大鼠骨骼肌植块诱导脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞的分化

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经于细胞进行体外培养,探讨骨骼肌植块诱导其向运动神经元样细胞分化.方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况;通过与骨骼肌植块共培养观察神经干细胞向运动神经无样细胞的分化情况.结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示.骨骼肌植块组有7.87%的细胞呈胆碱乙酰基转移酶阳性.与10%胎牛血清组(0.94%)比较具有统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,骨骼肌植块可诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

维甲酸、音猬因子对大鼠脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞分化的影响

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经干细胞进行体外培养,探讨维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导其向运动神经元样细胞分化. 方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光显色检测细胞增殖、分化情况;培养液分组添加Shh、 RA或Shh+RA,观察神经干细胞向运动神经元样细胞的分化情况. 结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示Shh组未检测到胆碱乙酰转移酶阳性细胞,RA组为20.63%, Shh+RA组为66.84%,其差异具统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,Shh、 RA可不同程度地诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分化

目的:研究正常大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分化规律。方法:应用免疫荧光染色技术,检测Nestin、NeuN、MAP2、GFAP、CNPase阳性细胞在大鼠胚胎期及生后脊髓内的分布及变化情况。结果:胚胎发育早期,脊髓中央管、灰质、白质均可检测到Nestin阳性细胞,生后Nestin阳性细胞数量逐渐减少。大鼠脊髓神经元的发生呈现明显的背腹模式,孕14d(E14)脊髓内可检测到NeuN阳性细胞,E16 NeuN阳性细胞逐渐增多,腹侧NeuN阳性细胞核体积较大,分布较稀疏,背侧神经元细胞核体积较小,分布较密集。MAP2染色结果与NeuN一致。胶质细胞的分化、成熟在生后初期进行,P4可检测到GFAP及CNPase阳性细胞,主要分布于脊髓白质内,P30在脊髓灰质内可检测到GFAP阳性细胞,细胞分支较多且短。结论:正常大鼠脊髓发育中神经干细胞的分化呈现一定规律性,向神经元方向化较早且呈明显的背腹模式,胶质细胞的分化较晚。     

不同神经示踪剂组合对大鼠脊髓运动神经元的逆行标记效率比较

目的:探讨神经示踪剂荧光金(FG)、真蓝(TB)和荧光红(FR)两两组合对脊髓运动神经元的标记效率差异,为再生神经重支配准确性研究奠定基础.方法;采用大鼠胫神经示踪模型,采取神经内注射与神经横断后近侧断端浸泡(20 min)2种方式,分别对FG、TB和FR的两两组合进行示踪试验.示踪术后5d,取脊髓腰膨大段冷冻纵切,共聚焦显微镜进行显微成像和计数.结果:FG联合TB示踪标记的运动神经元数量最多,其次为FG联合FR,而FR联合TB组标记细胞数最少,双标比例也最小.神经断端浸泡方式使用示踪剂时标记效率仅为神经内注射的2/3左右.结论:FG联合TB以及FG联合FR示踪对脊髓运动神经元的标记效果较好,且神经内注射使用示踪剂效果优于持续20 min的神经断端浸泡.     

大鼠脊髓神经干细胞的鉴定及光镜和电镜观察

本研究应用无血清培养技术对分离的大鼠胚胎脊髓神经干细胞进行体外培养,在倒置显微镜和电镜下观察细胞形态,应用BrdU标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况。免疫荧光显示nestin、MAP2、GFAP以及BrdU/nestin、BrdU/MAP2、Br-dU/GFAP均有阳性表达,说明从大鼠胚胎脊髓可成功分离出神经干细胞,它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原。脊髓神经干细胞具有自我更新能力,能分化为神经元和星型胶质细胞。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞的培养及鉴定

为了探讨胚胎大鼠脊髓神经管神经干细胞体外培养、鉴定的方法,本实验在解剖显微镜下机械性分离11.5 d的胚胎大鼠脊髓神经管,并制备细胞悬液,无血清培养基培养。应用免疫荧光染色方法对原代和传代细胞进行巢蛋白(nestin)鉴定;加入胎牛血清诱导其分化后分别行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)鉴定。结果显示:11.5 d胚胎大鼠脊髓神经管来源的神经干细胞经连续传代培养可形成较多克隆球,呈nestin免疫阳性;加入胎牛血清可诱导其分别向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。本实验结果提示,利用E11.5的胚胎大鼠脊髓神经管可成功培养出大量稳定增殖并有多向分化潜能的神经干细胞,可用于进一步的研究。     

