SUMO表达系统高效、可溶性表达重组鼠源IL-1β

目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础。方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO ex-press中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白。用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37kD,切割后的成熟蛋白为17kD,与理论值相符。且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在。Western blot证实该蛋白为mIL-1β。成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性。结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白。     

人IL-1β的克隆及其高效可溶性表达

目的:从人淋巴细胞中克隆白介素-1β(IL-1β)cD-NA,通过原核可溶性表达纯化,获得具有生物活性的可溶性IL-1β,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础.方法:从人PBMC中克隆出人成熟IL-1β基因,并插人到原核表达载体pSUMO中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pSUMO-hIL-1β.将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达hIL-1β/SUMO融合蛋白,经Ni-NTA Agaroae纯化后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.用protease-1切去SUMO标签,用Real time-PCR鉴定其对人T细胞表达的细胞因子的影响.结果:SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量(Mr)为37 000,成熟蛋白Mr为17 000,与理论值相符.灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的约30%左右,主要以可溶形式存在.Western blot证实该蛋白为hIL-1β.成熟蛋白纯化产物纯度超过90%以上.通过RT-PCR检测证明其具有刺激人T细胞大量表达多种细胞因子(IL-1β,IL-4,IL-10,IL-18,IFN-γ,TGF-β,TNF-α)的活性.结论:利用大肠杆菌表达系统完全可以高效可溶性表达较高纯度的具有生物活性的hIL-1β蛋白.     

体外重组Cav1.2钙通道CT1蛋白片段制备方法的优化

目的通过改变多种实验条件提高CaV 1.2钙通道C末端GST融合蛋白(GST-CT1)在大肠杆菌BL21中的表达量及分离纯化产量。方法把pGEX-6p-3/CT1质粒转入大肠杆菌BL21中,筛选其中转化成功的菌株培养并用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)在不同细菌浓度,不同诱导时间或不同温度下诱导表达GST-CT1蛋白,Glutathione-Sepharose 4B beads(GS-4B beads)纯化蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达水平。结果当吸光度为0.6～1.0时,GST-CT1在大肠杆菌BL21中的表达量较高,IPTG诱导表达蛋白大于4h后无明显表达量差异,并且当诱导温度为25℃时,蛋白的产量将大大增加。结论可以通过控制细菌数量、控制诱导时长和降低诱导温度的方法来提高GST-CT1蛋白的产量。     

不同疱疹病毒相关蛋白与SUMO修饰系统的相互作用

小泛素化相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰是一种与泛素化修饰具有相似酶促反应过程的翻译后修饰.近年来,研究者相继发现许多病毒蛋白能发生SUMO修饰,特别是疱疹病毒相关蛋白.研究表明,SUMO修饰能影响一些病毒蛋白的转录调控活性.此外,一些定位于核内功能性结构PODs(PML oncogenic domains)的病毒蛋白还能影响SUMO-1对PODs主要成分PML及Sp100的修饰并导致PODs解聚.因此了解SUMO修饰如何改变病毒与细胞相互作用的生物学特件对研究病毒的复制增殖机制具有重要的意义.本文就疱疹病毒相关蛋白与SUMO修饰系统相互作用的分子机制及功能影响进行综述.     

重组人Flt3配体在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定

根据天然的人Flt3配体(Flt3ligand,FL)基因和遵循适合大肠杆菌BL21(DE3)表达体系表达条件及不改变FL天然蛋白氨基酸序列的原则,对其进行改造,所获得的FL功能片段(FL134)克隆入PET30a表达载体,在C端融合了6个His,继而在大肠杆菌中诱导表达。结果表明重组蛋白rhFL134以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中可得到较高水平的表达。通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达92%以上的rhFL134重组蛋白。体外的活性实验显示,重组蛋白rhFL134具有显著的促小鼠骨髓细胞的集落形成和扩增人脐带血中的CD34+细胞的生物学活性。     

α—catenin／GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的 制备α-catenin多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法 PCR扩增编码人α-catenin C－端455个氨基酸的DNA片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-4T-3,转化大肠杆菌JM109菌株,异丙基β－D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生GST／α-catenin融合蛋白。GST－Sepharose亲和层析纯化可溶性融合蛋白,免疫新西兰白兔,制备抗血清。通过ELISA、免疫荧光细胞化学和SP免疫组织化学法鉴定血清特异性和效价。结果 成功地构建了pGEX-4T-3/α-Cat表达载体,转化JM109后可高效表达融合蛋白GST－α-catenin（α－Cat）。免疫兔产生的α-Cat多抗可特异检测人体组织和细胞中α-Cat表达及定位情况。结论 α-catenin抗体效价高,特异性强,适合免疫组织化学、ELISA等检测应用。     

重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究

目的探讨优化通过大肠杆菌表达重组人TNF-α的相关条件,改良纯化策略,为使用噬菌体随机肽库技术筛选抗TNF-α特异小分子肽提供纯度高活性好的靶蛋白. 方法将表达质粒pUC118- TNF-α转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达.再先后使用SP-FF阳离子交换层析柱和Q-FF阴离子交换层析柱对重组人TNF-α蛋白进行纯化.应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性.结果为筛选TNF-α特异性结合肽通过大肠杆菌高效表达出纯度高活性好的重组人TNF-α靶蛋白.     

