人凝血因子Ⅷ的细菌内毒素检查法

人凝血因子Ⅷ的细菌内毒素检查法６１００８１中国医学科学院中国协和医科大学输血研究所姚志强倪永碧陈仁清细菌内毒素检查法［１］比家兔热原实验迅速、经济、所需样品量少、操作简便，可同时进行多个样品的检测，１９８８年卫生部颁布了细菌内毒素检查法，使它在生物制...     

人凝血因子Ⅷ活性测定中2种APTT试剂的比较

目的比较进口与自制APTT试剂,在FⅧ∶C检测中的应用.方法人凝血因子Ⅷ活性测定一期法.结果自制APTT试剂在性能上与进口APTT试剂差异无显著性,相关系数(r)均值分别为0.994、0.995;样品重复测定变异系数(CV%)均值为4.22、4.84;样品稳定性CV(%)均值为1.36、1.46.结论自制APTT试剂亦能用于FⅧ制品生产的质量监控以及止血与血栓的研究.     

2种标准品用于凝血因子Ⅷ测定的结果比较

新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量在国标中有明确的规定应≥0.7IU/ml,在测定其含量时采用合理的标准品制定准确的标准曲线是保证检测结果准确的前提.目前国内大多血站在制定标准曲线时选择市售的标准品或者采用多个正常人新鲜血浆混合的自制标准品.我们分别用这2种标准品制定标准曲线,并对正常质控血浆进行测定,用以验证其准确性,现报告如下.     

基质效应对注射用重组人凝血因子Ⅷ效价检测方法的影响

目的 考察不同基质对注射用重组人凝血因子Ⅷ(rFⅧ)效价检测方法的影响。方法 采用两种不同检测基质分别建立注射用重组人凝血因子Ⅷ效价检测方法,并对两种基质效应的影响进行了方法验证,包括专属性、线性、准确性/重复性和中间精密度。结果 专属性：高浓度两种基质加标回收率分别为112%,110%,低浓度两种基质加标回收率分别为104%,109%。线性：在0.125～1.000 IU/mL范围内,标准品/样品的浓度和凝固时间之间的相关系数r均>0.99。准确性/重复性：两种基质回收率分别为104%、102%,RSD分别为2.4%、1.9%。中间精密度：两种基质人员因素P值分别为0.72、0.23,日期因素P值分别为0.79、0.85,RSD_12次分别为4.2%、3.0%。两种基质检测结果比对：6批重组人凝血因子Ⅷ(rFⅧ)检测结果差异均≤5%,两种检测基质的检测结果无明显差异。结论 两种检测基质均具有良好的专属性、线性、重复性、准确性及中间精密度,适用于重组人凝血因子Ⅷ(rFⅧ)产品的效价检测。     

人凝血因子Ⅷ制品配方研究

目的摸索一种适用于人凝血因子Ⅷ制品的配方。方法以人凝血因子Ⅷ质量为指标,进行成分筛选实验,对选定的成分再进行剂量选择,获得最终配方、制备成品。进行质量与安全性、稳定性考察,评估最终配方的效果。结果得到的配方效果令人满意,经稳定性(2~8℃、24个月;25℃、24个月;40℃、6个月)考察证明配方稳定有效。结论研发出一种适合人凝血因子Ⅷ制品的配方。     

不同制备方法对新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ活性含量的影响

目的 探讨一次成浆与二次成浆法对制备出来的血浆中凝血因子Ⅷ活性含量的影响.方法 对新鲜采集的全血离心分离血浆并在8 h内冻结成块,然后在37℃水浴中复溶后测定两种方法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量.结果 一次成浆法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量为0.70±0.16 IU/ml,二次成浆法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量为0.84±0.16 IU/ml.结论 两种方法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量差异有统计学意义(P＜0.05),二次成浆法比一次成浆法制备出来的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的活性含量要高,值得推广使用.     