不同年龄段大鼠脊髓源性神经干细胞的体外培养及鉴定

背景：不同年龄段神经干细胞的增殖及分化特性目前未见报道。 目的：观察不同年龄段大鼠脊髓源性神经干细胞的体外分离、培养及鉴定。 方法：取不同年龄大鼠的脊髓,制成单细胞悬液,用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27的DMEM/F12培养基,以细胞浓度5.0×105 L-1进行原代培养,每隔3 d传代1次。 结果与结论：不同年龄段大鼠的脊髓中均可培养出细胞,其形态为结构紧密、大小不等的悬浮细胞球,称之为“神经干细胞球”;经过传代后单细胞又迅速增殖成球且数目明显增多。提示不同年龄段大鼠脊髓中均能够在体外培养出神经细胞球。     

肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养大鼠脊髓运动神经元划伤后Bcl-2表达的影响

为检测大鼠肌源神经营养因子对体外培养大鼠脊髓运动神经元划痕损伤后 Bcl-2表达的影响 ,本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取出肌源神经营养因子。在胎鼠脊髓运动神经元培养第 7d时将其随机分成对照组和实验组 (成鼠组和乳鼠组 ) ,取 10 0μl肌源神经营养因子 ( 0 .1μg/ ml)加入实验组 ,对照组加入等量的 PBS,同时进行划痕损伤。损伤后第 3d计数各组存活的运动神经元 ,行 Nissl染色和免疫组化反应 ,计数 Bcl-2免疫反应 ( Bcl-2 -IR)阳性神经元数量 ,并在图像分析仪上对 Bcl-2 -IR阳性神经元作光密度分析。结果发现 ,损伤后第 3d,实验组运动神经元存活数 ,Bcl-2 -IR阳性神经元数和平均光密度均明显高于同期对照组 ,而乳鼠肌源神经营养因子组功效优于成鼠肌源神经营养因子组。结果提示 ,大鼠肌源神经营养因子对体外培养的受损运动神经元具有增强 Bcl-2表达、减少凋亡和损伤修复等作用 ,且乳鼠的此因子效能尤佳     

大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分布

本研究应用BrdU注射技术及免疫荧光染色技术检测正常大鼠发育中脊髓内BrdU、PCNA、nestin阳性细胞分布情况。结果显示,胚胎12.5d(E12.5)时,BrdU阳性细胞分布于神经管全层,阳性标记率最高。随胚龄增加,大鼠脊髓内BrdU阳性细胞标记率降低。PCNA阳性细胞分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致。正常成体动物脊髓内较难检测到增殖细胞。胚胎发育早期脊髓脑室带、套层、缘层均可检测到nestin阳性细胞。随大鼠脊髓发育成熟,nestin阳性细胞数量逐渐减少。本研究结果提示,脊髓源性神经干细胞的分布有时空规律性。随大鼠脊髓发育的逐渐成熟,增殖细胞减少,干细胞标记逐渐消失,因此在E12左右分离脊髓源性神经干细胞较适宜。     

神经干细胞移植对大鼠全横断性脊髓损伤修复的影响

我们先前探讨了移植的神经干细胞在大鼠半横断损伤脊髓内存活及分化的情况 ,结果表明神经干细胞在损伤脊髓内可以存活、迁移并分化为神经元和星型胶质细胞。在此基础上 ,本研究应用神经干细胞移植 ,观察其对大鼠全横断性脊髓损伤后结构与功能的影响。取ＳＤ新生大鼠海马 ,剪碎后 ,用胰酶消化 ,制成细胞悬液 ,用含Ｂ2 7和ｂＦＧＦ的ＤＭＥＭ Ｆ12培养液进行培养。神经干细胞在无血清培养基中呈悬浮生长 ,5～ 6ｄ形成克隆球 ,7～ 9ｄ后进行传代。经体外免疫组织化学检测 ,培养的细胞呈Ｎｅｓｔｉｎ染色阳性反应 ,表明它们是神经干细胞。本研究…     

miR-124 regulates neural stem cells in the treatment of spinal cord injury

Several studies demonstrated that the overexpression of miR-124 in neural stem cells (NSCs) could lead the NSCs to differentiate into neurons and astrocytes, which may be important for functional recovery in spinal cord injury. The present study attempted to explore the potential repairing effect of the NSCs transfected with miR-124 for the rats with spinal cord injury (SCI). NSCs transfected with miR-124 were transplanted into rats by intravenous injection after SCI. The effects of miR-124 on the differentiation of NSCs and the treatment for the SCI-model rats were experimentally investigated. The reduction of cavity volume in focal lesions and Basso–Beattie–Bresnahan (BBB) scores were used as the criteria of functional recovery of the SCI-model rats. Up-regulation of miR-124 promoted the differentiation of NSCs. Transfection of miR-124 in NSCs dramatically increased the percentage of NeuN-positive cells, and reduced the percentage of GFAP-positive cells in vitro and in vivo respectively. All of the rats treated with NSCs transfected with miR-124 achieved the better functional recovery than the ones in NSCs and sham control groups. Furthermore, the systemic delivery of the NSCs transfected with miR-124 resulted in a reduction of lesion cavity volume of SCI-model rats. Thus, Overexpression of miR-124 can promote the differentiation of NSCs and play an important role in the repair of SCI. The utility of intravenous delivery of stem cells regulated with miR-124 to target lesion areas as a prospective therapeutic approach in acute spinal cord injury is very promising in the future.     

