抗HBV Pre S2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达

目的 利用基因重组技术构建ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体基因并使其在大肠杆菌中永生化和表达活性的抗ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体（ＳｃＦｖ），方法和结果 利用基因重组技术，在构建抗ＨＢＶ前Ｓ２３Ｂ９ＳｃＦｖ基因的基础上，在此基因中引入限制性同切酶位点，克隆到噬菌体表达载体－ｐＣＡＮＴＡＢ５噬菌粒中，经亲和筛选得到２株阳性重组克隆，诱导表达产物在特异性阻断ＥＬＩＳＡ实验中具有一定阻断亲本３Ｂ９单抗与ＨＢＶ前Ｓ２抗原的结     

人源性抗-HBc单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性单链噬菌体抗体库，为筛选人源性抗—HBc单链抗体奠定基础。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体(抗—HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因，重组于噬菌粒载体叶pHEN1，转化抑制型大肠埃希菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。结果 成功地构建了人源性抗—HBc单链噬菌体库，库容量达10^6。结论 利用RT—PCR和噬菌体表面展示技术可以成功构建人源性单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选人源性单链抗体。     

可溶性HCV非结构蛋白NS3人源单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的NS3 ScFv和进一步HCV的治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV非结构蛋白NS3为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的HCVNS3人单链抗体ScFv片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化琥珀突变非抑制型大肠杆菌HB2151;IPTG诱导表达HCV NS3可溶性单链抗体;ELISA和dot blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了HCV NS3的单链可变区抗体基因,经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由747个碱基组成。ELISA和dot blot结果表明,在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性HCV NS3的单链可变区抗体,具有结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的ScFv-NS3。     

人抗地高辛单链抗体在大肠杆菌的表达

目的：研究人抗地高辛（Dig）单链抗体（ADAscFv）在大肠杆菌（E．coli）的表达及包涵体变性和复性条件。方法：（1）用PCR扩增人ADAscFv基因，重组于克隆载体pGEM—T，NdeI＋Sail消化回收目的基因，插入pT7．7载体构建表达载体pT—ADAscFv，转化E．coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，SDSPAGE分析目的蛋白的表达情况，筛选高表达克隆；（2）提取纯化包涵体，SDS-PAGE分析其纯度，采用不同的方法及条件进行变性及复性，ELISA检测活性。结果：（1）SDS＋PAGE显示，含有重组质粒pT-ADAscFv的E．coli菌株BL21（DE3）的表达产物中有一条约30kD的条带，其分子量与预期值相符，提取纯化的包涵体的纯度较高；（2）ELISA显示，透析复性法和稀释复性法均可使其复性。结论成功地构建了人ADAscFv表达载体，实现了其在E．coli的表达并对其包涵体变性、复性条件进行了研究，为制备适于临床上诊断及治疗Dig中毒的人源性单抗奠定了基础。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体基因的构建和表达

目的　构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体 (scFv)基因。　方法　通过PCR方法体外扩增并经测序验证的重链、轻链可变区 (VH、VL)基因先后重组入原核表达质粒 pTHA90相应的位点上 ,中间通过一连接肽 (Gly4 Ser) 3基因连接构建成单链抗体基因 (scFv) ,连接产物转化相应受体菌Top1 0 ,提取质粒 ,酶切鉴定重组克隆。表达产物经ELISA方法测定活性。　结果　重组克隆经酶切鉴定可见预期大小的片段 ,表明重组成功。表达产物经ELISA检测 ,OD4 92 值为 1 .0 6 ,高于阴性对照 3倍以上 ,证实具有与相应抗原结合的能力。　结论　成功地构建了scFv基因 ,且其表达产物保留了抗体的亲和性和特异性     

抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体的构建及表达

目的　用基因工程抗体技术构建抗日本血吸虫膜蛋白特异的单链抗体。　方法　用抗体框架区的通用引物 PCR扩增抗日本血吸虫膜蛋白特异性单克隆抗体 NP11- 4的 VH 及 VL 基因 ,测序分析其核苷酸序列。用VH 和 VL 基因在 p THA90质粒载体中构建成单链抗体基因并诱导表达。　结果　扩增获得 NP11- 4的 VH 和 VL基因 ,经测序分析确定为新发现的抗体可变区序列 ,构建成排列顺序为 VH- linker- VL 的单链抗体基因 ,经诱导表达出与硫氧环蛋白融合的单链抗体 ,大小约为 36 .2 k Da,以包涵体形式存在。　结论　成功地构建和表达了抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体。     