凝血因子Ⅷ活性的调节

本文就ｖＷＦ、蛋白水解酶和生物膜等调节ＦⅧ活性作一文献综述。ｖＷＦ保护ＦⅧ并直接影响其活性，ＦⅧ和ｖＷＦ的氨基酸结构决定了它们之间的相互作用。蛋白水解酶通过裂解ＦⅧ特定区域而使ＦⅧ活化或失活。与血小板膜上的磷脂结合则是ＦⅧ活化所必需的。     

人凝血因子Ⅷ活性测定中2种APTT试剂的比较

目的：比较进口与自制APTT试剂，在FⅧ：C检测中的应用，方法：人凝血因子Ⅷ活性测定一期法。结果：自制APTT试剂在性能上与进口APTT试剂差异无显著性，相关系数(r)均值分别为0．994，0．995；样品重复测定变异系数（CV％）均值为4．22，4．84；样品稳定性CV（％）均值为1．36，1．46，结论：自制APTT试剂亦能用于FⅧ制品生产的质量监控以及止血与血栓的研究。     

中国市场人凝血因子Ⅷ质量分析

目的考察了5种、11个批次的中国市场人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品,分析相关制品的成份。研究对国内制品的有效性和安全性做出评估,为建立新的制品质量标准提供理论依据。方法选用S公司人FⅧ、CSL Alevi-ate、+公司人FⅧ、L公司人FⅧ和Bayer KogenateFS,通过FⅧ测定进行制品活性评估,通过FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ分析杂质蛋白含量,用3种不同蛋白测定方法测定制品总蛋白含量;初步评价von Willebrand Factor(vWF)活性,并用非还原和还原SDS-PAGE电泳分析纯度。结果不同制品在活性检测、蛋白含量测定和电泳纯度评估中均有不同的表现差异。结论不同的工艺制备流程导致不同的制品质量;凝血因子类制品测定不同的方法、设备和检测试剂盒都对数值造成不确定性;甘氨酸影响Bradford法总蛋白含量测定,目前考察的几种FⅧ的关键性质量参数-比活性均大于WHO高纯度(10 IU/mg)和2010版中国药典(1IU/mg)的要求。     

凯氏定氮法和 Lowry 法测定人凝血因子Ⅷ制剂中蛋白含量的比较

目的：探讨适宜的人凝血因子Ⅷ制剂中蛋白含量测定方法。方法分别应用《中国药典》三部（2010年版）中凯氏定氮法和 Lowry 法测定人凝血因子Ⅷ制剂中的蛋白含量,比较两种方法的稳定性,并以甘氨酸为干扰物质,考察甘氨酸对 Lowry 法的干扰作用。结果两种方法在各自适合的测定范围内,凯氏定氮法的准确度优于Lowry 法,在测定人凝血因子Ⅷ制剂中的蛋白含量时,凯氏定氮法的回收率 RSD 明显高于 Lowry 法。结论Low-ry 法易操作,结果稳定,灵敏度较高,较凯氏定氮法更适合于人凝血因子Ⅷ制剂中的蛋白含量测定。但甘氨酸可干扰 Lowry 法的测定结果,随着甘氨酸含量的增加,干扰作用明显增强。     

人凝血因子Ⅷ几种冻干保护剂的比较

目的探讨不同冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品在冻干及干热(100℃,30min)过程中的作用。方法同批次人FⅧ样品在相同冻干条件及一定保护剂(0.3%甘氨酸、1.5%蔗糖、1.0%白蛋白)组成的基础上,改变甘氨酸、蔗糖、白蛋白、木糖醇和精氨酸5种冻干保护剂的含量或种类,组合成6组配方,对不同配方冻干及干热后FⅧ制品外观、复溶后澄清度及FⅧ活性等进行分析比较。结果Ⅰ组(3%甘氨酸):冻干和干热后制品成形最好,但复溶后均有少量絮状物;Ⅱ组(5%蔗糖):冻干和干热后制品均萎缩,冻干过程部分制品水份未抽干,冻干后澄清度较好,干热后部分有少量絮状物;Ⅲ组(2%白蛋白):冻干和干热后制品成形较好,但复溶后均有絮状物;Ⅳ组(5%木糖醇):冻干后制品萎缩,复溶后澄清度最好,干热后膨胀,复溶后有大量絮状物;Ⅴ组(1.2%精氨酸):冻干和干热后制品萎缩,但复溶后澄清度均较好;Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸):冻干后制品膨胀,复溶后澄清度较好,干热后进一步膨胀,复溶有大量絮状物。各组冻干后FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率均较高(≥84.2%);干热后差别明显,其中Ⅲ组(2%白蛋白)FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率最高(≥90.4%),而Ⅳ组(5%木糖醇)和Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸)FⅧ活性≤0.94 IU/ml,回收率极低(≤9.8%)。结论在冻干及干热过程中不同冻干保护剂作用差异较大,甘氨酸赋形作用较好,精氨酸对制品中蛋白稳定作用明显,白蛋白对FⅧ活性保护作用最佳;较高浓度的蔗糖不利于冻干过程中水份的去除,木糖醇不适于作为需100℃干热处理的人FⅧ冻干保护剂。     