大鼠胚胎神经干细胞与永生化神经干细胞系C17.2定向分化为神经元潜能的差异

目的 对比大鼠早期胚胎神经干细胞( NSCs)与永生化神经干细胞系C17.2(C17.2-NSC)定向分化为神经元潜能的差异,确立适用于诱导NSCs定向分化为神经元高内涵药物筛选的NSCs筛选模型. 方法 C17.2-NSC、17d胚胎海马NSCs(E17-NSC)及11d胚胎大脑皮层NSCs(E11-NSC)均设定对照组和实验组,对照组与实验组的细胞在含有2％ (v/v) B27的DMEM/F12培养液中,分别经0μmol/L和1μmol/L维甲酸(RA)在37℃、5％CO2常规培养条件下诱导分化5d,通过免疫组织化学技术检测对照组与实验组中NSCs或前体细胞特异性标志蛋白巢蛋白(Nestin)及神经元特异性标志蛋白βⅢ微管蛋白(Tuj1)表达量的差异. 结果 与对照组相比,C17.2-NSC经1μμmol/L RA诱导后未定向分化为神经元,而E17-NSC及E11-NSC经1μmol/L RA诱导后可有效定向分化为神经元. 结论 相对于C17.2-NSC,大鼠早期胚胎NSCs定向分化为神经元的潜能更强,适用于诱导NSCs定向分化为神经元的高内涵药物筛选.     

骨形成蛋白4对脊髓损伤后大鼠功能和神经干细胞的影响

目的　观察骨形成蛋白 4对脊髓损伤后大鼠功能和神经干细胞的影响。方法　应用改良Allen脊髓损伤模型 ,将成年SD大鼠 6 0只随机分为BMP 4组、脊髓损伤组。分别于术后 1d、7d、14d、2 1d、2 8d处死动物 ,并且对大鼠进行Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能。应用免疫组织化学技术检测巢蛋白 (nestin)的表达 ,观察BMP4对脊髓损伤后nestin表达的影响。结果　第 2 1d时BMP4组大鼠功能改善明显与损伤组比较差异有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;脊髓损伤后第 1天 ,在BMP4组和脊髓损伤组的室管膜、室管膜下区、损伤脊髓灰质中都可见到nestin的表达。于损伤后迅速增加 ,第 14天时达到高峰。BMP4组灰质nestin表达为 15 35± 3 83,脊髓损伤组灰质为 8 4 8± 3 5 3,两者差异有显著性 (P <0 0 1)。BMP4组可使损伤的脊髓中nestin持续高表达至术后第 2 8天 ,而脊髓损伤组仅持续表达至术后 2 1d。增加的nestin阳性细胞数与神经功能的改善平行。结论　提示BMP4可减轻神经损伤症状和对脊髓损伤后神经干细胞有促进增殖作用。     

督脉电针对脊髓损伤大鼠神经干细胞的作用

目的　观察督脉电针对脊髓损伤后大鼠脊髓巢蛋白 (Nestin)表达和后肢功能的影响。方法　于术后 1、7、14、2 1和 2 8d分别对大鼠进行Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能后处死动物 ,应用免疫组织化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达 ,采用计算机图像分析仪进行定量分析 ,观察督脉电针对脊髓损伤后神经上皮干细胞蛋白的影响。结果　脊髓损伤后第 1d ,在督脉电针组和单纯脊髓损伤组的损伤脊髓灰质中都可见到Nestin的表达。单纯脊髓损伤组在术后第 7、14、2 1和 2 8d ,Nestin阳性细胞数分别为 2 1 4 8± 7 83、11 78± 4 38和 9 18± 3 2 6 ,而督脉电针组分别为 30 6 9± 6 16、39 2 4± 6 83、2 6 4 9± 5 87和 2 2 30± 6 6 1,两组在 4个时间段上均有显著性差异 (P <0 0 5 )。增加的Nestin阳性细胞数与神经功能的改善平行。结论　提示督脉电针可减轻神经损伤症状和促进脊髓损伤后神经干细胞的增殖。     

