姜黄素抑制肾癌ACHN细胞增殖及促凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对人肾癌ACHN细胞株增殖及细胞凋亡的影响,探讨姜黄素诱导ACHN细胞株凋亡的作用机制。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌ACHN细胞24 h后,应用MTT比色法检测姜黄素对人肾癌ACHN细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;RT-PCR检测姜黄素对ACHN细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65 mRNA表达的影响;Western blot方法检测其对细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65I、κB蛋白表达的影响。结果姜黄素对人肾癌ACHN细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞24 h后,Bcl-2、NF-κBP65 mRNA水平下降,Bax mRNA水平升高(P0.05),Bcl-2、NF-κBP65蛋白表达量下降,BaxI、κB蛋白表达量升高(P0.05)。结论姜黄素通过上调IκB,下调NF-κB活性,调控凋亡基因Bcl-2/Bax的表达,抑制人肾癌ACHN细胞的增殖,诱导人肾癌ACHN细胞的凋亡。     

胡黄连苷Ⅱ通过线粒体途径诱导肾癌细胞凋亡的实验研究

目的研究胡黄连苷Ⅱ(picrosideⅡ)对人肾癌ACHN细胞凋亡的影响及作用机制。方法将体外培养的肾癌ACHN细胞分为对照组、不同浓度胡黄连苷Ⅱ(1μg/mL、10μg/mL及100μg/mL)组,采用CCK-8法测定细胞增殖率,采用Hoechst 33258核染色法和Annexin V/PI检测细胞凋亡,采用Western blot法检测肾癌ACHN细胞内Bax及Bcl-2蛋白表达。结果不同浓度的胡黄连苷Ⅱ能抑制肾癌ACHN细胞生长并诱导细胞凋亡,随着胡黄连苷Ⅱ作用浓度的递增,肾癌ACHN细胞凋亡率呈剂量依赖性递增;胡黄连苷Ⅱ作用后,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达下降。结论胡黄连苷Ⅱ通过改变线粒体凋亡途径中凋亡相关信号分子Bax及Bcl-2的表达,抑制肾癌ACHN细胞增殖并促进细胞凋亡。     

新型多靶点药物ZD1839对鼻咽癌细胞CNE2放射敏感性研究

目的:研究ZD1839对鼻咽癌细胞株CNE2放射增敏作用.方法:采用MTT法测定ZD1839的半教抑制浓度(IC50),克隆形成实验计算细胞存活率,拟合生存由线,流式细胞仪检测ZD1839联合放疗的凋亡率及细胞周期分布.结果:单药组,CNE2细胞的存活率ZD1839浓度的增加而降低,其IC50约为2.26μmol/L.联合组,ZD1839作用CNE2细胞24h后均见到放射增敏作用,增敏比为1.529士0.135.ZD1839或照射均可增加凋亡率,减少S期细胞比例及增加G2/M期细胞比例(P＜0.01).结论:ZD1839联合电离辐射可提高鼻咽癌细胞的放射敏感性,其机制之一可能是ZD1839促进细胞凋亡、干扰细胞周期分布及下调Bcl-2蛋白表达.     

瑞芬太尼通过抑制AKT/mTOR通路阻碍肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的:研究瑞芬太尼对肾癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响以及潜在机制.方法:常规培养的ACHN细胞作为参照,噻唑蓝(MTT)实验检测不同浓度瑞芬太尼(1、10、50、100μmol/L)作用的ACHN细胞的增殖;流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;Transwell实验检测细胞侵袭、迁移,蛋白质印迹法(Western Bl...     

姜黄素通过PPAR-γ途径促进人肾癌细胞的调亡

目的观察姜黄素对人肾癌细胞株A498细胞增殖和凋亡的影响,并探讨PPAR-γ途径在其中的作用。方法姜黄素(10、50、100μmol/L)处理A498细胞12、24、48h。采用MTT法测定细胞活力,并计算肿瘤细胞抑制率,流式细胞术测定细胞凋亡。实时定量PCR和Western Blot分别检测Bcl-2、Bax及PPAR-γmRNA和蛋白的表达。观察PPAR-γ阻断剂GW9662对姜黄素作用的影响。结果姜黄素(10、50、100μmol/L)分别处理人肾癌细胞株A498细胞24、48、72h后,以浓度和时间依赖的方式抑制细胞增殖促进细胞凋亡,同时以浓度依赖的方式下调了A498细胞中Bcl-2的表达,增加了Bax和PPAR-γ的表达。GW9662部分地消除了姜黄素对A498细胞增殖和凋亡的影响。结论姜黄素抑制人肾癌细胞增殖促进其凋亡,其机制涉及到PPAR-γ途径。     

