三七总皂苷抑制K562细胞mTOR信号通路活性的实验研究

目的 探讨三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对体外培养K562细胞mTOR信号通路相关分子表达及活性的影响.方法 不同浓度的PNS(50～800 μ,g/mL)干预体外培养K562细胞24 ～ 72 h后,MTT比色法检测PNS对K562细胞增殖的抑制作用;AO/EB双荧光染色法观察细胞死亡及凋亡状况;RT-PCR检测mTOR、p70S6K、4E-BP1 mRNA表达变化;Western blot检测mTOR、p70S6K、4E-BP1及p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1蛋白表达量的变化.结果 与对照组相比,浓度为100～ 800 μg/mL的PNS能够抑制K562细胞增殖(P＜0.05),促进K562细胞凋亡及死亡(P＜0.05),PNS对K562细胞72 h的IC50为(229.07±2.36) μg/mL;100、200、400 μg/mL PNS作用于K562细胞72 h后mTOR蛋白表达量及mRNA表达量降低(P＜0.05),且磷酸化蛋白p-mTOR (Ser2448)、p-p70S6K (Thr229/389)及p-4E-BP1(Thr37/46)表达水平也随着药物浓度的增加而降低(P＜0.05).结论 PNS能够抑制K562细胞mTOR信号通路的活性,这可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一.     

栀子苷对PDGF诱导的HSC-T6增殖活化的影响

目的探讨栀子苷抑制血小板衍生生长因子(PDGF)介导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化的作用及其可能机制。方法培养 HSC-T6,体外给予不同浓度(20、50、100、200、400μg/ml)的栀子苷,通过MTT法检测细胞的活力;选取20、50、100μg/ml的栀子苷, PDGF刺激后,采用MTT、实时定量PCR( qRT-PCR)和Western blot 法检测细胞增殖和细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;进一步采用Western blot 法检测栀子苷对MAPK通路蛋白 P-ERK、P-p38和 Akt/mTOR/p70S6K 通路蛋白的表
　　达。结果栀子苷可以抑制PDGF诱导的HSC-T6的增殖和减少活化标志物α-SMA的表达,并且明显抑制 Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化水平,但是对ERK、p38活化水平无显著影响。结论栀子苷可以抑制PDGF诱导的HSC-T6的增殖与活化,可能起到抗纤维化的作用,这一作用的产生可能与Akt/mTOR/p70S6K通路有关。     

角蛋白18磷酸化与奥沙利铂作用下结肠癌HCT116细胞凋亡的关系

目的 探讨在化疗药物作用下角蛋白18(K18)磷酸化与结肠癌HCT116细胞凋亡的关系.方法 以不同浓度的奥沙利铂作用于HCT116细胞,Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术和钙黄绿素-AM/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)法检测细胞凋亡情况,免疫印迹(western blotting)方法检测K18磷酸化表达水平;HCT116细胞分别转染绿色荧光蛋白(GFP)、野生型K18和33、52丝氨酸(Ser33A、Ser52A)磷酸化位点突变的K18质粒后,用奥沙利铂处理,Annexin V-FITC/PI和Calcein-AM/PI法分析K18及其突变对细胞凋亡的影响.结果 奥沙利铂可以使HCT116细胞发生明显的凋亡,而且凋亡比例随着药物浓度的增加而升高,经20、60、100 μmol/L奥沙利铂处理后,细胞较对照组均出现凋亡增加,依次为(15.6±3.1)％、(30.1±4.9)％和(62.6±6.8)％,两两比较差异均有统计学意义(P均＜ 0.05);K18的Ser33、Ser52磷酸化水平也随着药物浓度的增加而增加;单纯质粒转染的各细胞组之间的凋亡率差异均无统计学意义(P＞0.05),但经过奥沙利铂处理后,Ser33A和Ser52A质粒转染的HCT116细胞的凋亡率[(27.3±6.7)％和(31.2±8.1)％]明显低于GFP和K18质粒转染的细胞凋亡率[(40.5±4.8)％和(50.9±6.3)％,P＜0.05],转染K18质粒组的HCT116细胞的凋亡率高于GFP转染对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);Ser33A和Ser52A质粒转染组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 K18 Ser33和Ser52磷酸化水平随着细胞凋亡水平的增加而增加;K18过表达提高了HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性,而抑制K18 Ser33和Ser52的磷酸化可以减少化疗药物作用下结肠癌细胞的凋亡.     