Respiratory chain deficiency in aged spinal motor neurons

Sarcopenia, muscle wasting, and strength decline with age, is an important cause of loss of mobility in the elderly individuals. The underlying mechanisms are uncertain but likely to involve defects of motor nerve, neuromuscular junction, and muscle. Loss of motor neurons with age and subsequent denervation of skeletal muscle has been recognized as one of the contributing factors. This study investigated aspects of mitochondrial biology in spinal motor neurons from elderly subjects. We found that protein components of complex I of mitochondrial respiratory chain were reduced or absent in a proportion of aged motor neurons–a phenomenon not observed in fetal tissue. Further investigation showed that complex I-deficient cells had reduced mitochondrial DNA content and smaller soma size. We propose that mitochondrial dysfunction in these motor neurons could lead to the cell loss and ultimately denervation of muscle fibers.     

基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能方法的建立

目的建立一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞(NSCs)相关基因功能的方法。方法 RT-PCR检测鸡胚发育不同时期脊髓NSCs表面标志物;在鸡胚胚龄(E)E2.5~E3时,利用活体电转基因技术将p CAGGSGFP质粒转染到鸡胚脊髓,E6时体视荧光显微镜下筛选绿色荧光蛋白(GFP)阳性胚胎,每组至少取材5个;通过脊髓横切及open-book技术观察神经纤维投射情况;普通光学显微镜下剥离出3~5条脊髓,经胰蛋白酶消化、离心后,无血清NSCs培养基重悬获得细胞铺板,于37℃、5%CO_2细胞培养箱内培养,定时观察GFP阳性脊髓NSCs的形态变化。结果 RT-PCR结果表明,鸡胚脊髓中阳性表达NSCs表面标志物;随后的脊髓横切及open-book结果表明,GFP阳性转染侧的神经纤维能穿过底板,投射到脊髓对侧;而脊髓NSCs体外培养结果显示,GFP标记的脊髓细胞具有典型的NSCs形态,继续培养后有明显突起产生。结论本实验成功建立了一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能的方法。     

臂丛损伤后脊髓前角运动神经元超微结构改变

目的探讨大鼠臂丛损伤导致脊髓前角运动神经元死亡的机制。方法成年雄性SD大鼠24只,其中对照组6只,损伤组18只。建立3种臂丛损伤模型:右C7前根撕脱(A组);右C7前根撕脱+同侧C5～T1后根离断(B组);右C7前根撕脱+右C5与C6之间脊髓半横断(C组)。术后14d取C7节段脊髓,采用尼氏染色方法和透射电镜技术,观察脊髓前角运动神经元的存活率及其超微结构改变。结果术后2周A组脊髓前角运动神经元的存活率最高,B组居中,C组最低。3个臂丛损伤组C7前角均可见凋亡特征性改变:运动神经元内核染色质聚集靠边,核固缩、碎裂、核膜皱褶并内陷,并有染色质团块形成的凋亡小体。细胞体积缩小,胞浆内细胞器密集,线粒体轻度肿胀,核周粗面内质网减少,游离核糖体增多,胞浆内可见较多的空泡。神经元胞体周围的有髓神经纤维和无髓神经纤维呈轻度肿胀,髓鞘的板层结构消失。结论臂丛损伤诱导脊髓运动神经元死亡途径中存在凋亡和坏死两种机制,运动神经元可形成凋亡小体。     

脐带间充质干细胞治疗脊髓损伤临床分析

目的观察脐带间充质干细胞（UC-MSCs）鞘内注射治疗脊髓损伤（SCI）的临床效果及安全性。方法对2008年1月至2010年10月收治的22例SCI患者,给予UC—MSCs鞘内注射治疗,细胞数1×10^6个／（kg·次）,1次／周,4次为1个疗程,其中4例接受2个疗程,1例接受3个疗程,余均接受1个疗程。采用美国脊髓损伤协会制定的脊髓损伤神经功能评分标准（ASIA标准）对患者治疗前后神经功能进行评定,采用国际神经修复学会脊髓损伤功能评价量表（IANR—SCIRFS）对患者治疗前后日常生活活动能力进行评定。结果22例患者中13例有效,9例无效。不完全性SCI患者有效率达81．25％,完全性SCI的6例患者均无效。有5例有效的患者接受了2～3个疗程治疗,疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和／或感觉功能改善,大小便控制能力增强。22例患者治疗后1个月与治疗前比较,痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分均有明显升高（P〈0．01）。治疗后常见的不良反应有头痛（1例）、腰痛（1例）,均在1～3d内消失。随访3个月至3年,无治疗相关不良事件发生。结论UC—MSCs鞘内注射治疗是安全的,可以改善大部分不完全性SCI患者的神经功能,提高这些患者的生活质量。