测定凝血因子Ⅷ促凝活性的实验条件优化

凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）促凝活性（ＦⅧ∶Ｃ）测定是确诊甲型血友病的主要方法,也是ＦⅧ制品（如冷沉淀、中纯ＦⅧ等）研制、开发和质控不可缺少的手段之一。但ＦⅧ∶Ｃ测定是一个受多种因素影响的实验。笔者参考文献［１,２］的测定方法,并以凝血实验的温育曲线稳定性为指...     

血浆凝血因子Ⅷ抗原及活性的测定

目的建立血浆FⅧ抗原及活性定量测定的方法.方法对46例正常人及两个遗传性FⅧ缺陷症家系部分成员采用双抗体夹心法检测FⅧ抗原,生物素化戊胺测定FⅧ活性,以FⅧ标准品建立标准曲线.结果 3例患者FⅧAAg均为0%,FⅧBAg分别为正常人的78.46%、66.43%、57.29%.46例正常人血浆FⅧ活性FⅧC平均值为86.34%±17.98%,范围在56.5%～165.17%之间,3例患者为0%,家系中杂合子范围为29.60%～104.86%.结论 双抗体夹心法和生物素标记法均为简捷、灵敏而且特异的FⅧ测定方法.     

注射用重组人凝血因子Ⅷ治疗血友病A的护理

目的探讨注射用重组人凝血因子Ⅷ(拜科奇)治疗血友病A的护理方法和要点。方法通过对7例血友病A患者31次使用注射用重组人凝血因子Ⅷ进行治疗时,予心理护理、药物配制、用药观察以及健康教育等护理干预。结果 7例血友病A患者31次使用注射用重组人凝血因子Ⅷ治疗,均未见不良反应。结论在使用注射用重组人凝血因子Ⅷ治疗中,加强药物及患者的护理,可减少不良反应,提高患者的治疗依从性与治疗效果。     

凝血因子Ⅷ、Ⅸ同时缺乏1例

凝血因子Ⅷ和Ⅸ(FⅧ：C、FⅨ：C)主要在肝脏中合成．参与机体内源性凝血机制。当FⅧ：C、FⅨ：C缺乏时会引起一系列出血症状。临床上常见单一的FⅧ：C或FⅨ：C缺乏．而两者同时缺乏极为罕见。近期笔者发现1例FⅧ：C、FⅨ：C同时缺乏患者。报告如下。     

凝血因子Ⅷ与血栓性疾病研究进展

血栓性疾病是涉及多系统、多因素、多环节的循环血液中出现异常动脉或静脉栓子而导致血运障碍的综合性疾病。凝血因子Ⅷ是参与Ⅸa对因子Ⅹ激活的辅因子，它在许多疾病及病理状态下增高，其与血栓性疾病的关系成为又一研究热点。     