miR-145通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性

目的探究miR-145调控非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞生物学特性及对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的影响。方法将A549细胞分为miR-145组、对照组、miR-145抗体组和对照抗体组。采用LipofectamineTM 2000转染试剂盒进行质粒转染,行MTT、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭检测,Western blotting检测分析雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、真核细胞翻译起始因子(eIF4E)、磷酸化eIF4E(p-eIF4E)、核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)、S6核糖体蛋白(S6)、磷酸化S6(p-S6)、eIF4E结合蛋白1(4E-BP)、磷酸化4E-BP(p-4E-BP)水平。结果对照组和对照抗体组细胞miR-145表达和细胞凋亡水平差异无显著性(P＞0.05),但与miR-145组和miR-145抗体组比较有明显差异,其中miR-145组最高,miR-145抗体组最低(P＜0.05)。对照组和对照抗体组细胞增殖、迁移、侵袭活性,以及p-mTOR/mTOR、p-eIF4E/eIF4E、p-p70S6K/p70S6K、p-S6/S6、p-4E-BP/4E-BP表达水平差异无显著性(P＞0.05),但与miR-145组和miR-145抗体组比较有明显差异,其中miR-145组最低,miR-145抗体组最高(P＜0.05)。结论miR-145可通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖活性、迁移能力及侵袭能力。     

shRNA沉默VEGF基因表达对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的观察Pavu6 27-VEGF siRNA重组体在细胞体内表达的VEGF短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人大肠癌HCT116细胞株生物学特性的影响.方法将自行构建的表达短发夹状RNA的重组质粒转染到大肠癌HCT116细胞株中,以空质粒Pavu6 27转染为对照,经G418筛选出稳定表达shRNA细胞,行RT-PCR检测VEGF-mRNA表达的改变,Western blot检测VEGF蛋白表达,流式细胞技术分析细胞周期分布,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果成功转染重组体的HCT116细胞中VEGF-mRNA表达明显下降,约降低为对照组的61.2%(P＜0.05).VEGF蛋白表达明显下降,光密度分析比较差异有显著性(P＜0.05).G0/G1期细胞比例增高,另一方面S期和G2/M期细胞比例降低,细胞的增殖指数明显降低,实验组细胞增殖指数为(25.63±4.54)%,对照组细胞的增殖指数为(31.90±2.19)%(P＜0.05).结论Pavu6 27-VEGF siRNA重组体在细胞内表达的短发夹状RNA能有效抑制人大肠癌细胞VEGF-mRNA和VEGF蛋白表达,细胞增殖能力减弱,为质粒介导的RNAi技术运用于大肠癌的基因治疗提供一定的实验依据.     

竹节香附素A调控mTOR通路对肠癌HCT116细胞自噬及凋亡的影响

目的 探讨竹节香附素A(RA)抑制HCT116细胞的增殖及其相关机制.方法 利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测RA对HCT116细胞的增殖抑制;流式细胞术(FCM)检测RA对细胞凋亡的影响;透射电镜观察RA诱导自噬;Western blot检测凋亡、自噬相关蛋白表达.结果 RA能够明显抑制HCT116细胞的增殖,并呈浓度、时间依赖性.透射电镜观察到双层膜自噬体的存在;FCM显示RA能够诱导HCT116细胞凋亡,且随着浓度的增大凋亡率增加.Western blot检测显示,自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达增高;抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少;而促凋亡蛋白Bax,凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)表达增加;RAPA靶蛋白(mTOR)信号通路中mTOR蛋白表达增加,磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达减少.加入mTOR通路抑制剂雷帕霉素(RAPA)后Beclin-1、LC3蛋白表达增加,凋亡率增加,且Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达也增加.结论 RA能够抑制肠癌细胞HCT116的增殖;并能诱导细胞自噬和凋亡,其机制可能是通过调控mTOR信号通路实现.     