β-榄香烯对肾癌放疗增敏相关基因表达谱的影响

目的探讨β-榄香烯对肾癌GRC-1细胞体外放射增敏相关基因表达谱的影响。方法体外培养GRC-1细胞,MTT法检测不同放射剂量(0、50、100、150及200 cGy)下,不同浓度β-榄香烯(空白组、空白乳组及10、20、30、40、50、60、70、80以及90μg/mlβ-榄香烯组)对GRC-1细胞体外生长的影响。流式细胞仪检测单纯放疗组(空白组,150 cGy)和放疗增敏组(20μg/mlβ-榄香烯,150 cGy)细胞周期变化与凋亡。选取包含4096个cDNA基因表达谱芯片分析2组间基因谱表达差异。结果β-榄香烯在20μg/ml时对GRC-1细胞有体外放射增敏作用。对肾癌细胞G2M阻滞作用随时间增加而增强,24 h时凋亡率为17.26%,48 h时作用达最高峰,凋亡率为24.34%。随时间和照射剂量增加细胞凋亡水平增高。基因芯片筛选出2组间差异表达基因360条,上调基因265条、下调基因95条。结论β-榄香烯乳对肾癌细胞的放疗增敏作用可能涉及原癌、抑癌基因等多种相关基因的变化,是一个多基因参与的复杂事件。     

日达仙诱导肾癌细胞株ACHN细胞凋亡的实验研究

目的：探讨日达仙诱导肾癌细胞株ACHN凋亡的抗肿瘤作用的机制.方法：以浓度50～400 mg/L日达仙作用肾癌ACHN细胞24～72 h后,用MTT比色法检测细胞生长活性,用单细胞凝胶电泳法和流式细胞仪分别检测ACHN细胞DNA损伤和凋亡的情况.结果：日达仙能显著抑制肾癌细胞株ACHN细胞的体外生长,呈时间与剂量依赖性;日达仙诱导肾癌细胞株ACHN凋亡.结论：日达仙通过抑制肾癌细胞株ACHN增殖、诱导细胞凋亡等机制,显著抑制肾癌细胞的体外生长.     

纳洛酮预处理对吗啡抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的影响

目的观察纳洛酮预处理对吗啡抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的影响。方法人乳腺癌MCF-7细胞培养至对数生长期,采用随机数字表法,将其分为四组:空白对照组(C组),10μmol/L吗啡组(M组),10μmol/L纳洛酮组(N组)及10μmol/L吗啡+10μmol/L纳洛酮组(MN组)。M组在培养液中加入吗啡,使吗啡的终浓度为10μmol/L;N组在培养液中加入纳洛酮,使其终浓度为10μmol/L;MN组则先在培养液中加入纳洛酮,使其浓度为10μmol/L,孵育30min后再将吗啡加入培养液中,使其终浓度为10μmol/L;对照组不加入任何药物。采用四唑盐(MTT)法和克隆形成实验观察细胞生长增殖的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率。结果C组与N组细胞活力、克隆形成率、细胞周期分布及细胞凋亡率差异无统计学意义;M组及MN组细胞的生长速度明显慢于C组,克隆形成率、细胞停滞在S期的比例明显低于C组,而细胞凋亡率、细胞停滞在G2/M期的比例明显高于C组(P0.05);M组与MN组细胞活力、克隆形成率、细胞周期分布及细胞凋亡率差异无统计学意义。结论在吗啡抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长增殖、促进细胞凋亡的过程中,纳洛酮没有发挥拮抗作用,这说明吗啡抑制乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的作用与阿片受体途径无关。     

3′,5-二甲酰和厚朴酚诱导人肾癌NC-65细胞凋亡作用研究

目的:通过体外研究厚朴酚衍生物3′,5-二甲酰和厚朴酚(3a)对人肾癌NC-65细胞增殖、凋亡及相关蛋白水平的影响,探讨3a诱导凋亡、抑制肾癌细胞增殖的作用机制。方法:采用CCK-8法检测3a对NC-65细胞生存率的影响;通过Hoechst 33342染色法观察3a刺激细胞24 h后细胞形态学的改变;利用流式细胞术观察3a刺激后细胞凋亡以及周期变化;蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测细胞凋亡及周期相关蛋白的表达水平改变。结果:3a对人肾癌NC-65细胞有明显抑制增殖的作用,呈剂量依赖;3a可使NC-65细胞周期阻滞于G_0/G_1期;经药物处理后,细胞凋亡率随3a浓度增加呈上升趋势;凋亡相关蛋白Bax、活化的caspase-9、caspase-3蛋白以及抑癌蛋白p53等均表达上调。结论:3a可抑制人肾癌NC-65细胞的增殖,导致细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,其机制可能与调节凋亡及周期相关蛋白的表达有关。     

姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3及血管内皮生长因子的影响

目的:研究姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3细胞体外作用及其对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法:分别用0、6.25、12.5、25、50μmol/L浓度的姜黄素作用于PC-3细胞,12、24、36、48、72、96h后台盼蓝拒染法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长活性;24h后流式细胞仪测定细胞周期及凋亡的变化,透射电镜观察细胞超微结构变化;半定量RT-PCR法检测PC-3细胞内VEGFmRNA的表达;ELISA检测细胞上清液中VEGF浓度。结果:姜黄素能显著抑制PC-3细胞的增殖,呈剂量与时间依赖性,不同浓度姜黄素组之间及不同时间组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。不同浓度姜黄素诱导PC-3细胞出现剂量依赖性G2/M期阻滞(P<0.01),且各浓度组凋亡细胞比例均显著高于空白对照组(P<0.01),差异有统计学意义;姜黄素作用24h后PC-3细胞出现凋亡的形态学改变;PC-3细胞内VEGF mRNA的表达和细胞上清液中VEGF呈剂量依赖性降低。结论:姜黄素能显著抑制体外PC-3细胞的生长,并促进其G2/M期阻滞和凋亡,VEGFmRNA及蛋白的表达也明显降低,可能是其抑制肿瘤和血管生长的机制之一。     

Introducing the clusterin gene into human renal cell carcinoma cells enhances their metastatic potential

PURPOSE: We recently reported a protective role of clusterin expression against apoptosis induced by a wide variety of stimuli in several human cancer models. In the current study we tested the hypothesis that clusterin over expression confers a benefit for the metastasis of renal cell carcinoma through the inhibition of apoptosis induced by the various obstacles the cancer cells may confront after detachment from their primary origin. MATERIALS AND METHODS: We introduced clusterin complementary DNA into human renal cell carcinoma ACHN cells, which do not express detectable level of clusterin expression, and generated the clusterin over expressing cell line ACHN/CL and the control vector only transfected cell line ACHN/C. In vitro anti-cell death activity under anchorage independent conditions among ACHN sublines was examined by limiting dilution assay and cell survival assay in suspension. To investigate the in vivo effects of clusterin over expression on metastatic potentials each cell line was injected into the tail vein or renal subcapsule of nonobese diabetic, severe combined immunodeficient mice and the metastatic features in all abdominal and thoracic organs were evaluated. RESULTS: ACHN/CL showed significantly enhanced growth in limiting dilution cultures compared with ACHN/C. The analysis of cell survival in the floating assay also revealed that ACHN/CL had a powerful survival advantage in suspension compared with ACHN/C. Furthermore, ACHN/CL formed more than 5-fold as many metastatic nodules in the lung after intravenous injection than ACHN/C. Similarly more marked lung metastasis was observed after implanting ACHN/CL cells into the renal subcapsule than after implanting ACHN/C cells. In contrast, there were no significant differences among ACHN sublines in the growth rates in vitro and in vivo, cell motility or invasive ability. CONCLUSIONS: These findings suggest that, if clusterin is over expressed, it prolongs cell survival under unfavorable conditions in the metastatic process, resulting in the enhanced metastatic potential of renal cell carcinoma.     

