周血中扩增获得该片段，以此序列为基础进行亚克隆，分别获得6条5’端不等、3’端平齐的片段，最后插入用于表达调控研究的pGL3—Basic载体。结果：获得了7条长度依次差别约为400bp的LRP16启动子克隆，分别构建了调控荧光素两报告基因的真核表达载体。结论：上述载体的成功构建为信息资源与实验手段的有效结合克隆启动子序列提出了一种模式，并为LRPl6表达克隆及启动子的活性分析奠定了基础。     

抑制LRP16基因表达增加了肿瘤细胞辐射敏感性

目的:探索抑制LRP16基因表达对肿瘤细胞辐射治疗敏感性的影响。方法:采用逆转录病毒介导的小干扰RNA策略,建立了LRP16基因表达被稳定抑制的MCF7及HeLa细胞系,采用电离辐射及紫外线(UV)分别照射LRP16基因被稳定抑制表达的MCF7和HeLa细胞,于照射后不同的时间点进行Hoechst33342染色以检测细胞凋亡率,并进行DNA片段化分析;胎盘蓝染色检测不同时间点的细胞死亡率。结果:照射后2～10h之间,LRP16基因表达抑制组细胞的凋亡率明显高于对照组(P<0.05);照射后10h胎盘蓝方法计数死活细胞,发现LRP16基因抑制组细胞的死亡率>40%,而对照组的死亡率在15%～20%之间;24h计数细胞死亡率发现LRP16基因抑制组细胞与对照组细胞差别不明显(P>0.05)。结论:抑制LRP16基因在肿瘤细胞中的表达增加了瘤细胞的辐射治疗敏感性,其机制可能是通过抑制LRP16基因表达干预了辐射诱导DNA损伤反应的早期信号途径。     

LRP16在胰岛素瘤中的表达及临床意义

目的 检测LRP16在胰岛素瘤中的表达及与临床病理特征的相关性.方法 应用免疫组化的方法检测34例临床胰岛索瘤标本中LRP16、ERα、ERβ的表达情况.结果 LRP16、ERα、ERβ在胰岛素瘤中表达的阳性率分别为79.4％、76.4％、47.1％.LRP16与ERα的表达呈正相关性,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、血糖水平、血浆胰岛素水平等临床特征未发现明显相关性.结论 LRP16、ERα在胰岛索瘤中均有较高表达,LRP16与ERα表达呈正相关性,提示这些蛋白参与了胰岛素瘤的发病机制.     

人MUC16基因启动子区域的初步分析

目的 分析人MUC16基因的转录起始位点和重要的调控区域,确定人MUC16基因的核心启动子可能存在区域.方法 用生物信息学分析人MUC16基因启动子所在区域.培养SKOV3细胞株并提取细胞基因组DNA,用PCR技术扩增启动子区域的594(-1 844/-1 250/)、548(-1 798/-1 250)、326(-1 576/-1 250)和170 bp(-1 420/-1 250)的启动子片段,分别构建重组PGEM-T质粒,再克隆入荧光素酶报告基因载体PGL3载体,构建PGL3-170、PGL3-326、PGL3-548和PGL3-594重组表达质粒.用脂质体介导的方法瞬时转染SKOV3细胞,测定荧光素酶的表达活性.结果 成功构建4种人MUC16基因启动子片段的荧光素酶报告基因表达体系,分别为PGL3-170(-1 420/-1 250)、PGL3-326(-1 576/-1 250)、PGL3-548(-1 798/-1 250)和PGL3-594(-1 844/-1 250),各缺失片段在SKOV3细胞中均有活性.MUC16的核心启动子5′端可能为PGL3-326的3′端,3′端固定在-1 250处,5′端由-1 844向-1420移动时启动子活性逐渐增强,且变化幅度较大,提示这一区间内可能存在重要的顺式作用元件.结论成功构建了人MUC16基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,确定人MUC16基因的核心启动子区域.     