L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ基因表达的影响

目的研究L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因转录及表达的影响。方法将B结构域（氨基酸760～1639）缺失的人FⅧcDNA（BDDhFⅧcDNA）插入至质粒载体pcDNA6／V5-HisA，构建重组载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ，转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h后，用ELISA方法检测细胞上清液中的人FⅧ抗原（FⅧ：Ag），一期凝血酶法检测FⅧ的促凝活性（FⅧ：C）。用Northern blot检测HUVEC中人FⅧ基因的转录。用PCR扩增BDDhFⅧcDNA的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因，分别插入至pcDNA6／V5-HisA，构建五种载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ-A1、pcDNA6／V5-BDDhF Ⅷ-A2、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-A3、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C1和pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C2，分别转染HUVEC后，加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h。膨胀裂解法分离细胞核，进行细胞核连缀（Run-on）反应，狭线印迹杂交检测A1、A2、A3、C1和C2结构域基因的转录。结果经L-精氨酸诱导后，HUVEC中人FⅧ基因表达明显增强[FⅧ：Ag为（146．08±4．78）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．752±0．009）U／ml]，约是未经L-精氨酸诱导[FⅧ：Ag为（34．66±3．98）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．171±0．006）U／ml]的4倍（P〈0．01）。Northern blot检测显示，加L-精氨酸培养之后，HUVEC中人BDDFⅧ mRNA的转录也较未加L-精氨酸显著增强，而只转染pcDNA6／V5-HisA的HUVEC中无人BDDFⅧ mRNA的转录存在。Run-on及狭线印迹杂交显示，加L-精氨酸培养后，A1和A2结构域基因的转录均较未经L-精氨酸诱导者明显增强，也显著强于A3、C1和C2结构域基因的转录，而A3、C1和C2结构域基因的转录在L-精氨酸诱导前后均无明显变化。结论L-精氨酸通过促进人FⅧ的A1和A2结构域基因的转录进而增强FⅧ在体外的转录和表达，因而在血友病A的基因治疗研究中，L-精氨酸是一个很有前途的诱导FⅧ转录和表达的物质。     

人凝血因子Ⅷ cDNA 体外真核表达的初步研究

目的：建立人凝血因子ⅧｃＤＮＡ体外真核高效表达的体系。方法：将人ＦⅧＢ区大部分缺失（Δａ７６０１６３９）的ＦⅧｃＤＮＡ插入ｐＣＩ真核表达载体、ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶ载体和逆转录病毒载体ｐＭＳＣＶ，构建了５种表达框架，在体外转染和感染了多种靶细胞。结果：ｐＣＩⅧ在ＮＩＨ３Ｔ３细胞产生了低水平表达，而ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶⅧ和ｐＭＳＣＶⅧ系列分别在Ｈｅｌａ细胞和Ｂｏｓｃ２３逆转录病毒包装细胞中呈较高水平的表达。Ｂｏｓｃ２３细胞培养上清感染的ＮＩＨ３Ｔ３和３２ＤＣ不能有效地产生ＦⅧ。结论：在ＦⅧ体外表达及基因治疗的方案设计中，靶细胞的选择是一重要因素。     

人凝血因子Ⅷ新型离子交换树脂的筛选及吸附性能的研究

目的筛选对人凝血因子Ⅷ吸附效果较好的新型离子交换树脂,研究其吸附性能。方法将初始浓度为(20±1)IU/ml的冷沉淀提取液,恒温摇床振荡吸附2 h,测定吸附后上清液中蛋白浓度及FⅧ活性,通过蛋白吸附量及FⅧ活性吸附率,获得人FⅧ吸附效果较好的树脂;P-15与A-15树脂相同条件下吸附FⅧ,计算FⅧ的活性吸附率以及蛋白吸附量,考察树脂骨架对吸附的影响,同种方法考察树脂孔径大小对吸附的影响;测定吸附过程中吸附液中蛋白浓度的变化,得到吸附动力学曲线,从而确定吸附速率。分别改变A-15树脂用量、吸附温度、冷沉淀粗提液的pH值以及NaCl浓度,计算FⅧ的活性吸附率以及蛋白吸附量,考察树脂用量、温度、pH值、NaCl浓度对吸附的影响。结果 A-15树脂对FⅧ的活性吸附率为(78.76±4.2)%,蛋白吸附量(77.32±3.8)mg/g;A-15树脂未接基团时对FⅧ的活性吸附率为(12.34±5.6)%,蛋白吸附量为(18.68±5.3)mg/g;随着孔径的增大,树脂对FⅧ的活性吸附率和蛋白吸附量均为先增大后减小;树脂为1.25 g时,即可满足对FⅧ的吸附要求;吸附速率常速为0.003 56 g/mg.min;摇床温度为25～30℃、pH值为6.5～7.0、NaCl浓度为(0.1～0.2)mol/L时为较佳吸附条件。结论 A-15树脂对人凝血因子Ⅷ的吸附效果较好,在较佳吸附条件下,树脂对FⅧ的活性吸附率为78±4%,蛋白吸附量为(77±4)mg/g。