姜黄素抑制人肾癌细胞769-P增殖及促凋亡的实验研究

【摘要】 目的 分析不同浓度姜黄素（curcumin，分子式C₂₁H₂₀O₆）对人肾癌细胞769-P的生物学作用及其调控机制。方法 体外培养人肾癌细胞769-P，用不同浓度姜黄素处理24 h后，采用MTT比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用，利用倒置显微镜观察细胞的显微形态结构，采用细胞划痕法观察细胞的迁移情况；Western Blot 法检测细胞内Caspase-3、 AIF蛋白质的表达情况；用反转录PCR法检测AIF、Bax mRNA的表达水平。结果 MTT法检测显示姜黄素能显著抑制人肾癌细胞系769-P的增殖，呈现浓度和时间效应关系；倒置显微镜结果显示姜黄素能够使肾癌细胞系的形态学发生改变，呈现出典型凋亡特征如核皱缩、核破裂、核肿胀等形态；细胞划痕实验显示，姜黄素抑制了肾癌细胞系的迁移；RT-PCR实验显示，姜黄素促进了BAX mRNA和AIF mRNA的表达；蛋白杂交实验显示，姜黄素促进了Caspase-3和AIF蛋白的活化，从而促进了凋亡。结论 姜黄素能显著抑制人肾癌细胞的增殖并促进其凋亡，这种生物学效应可能与激活Bax和AIF表达，活化Caspase-3的信号通路有关。     

沙利霉素逆转P-gp介导的肾癌ACHN细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨沙利霉素对肾癌ACHN细胞多药耐药的逆转及其机制.方法 实验分为对照组、阿霉素组、沙利霉素组及阿霉素和沙利霉素联合用药组,药物作用24 h后,CCK-8方法 检测肾癌细胞的生长活性,免疫细胞化学法检测肾癌细胞P-糖蛋白(P-gp)的表达情况.结果 10 μg/ml 阿霉素对肾癌ACHN细胞的生长抑制率仅为4.758%.沙利霉素组对肾癌ACHN细胞生长抑制率呈剂量依赖性,并高于阿霉素组(P<0.05),其中以10 μmol/L组抑制率最高(达17.555%).联合用药组的生长抑制率高于沙利霉素组及阿霉素组(P<0.05),以10 μmol/L 沙利霉素 +10 μg/ml 阿霉素组的抑制率最高(达45.447%).与阿霉素组比较,经沙利霉素处理过的肾癌ACHN细胞中的P-gp蛋白表达下降(P<0.05).结论 沙利霉素增强了肾癌ACHN细胞对阿霉素的敏感性,耐药性逆转的机制之一可能与沙利霉素下调癌细胞中P-gp的表达有关.     

siRNA沉默VEGF基因对肾癌细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨siRNA干扰血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾细胞癌细胞株（ACHN）细胞增殖与凋亡的影响.方法：化学合成针对VEGF的小干扰RNA,通过脂质体转染至ACHN中,利用Western印迹法检测细胞内VEGF的表达,采用台盼蓝拒染法测定细胞生长曲线,用MTT比色分析法检测细胞增殖抑制率（IR）,用TUNEL方法检测细胞凋亡率（AR）.结果：生长曲线提示,与空白对照组及阴性对照组相比,siRNA1组、siRNA2组ACHN细胞的生长明显减慢 在24 h、48 h、72 h,siRNA1的增殖抑制率为10.6%、18.0%、27.1%,siRNA2增殖抑制率为18.9%、32.7%、40.3%,均高于空白对照组及阴性对照组（P〈0.05） siRNA1组的细胞凋亡率为10.7%、15.2%、20.3%,siRNA2组的细胞凋亡率为17.3%、26.2%、37.4%,均高于空白对照组及阴性对照组（P〈0.05） siRNA1组、siRNA2组VEGF蛋白表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,其中siRNA2对ACHN细胞的IR、AR和VEGF蛋白表达的抑制作用均显著高于siRNA1组（P〈0.05）.结论：VEGF在肾癌的发生发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA能特异性抑制肾细胞癌ACHN细胞株中VEGF的表达,抑制细胞生长增殖,促进细胞凋亡.对于VEGF基因高表达的肾细胞癌患者,针对VEGF的RNAi技术有望成为肾细胞癌新的基因治疗手段.     

Study on chemosensitivity of colony forming cells

We suspect a difference between the effective rate of human tumor clonogenic assay (HTCA) and that of clinical chemotherapy against renal cell carcinoma. We investigated the sensitivity of ACHN, the cell line of renal cell carcinoma, and its colony forming cells (dividing cells) obtained on double soft agar against vincristine sulphate (VCR). In addition, PC-3, a cell line of prostatic carcinoma, and HeLa, cell line of cervicar carcinoma, were investigated. We obtained the results that each colony forming cells had higher sensitivity than each parent cells against VCR in the growth activities and the DNA synthesis measured by the uptake of 3H-thymidine. Because the cells targeted by HTCA are dividing cells, they are oversensitive compared with the true sensitivity of tumors.     