雌激素受体α与其靶基因LRP16相互作用的研究

目的:既往研究表明LRP16是雌激素受体α(ERα)诱导表达的一个靶基因,但可以反馈激活ERα介导的转录活性,本研究目的在于探讨该反馈效应的分子机制.方法:GST-pulldown与免疫共沉淀(CoIP)方法检测LRP16与ERα体内外的相互作用.结果:GST-pulldown与CoIP实验结果均表明LRP16与ERα可以直接结合,并且表明该相互作用不依赖于雌激素的存在,但雌激素可以增强二者的结合.结论:LRP16不仅是ERα的一个下游靶基因,而且是ERα的一个共激活因子.     

LRP16基因在乳腺癌中的表达及临床意义

目的：检测LRP16基因在乳腺癌中的表达及与乳腺癌预后的相关性。方法：用免疫组化方法检测62例临床乳腺癌标本中LRP16、ER、PR和E-cadherin的表达。结果：LRP16、ER、PR和E-cadherin在临床乳腺癌标本中表达的阳性率分别为56.5%、56.5%、48.4%、40.3%。LRP16在临床乳腺癌中的表达与肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、临床分期、ER表达呈正相关,与E-cadherin表达呈负相关（P〈0.05）。E-cadherin在临床乳腺癌标本中的表达与腋窝淋巴结转移、临床分期呈明显负相关（P〈0.05）。结论：LRP16与乳腺癌生物学行为密切相关,可以作为乳腺恶性程度评判的新指标。     

人PCAN1基因启动子的克隆及其上游调控区域的鉴定

目的克隆人前列腺癌基因1（PCAN1）5′上游2.6?kb启动子片段,构建pGL3 p2.6?kb载体, 测定其启动子活性,初步鉴定该片段内的DNA调控区域。方法采用PCR法从人基因组DNA中扩增PCAN1基因5′上游2.6?kb启动子片段,并构建到荧光素酶报道基因载体pGL3 basic中,构成pGL3 p2.6?kb;瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP,通过双荧光素酶活性检验测定PCAN1启动子活性。 使用Erase a system对pGL3 p2.6kb载体中2.6?kb片段进行一系列5′侧翼缺失,产生12个缺失体,分别瞬时转染LNCaP细胞,通过检测荧光素酶的活性观察缺失突变对PCAN1启动子活性的影响。结果克隆的PCAN1 2.6?kb启动子片段经测序鉴定正确无误; pGL3 p2.6?kb转染LNCaP细胞后,双荧光素酶活性测定结果显示2.6?kb片段具有明显的启动子活性;5′缺失突变分析显示,PCAN1基因上游-1?599?bp?至-1?541?bp、-347?bp至-84?bp的缺失,与2.6?kb?片段相比,启动子活性分别升高2.24倍和2.53倍,-1?541?bp?至-1?226?bp的缺失,与2.6?kb片段相比,启动子活性降低2.11倍。结论 克隆的人PCAN1基因5′上游2.6?kb片段具有较强的启动子活性,PCAN1基因上游2.6?kb区域内分别存在2个负调控区和1个正调控区。     

人TIPE2基因启动子的鉴定及其表达调控区域的研究

目的克隆人TIPE2基因启动子区及一系列5’截短片段,并鉴定其DNA表达调控区域。方法采用PCR技术从人基因组DNA中克隆扩增TIPE2基因5’上游1 252 bp启动子序列并对该片段5’端的截短,分别瞬时转染人卵巢癌来源细胞系SKOV3,通过双萤光素酶活性的检测鉴定其启动子活性及表达调控区域。结果克隆扩增的8个TIPE2基因启动子截短片段经测序证明无误;TIPE2-pGL4-F1重组质粒双萤光素酶活性检测显示其具有明显的启动子活性,约为pGL4-Basic的7.9倍;5’系列截短片段重组质粒的启动子活性检测显示,与1 252 bp片段相比,TIPE2上游-965～-593 bp、-501～-390 bp缺失,启动子活性分别升高6.38、7.82倍;-593～-501 bp的缺失,使-501～+79 bp片段相对于-593～+79 bp片段的启动子活性降低2.04倍。结论人TIPE2基因上游1 252 bp区域有明显的启动子活性,该片段内存在2个潜在的负性调控区和1个潜在的正性调控区。     