人源抗HBsAg scFv与重组复合干扰素融合蛋白的高效表达及活性鉴定

目的：制备人源抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)单链抗体(scFv)与重组复合干扰素(consensus interferon，cIFN)的融合蛋白，并鉴定其活性。方法：把人源抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白的表达载体pRA-cIFNscFv转化到大肠杆菌菌株BL21之后大量表达抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白。SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白，经纯化并变性复性包涵体蛋白后用ELISA、流式细胞仪、MTS非放射性活细胞比色定量法及HBsAg血凝抑制试验等进行融合蛋白的抗HBsAg抗体活性和干扰素活性测定。结果：SDS-PAGE和Western blotting结果显示，抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白在BL21大肠杆菌中大量表达，表达量超过10mg/L培养基；ELISA和流式细胞仪结果显示，所表达的目的蛋白具有抗HBsAg和IFNα的免疫活性，且特异性良好；MTS和HBsAg血凝抑制试验结果显示，融合蛋白具有明显的PLC/PRF/5细胞增殖抑制活性和HBsAg分泌抑制活性，表明所获得的抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白具有抗HBV病毒活性和HBV感染细胞增殖抑制活性。结论：用基因工程方法成功制备了人源抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白，此融合蛋白具有抗HBsAg抗体活性和IFNα活性，有待深入探讨此融合蛋白的应用价值。     

人可溶性TRAIL基因的克隆及表达

为了利用大肠杆菌表达人可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体 (TRAIL )蛋白 ,应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增人可溶性TRAIL蛋白cDNA ,克隆入PCR2 1 载体 ,测序验证后用基因重组法分别构建了人可溶性TRAIL蛋白的真核与原核表达质粒载体。将重组质粒分别转入COS 7和大肠杆菌M1 5中表达。用流式细胞仪检测人可溶性TRAIL蛋白在COS 7细胞中的瞬时表达 ,用SDS PAGE电泳和Westernblot鉴定大肠杆菌中的表达产物。所表达融合蛋白为人可溶性TRAIL蛋白分子 ,相对分子质量为 2 1 0 0 0 ,表达量约为 2mg/ml。所表达的人可溶性TRAIL蛋白具有诱导HL 60细胞凋亡的作用。上述结果提示大肠杆菌可良好表达具有生物活性的人可溶性TRAIL蛋白 ,为深入研究TRAIL分子在肿瘤与自身免疫性疾病中的可能应用提供了材料。     

重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定

目的构建人CD40胞外结构域（exCD40）的原核表达载体，获得可溶性产物。方法以RT-PCR方法从人白细胞总RNA中扩增编码CD40胞外区的cDNA，构建羧基端融合His6标签的exCD40的原核表达载体，在大肠杆菌中表达，并对表达产物进行复性、纯化和鉴定。结果构建了exCD40的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高表达，Mr为23000，与理论大小相符，表达产物主要存在于包涵体中，经Ni^2＋-NTA柱上复性和纯化获得纯度达95％的可溶性exCD40蛋白，该蛋白能与细胞上的CD40L结合。结论从大肠杆菌中成功获得具有配基结合活性的可溶性exCD40蛋白。     

人IFN-ε的表达、纯化及生物学特性研究

目的 表达并纯化人IFN-ε,并对其理化特性和生物学特性进行初步研究. 方法 利用PCR技术以人基因组DNA为模板,获得目的片段的全基因序列后,克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组表达载体pET-32a(+)/IFN-ε,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并对表达进行了优化.产物的表达形式为包涵体,经过纯化复性后,获得高纯度的活性蛋白IFN-ε.对IFN-ε的理化性质和抗病毒活性、抑制肿瘤细胞增长活性、刺激细胞产生抗病毒蛋白的活性进行了鉴定. 结果 IFN-ε以包涵体形式表达,纯化后纯度大于95%,抗病毒活性为1.2×105 IU/mg,能够抑制肿瘤细胞的生长,并能诱导细胞产生抗病毒蛋白MxA. 结论 成功表达了人IFN-ε蛋白,并证明此蛋白质具有抗病毒和抗细胞增殖的活性.     