黄芩苷对胰岛细胞瘤细胞系增殖的影响

目的：探讨黄芩苷对胰岛细胞瘤细胞的影响及其分子机制。方法：应用光学显微镜、MTT测定、流式细胞仪和Western blotting等方法,研究 0,100,200,400μg/ml黄芩苷处理胰岛细胞瘤细胞24h,或200μg/ml黄芩苷处理胰岛细胞瘤细胞不同时间后,黄芩苷对细胞增殖速度、细胞存活率、细胞周期分布的影响。结果：随黄芩苷浓度增加,细胞增殖受到抑制,细胞的生存率逐渐下降;随着黄芩苷作用时间的延长,细胞的生存率也逐渐下降;流式细胞仪结果显示,随着黄芩苷处理浓度增加,S 期细胞明显减少,从38.2％ ( 0μg/ml)下降至9.4％ (400μg/ml),G0/G1期细胞所占百分率增加,从56.4％(0μg/ml)上升至85.9％(400μg/ml),细胞出现G1阻滞。同时,Western blotting结果显示细胞周期蛋白cyclin D1表达显著下调。结论：黄芩苷能抑制胰岛细胞瘤细胞株增殖;黄芩苷诱导所致细胞周期蛋白cyclin D1表达下调在其中起着重要作用。     

野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas和FasL表达的影响

目的:观察野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas和FasL表达的影响.方法:体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞分为对照组、不同浓度野黄芩苷药物组,野黄芩苷组分别用80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48h.采用免疫细胞化学法观察野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞Fas和FasL表达的影响.结果:用药组Tca8113细胞Fas和FasL的表达水平明显高于对照组(P＜0.05);并且随着野黄芩苷药物浓度的增加,Fas和FasL的表达水平逐渐升高(P＜0.05).结论:野黄芩苷可能通过促进人舌鳞癌Tca8113细胞Fas蛋白和FasL蛋白的表达促进肿瘤细胞凋亡.     

白藜芦醇抑制人结肠癌细胞增殖及其与PTEN的关系研究

目的 研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及可能的机制.方法 采用结晶紫染色、流式细胞术和Western blot分析Res对HCT116细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术和免疫荧光分析Res对HCT116细胞凋亡的促进作用;采用Western blot和PCR分析Res对HCT116细胞内Aktl/2及PTEN表达水平的影响;通过重组腺病毒介导的PTEN过表达或沉黙表达,分析Res抑制HCT116细胞增殖及其与PTEN的关系.结果 与对照组相比,Res处理组HCT116细胞增殖受到抑制(P ＜0.05,P＜0.01),G1期细胞比例也随Res浓度增加而升高,同时PCNA蛋白表达水平下降;流式细胞术分析结果显示,Res能明显促进HCT116细胞凋亡;Western blot和PCR分析结果显示,Res对Akt1/2 mRNA表达无明显影响,但能降低Akt 1/2的磷酸化水平,同时促进PTEN表达.外源性过表达PTEN能增强Res对HCT116细胞的增殖抑制作用(P＜0.01),而沉黙PTEN表达能部分逆转Res对HCT116细胞增殖的抑制作用(P＜0.01).结论 Res对HCT116细胞增殖具有抑制作用,并能促进其凋亡;Res的这种作用可能与其促进PTEN表达,抑制PI3K/Akt活化有关.     

LY294002通过PI3K/Akt/Mtor对CD133+CD44+结直肠癌干细胞自我更新、增殖能力的影响

目的:探讨LY294002对CD133+CD44+结直肠癌干细胞自我更新、增殖能力的影响及其机制.方法: 通过流式细胞术从人结直肠癌HCT116细胞中分选CD133+CD44+的肿瘤干细胞(CSCs),不同浓度(10、20、30 μmol/L)LY294002作用CSCs,对照组不使用药物.成球实验及有限浓度稀释法检测细胞自我更新能力,细胞活性计数法及平板克隆实验检测增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR及流式细胞术检测PI3K/Akt/mTOR信号通路基因Akt、磷酸化Akt、诱骗受体3(DcR3)、B淋巴细胞瘤-2(Bc--2)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达变化.结果: 与对照组相比,30 μmol/L LY294002作用实验组成球能力明显削弱(P＜0. 01),CSCs比例明显下降(P＜0. 05),增殖能力明显削弱(P＜0. 01),G0G1期细胞周期受到阻滞(P＜0. 01);磷酸化Akt表达降低(P＜0. 01),DcR3、Bcl-2、mTOR及Cyclin D1表达量下调(P＜0. 01).结论: LY294002可能通过PI3K/Akt/mTOR通路导致结直肠癌CSCs周期阻滞、抑制其自我更新、增殖能力.