表皮生长因子受体表达及其下游基因突变与结直肠癌细胞放射敏感性的关系

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）表达及其下游基因K-ras、B-rM和PIK3CA突变对结直肠癌细胞放射敏感性的影响。方法对9株人结直肠癌细胞株应用实时定量RT-PCR检测EGFR表达,并检测K-ras、B—raf和PIK3CA基因的突变状态;对各细胞株行梯度剂量射线照射后,行克隆形成实验明确其放射敏感性、行Hoechst33258染色凋亡形态学观察和流式细胞术检查细胞凋亡及细胞周期。结果人结直肠癌细胞株EGFR表达与放疗抵抗呈正相关（r=O．717．P=0．030）,~K3CA突变与放疗敏感性有关（t=2．401,P=0．047）,K—ras和B．raf突变与放疗敏感性无关（均P〉O．05）。放疗敏感细胞株（HCTll6）总凋亡率在低放射剂量（2Gy）时即显著增加,并随放射剂量增加而继续增加（P〈0．05）,而放疗抵抗细胞株（HT29）总凋亡率只有放射剂量较大时（6Gy）才明显增加。G1／G。期HCTll6细胞株比例随放疗剂量增加显著降低（P〈0．05）,而HT29细胞株G1／G。期比例在放疗剂量增加时无明显变化（P〉0．05）。结论EGFR通路中多个位点同时参与了结直肠癌细胞的放疗抵抗或敏感作用,EGFR高表达与放疗抵抗相关,PIK3CA突变与放疗敏感有关,放疗抵抗机制可能与抑制细胞凋亡和增加细胞在G1／Go期停顿相关。     

siRNA沉默肾癌细胞EGFR基因对放疗敏感性影响的研究

目的：探讨siRNA沉默AcHN肾癌细胞的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）对放疗敏感性的影响。方法：免疫组化及细胞免疫荧光技术证明组织水平及细胞水平EGFR的表达,化学合成针对EGFR的小干扰RNA,通过脂质体转染法转染进ACHN肾癌细胞中,利用Westernblot技术检测细胞中EGFR蛋白的表达,然后分别用0、2、4、6、8Gy剂量的x线对5组肾癌细胞（每组包含空白对照组、非异性RNA干扰组、特异性RNA干扰组）进行照射,光学显微镜下观察细胞凋亡情况,采用台盼蓝据染法检测细胞凋亡率。结果：靶向EGFR序列的特异性干扰RNA可明显抑制EGFR蛋白的表达,光学显微镜下观察到RNAi联合放疗组细胞死亡情况明显,台盼蓝拒染法检测特异性干扰EGFR基因组可显著提高AcHN肾癌细胞对放疗的敏感性（P〈O．05）。结论：体外研究表明,siRNA沉默ACHN肾癌细胞的EGFR可明显提高肾癌细胞对放疗的敏感性,为肾癌放射治疗提供了新思路。     

Differences in cell kinetic changes among renal cancer cell lines treated with interferon-α

BACKGROUND: Interferon (IFN)-alpha shows certain clinical effects on the treatment of renal cell carcinoma. The purpose of the present study was to investigate its direct effects and to compare the responses among different human renal cancer cell lines. METHODS: Three cell lines, ACHN, RCC10RGB and OS-RC-2, were incubated with IFN-alpha and evaluated using MTT assay for cell proliferation and two-color flow cytometry for cell-cycle-specific cyclin expressions coupled with DNA ploidy analysis. RESULTS: Interferon-alpha inhibited cell proliferation and caused cell accumulation at S and G2/M phases. However, IFN-alpha induced no significant change in cyclins D1, E, A or B1 expression. Interestingly, cell kinetic changes caused by IFN-alpha were different among cell lines. Cell proliferation was suppressed most in ACHN, then RCC10RGB and least in OS-RC-2. Comparing DNA histograms, ACHN showed distinct increase of G2/M cells associated with elevation of late S cells. RCC10RGB showed a predominant increase of whole S cells accompanied with a slight increase of G2/M. OS-RC-2 showed a modest increase of S cells with a little change of G2/M cells. Chronological observation revealed that S-phase increase and proliferative inhibition appeared on day 1 and day 3, respectively, in ACHN and RCC10RGB, and on day 5 in OS-RC-2. CONCLUSIONS: Interferon-alpha induced substantial cell kinetic interference directly in the tested human renal carcinoma cell lines. The degree of change was different according to the nature of the cell line. It may partly indicate the variety of the efficacy of IFN-alpha treatment against renal cancers.