LRP16基因的SAGE谱及其在正常血细胞、白血病细胞中的表达状况

目的：通过信息学和实验学的方法检测LRP16基因在肿瘤细胞以及在造血发育不同阶段的表达状况，探讨其在肿瘤发生、发展以及在血细胞成熟过程中可能的作用。方法：以NCBI提供的高通量CGAP／SAGEmap数据库为实验对象，“Virtual Northern”程序为实验工具，分析比较了LRP16基因在多种肿瘤组织、细胞系和相应正常组织中的表达谱；采用半定量RT－PCR方法检测了该基因在多种正常血细胞及白血病细胞中的表达量。结果：SAGE结果显示LRP16在人类多种肿瘤细胞中的表达量明显高于其正常对应组织。脐血中未检测到LRP16表达，正常骨髓及经G－CSF动员的PBSC（peripheral blood stem cells)中的表达量明显低于正常人外周血、原代白血病细胞及白血病细胞系（P＜0．001）。结论：LRP16在不同的血细胞中表达量不同。同时表明LRP16与急性白血病等多种肿瘤的发生、发展存在相关性；在初诊与复发白血病中，LRP16的表达差异值得进一步研究。     

LRP16在肝硬化组织、癌旁组织及癌组织中的表达及意义

目的:探讨白血病相关蛋白16(LRP16)在肝癌中的表达规律,寻求其作为肝癌早期诊断及判断临床预后指标的可能性。方法:用Western印迹杂交法检测42例肝癌标本或新鲜组织中LRP16的表达情况,分析其与病理因素的关系。结果:LRP16在肝硬化组织、癌旁组织及癌组织中均有表达,但表达量依次减少。LRP16高表达者一般肿瘤直径较小,具有完整的包膜,一般无血管侵犯,多为中低分化腺癌。结论:LRP16高表达者具有较好的生物学特性。LRP16可能在判断肝癌生物学特性方面具有一定前景。     

原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态检测

目的研究原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态及其与原发性肝细胞癌发生发展的关系。方法用特异性甲基化PCR（MSP）法检测30例原发性肝细胞癌肿瘤组织和5例正常肝脏组织中p16、p15基因启动子区甲基化状态，并进行统计分析。结果30例原发性肝细胞癌肿瘤组织中p16和p15基因启动子区分别有53．3％（16／30，P〈0．05）和46．7％（14／30，P〉0．05）甲基化，5例正常组织中未发现甲基化。两基因甲基化与原发性肝细胞癌临床病理及HBsAg之间无明显相关性（P〉0．05），两者在原发性肝细胞癌发生中有协同性（相关性和一致性）。结论p16、p15基因启动子区异常甲基化在原发性肝细胞癌中发生频率很高，可能对肝细胞癌发生发展起重要作用。     

新的白血病相关基因LRP16的克隆

目的 发现新的白血病相关基因及探讨白血病的发生机制。方法 应用分子克隆技术ＲＬＧＳ及ＲＡＣＥ技术自急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆新的白血病相关基因。结果 克隆到一个长度为２９４８ｂｐ的ＤＮＡ片段,经国际基因库同源检索证明为一未知基因的一部分,并定位于第１１号染色体长臂１１区,进一步克隆到这一基因的全长ｃＤＮＡ,其长度为９８０ｂｐ,并被国际基因库以新的人类基因ＬＲＰ１６收录入库。结论 ＲＬＧＳ及ＲＡ     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.