A组链球菌M蛋白重组多肽原核表达载体构建及融合蛋白的表达

目的:设计针对A组β溶血性链球菌M1和M12蛋白的复合多肽;构建含M蛋白基因(emm基因)1型和12型特异性抗原决定簇基因及其保守区J14肽基因的GST标签的重组表达载体;并诱导和优化GST融合蛋白的表达.方法:在NCBI Genebank和Olig0 6引物设计软件中选择分别编码M蛋白emm基因1型和12型信号肽后35个氨基酸及其相同的保守区14肽基因序列(全长270 bp),通过重叠PCR(Overlap PCR)合成所需的核苷酸序列,经测序确定序列完全和设计的相匹配后,将该重组片段克隆到pGEX-4T-1表达载体中,阳性克隆经双酶切和测序鉴定正确后建立稳定表达该重组质粒的大肠杆菌BL21株系(pE/B);通过聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色和Western blot来检测在不同时间(O、2、6、8、18和24小时)和温度(25℃、30℃和37℃)以及不同浓度(0.01、0.1、1 mmol/L)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导GST融合蛋白(GST/emm)表达情况,并对诱导表达的GST/emm切胶进行质谱分析鉴定.结果:成功构建含有emml和emm12抗原决定簇及M蛋白保守区J14肽基因的原核表达载体;并诱导其稳定表达,在1 mol/L IPTG诱导6～8小时达高峰,不同温度下均有过量表达;质谱检测诱导蛋白GST/emm条带结果正确.结论:成功构建A组p溶血性链球菌的emm1型和emm12型原核表达载体,并稳定诱导GST/emm表达,为下一步研究GST/emm的纯化、酶切以及免疫原性的鉴定和疫苗研制打下夯实的基础.     

人FGF12融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：在原核表达系统中获得高效表达的人成纤维生长因子12融合蛋白。方法：采用逆转录PCR方法获得hFGF12 cDNA，将其连接到pET 28a原核表达载体，转化入BL21(DE3)菌中表达，经金属螯合亲和层析法和肝素亲和层析法纯化，以刺激NIH 3T3成纤维细胞增殖实验；测定纯化的hFGFl2融合蛋白活性。结果：表达产物经SDS-PAGE电泳，在Mr31000附近新增一条明显区带，与预期的相对分子质量相符。重组融合蛋白能刺激NIH3T3细胞增殖。结论：在大肠杆菌中表达了具有促有丝分裂活性的融合蛋白。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL-10／pET32a,测序正确后转化E.coli BL21（DE3）,不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10,MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx,有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

重组GST-HBx蛋白在表达过程中断裂状况的研究

目的 在对乙型肝炎病毒非结构蛋白HBx研究的过程中,发现体外表达HBx蛋白产物的稳定性存在差异.为了了解其中的原因,拟通过原核表达方式进行分析.方法 以包含全长HBV DNA的质粒pEco63为模板,通过PCR反应,扩增HBV X基因全长序列(1～154氨基酸)和截短序列(48～104氨基酸,48～146氨基酸,98...     

人粘膜血管定居因子／GST融合基因表达载体的构建与表达

目的 构建hMAdCAM-1/GST融合基因表达载体并进行表达。方法 采用PCR技术扩增hMAdCAM-1cDNA5‘端615bp的基因片段,将其插入pGEM-T质国。经全自动序列分析仪测序证实后,再亚克隆至表达载体pGEX-2T,转化大肠杆攻DH5a。结果 SDS－PAGE检测显示,表达出相对分子量52000u的融合蛋白,占菌体总蛋白的31％左右。Westerm blot分析表明,表达蛋白能与抗hMAdCAM-1多抗特异性结合。结论 hMAdCAM-1/GST融合基因表达载体的构建和表达,为深入研究MAdCAM-1提供了材料。     

重组人干扰素Epsilon的表达纯化及生物学性质研究

目的表达纯化一种新型重组人干扰素Epsilon(rhIFNε155ser),并对它的生物学特性进行初步研究。方法人工合成rhIFNε155ser的全基因序列,并按照大肠埃希菌密码子嗜性作适当改造,然后构建到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌DH5α中表达。将表达的包涵体蛋白纯化复性后,对最终产物的抗病毒活性、细胞生长抑制活性和NK细胞刺激活性进行鉴定。同时,利用芯片技术,从基因的水平对rhIFNε155ser的生物机制进行初步的了解。结果rhIFNε155ser以包涵体的形式表达,经纯化蛋白纯度可达95%。复性后rhIFNε155ser在WISH抗VSV系统中的抗病毒活性可达6×105IU/mg。在100～1000pg/ml下rhIFNε155ser具有剂量依赖性的抗增殖活性,而NK细胞刺激活性无剂量依赖性。基因芯片扫描发现,22278个位点中,有283个基因显著上调,另外1894个显著下降。结论成功地表达了rhIFNε155ser,发现此IFN具有一定的抗病毒、抗增殖和NK细胞刺激活性。芯片技术可进一步拓展对IFN的功能研究。     

SUMO融合系统表达人白细胞介素17及其活性的研究

目的:克隆、表达和纯化人白细胞介素17(hIL-17),并对其生物学活性进行研究。方法:采用RT-PCR的方法从活化的人T细胞中克隆获得hIL-17cDNA。构建了含羟胺切割位点的重组载体pHisSUMO-hIL-17,导入宿主菌Rosetta中,经IPTG诱导后得到表达。用Ni-NTA琼脂糖颗粒层析纯化融合蛋白,经羟胺切割,复性,通过Western blot实验进行确认,并从核酸水平和蛋白水平鉴定其活性。结果:克隆表达出了hIL-17,利用Ni-NTA琼脂糖颗粒层析纯化得到的纯品蛋白经体外活性实验表明,该蛋白具有刺激3T3-L1细胞和HeLa细胞分泌IL-6、IL-8、G-CSF的作用。结论:制备了具有生物学活性的成熟hIL-17蛋白,为进一步研究该分子在疾病中的作用奠定了基础。     

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。