从人源免疫抗体库筛选抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体

目的 获得高亲和力的全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体。 方法 以健康供血者的外周血淋巴细胞为来源,以PreS1肽体外致敏后,借助噬菌体展示技术构建人源免疫单链抗体库,库容量7×10 8。 结果 以PreS1肽进行3轮固相筛选。获得了亲和力10 7～10 8mol/L的抗PreS1单链抗体。结论 通过体外致敏的方法构建人源免疫抗体库,可以快速获得高亲和力基因工程抗体。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的：制备丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NSS（NS5）的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗－Id scFv),为研制HCV NS5的抗－Id scFv疫苗奠定基础。方法：采用噬菌体表面展示技术,将HCV NS5单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,随机挑选80个克隆,利用酶联免疫吸附试验（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCV NS5单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆,并对HCV NS5特异性抗－Id scFv的编码序列进行序列测定分析。结果：筛选得到的HCV NS5抗－Id scFv片段由786bp组成,具有结合HCV NS5单克隆抗体的生物学活性和特异性。结论：用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCV NS5的抗－Id scFv。本实验结果为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

腺病毒介导核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用

目的观察针对HBV(乙型肝炎病毒)C区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法采用亚克隆技术,从pGEM—Rz123(含针对HBV C区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于腺病毒表达载体pAd-CMV中。利用Lipofectamine2000介导,将重组病毒pAdCMV—Rz及pAdCMV—laz感染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA(酶联免疫)、免疫荧光、共聚焦定量、图象分析法、Western blot分析Hbe/HBcAg的表达。结果感染的2.2.15细胞2周后,打点杂交证实可表达针对HBV C区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达68.6％,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Western blot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论该双位点核酶通过针对HBV C区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

抗癌胚抗原单链抗体的原核表达及对人胃癌的检测

目的:探讨T84．66单链抗体的原核表达及对6 种胃癌细胞系及胃癌组织的特异性亲和力．方法:将抗CEA单链抗体T84．66的cDNA插入噬菌粒载体pcANTAB5E,获得噬菌粒载体T84．66-scFv-pCANTAB5E．将后者转化入 E．coli HB2151,经β,D异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达．采用细胞培养及免疫细胞／组织化学方法,检测胃癌细胞中及石蜡包埋的胃癌组织中的癌胚抗原表达．结果:SDS-PAGE及Western blot证实,T84．66 单链抗体蛋白分子正确表达．T84．66单链抗体可结合KATOIII,HGC-27和MKN45,表明这3种细胞表达了特异性肿瘤抗原;单链抗体不能结合SGC7901,GC803,BGC823．42例胃癌组织癌胚抗原阳性率早期和进展期分别为55％(6／11)和61％(19／31),在正常胃黏膜组织标本中无表达,二者之间存在显著性差异 (P<0．05)．结论:KATOIII等胃癌细胞系可表达癌胚抗原．后者在胃癌组织表达水平较高,而正常胃组织不表达．     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构蛋白（ＮＳ）３的人单链抗体（ＳｃＦｖ）,以解决鼠单抗蝗免疫原性问题,为ＨＣＶ的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的ＨＣＶＮＳ３为包被抗原,从噬菌体单链楞变区抗体库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的ＨＣＶＮＳ３人单链抗体（ＳｃＦｖ片段）阳性克隆,并对其进行免疫体及序列测定。结果 筛选出来的ＳｃＦｖ片段     

Construction and characterization of calreticulin-HBsAg fusion gene recombinant adenovirus expression vector

AIM: To generate recombinant adenoviral vector con-taining calreticulin (CRT)-hepatitis B surface antigen (HBsAg) fusion gene for developing a safe, effective and HBsAg-specific therapeutic vaccine.METHODS: CRT and HBsAg gene were fused using polymerase chain reaction (PCR), endonuclease diges-tion and ligation methods. The fusion gene was cloned into pENTR/D-TOPO transfer vector after the base pairs of DNA (CACC) sequence was added to the 5′ end. Adenoviral expression vector containing CRT-HBsAg fusion gen...     

丙型肝炎病毒NS3蛋白人源基因工程单链抗体的表达

目的在大肠杆菌XL1-Blue中表达可溶性的抗HCV非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体（single-chainvariablefragmentantibody,ScFv）。方法以重组的HCVNS3为抗原,利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗-HCVNS3ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经SfiI/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）诱导表达HCVNS3可溶性单链可变区抗体。ELISA和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的HCVNS3的单链抗体基因,经限制性内切酶酶切和序列分析表明,该抗体基因由750bp组成,ELISA和斑点吸印杂交结果表明,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的HCVNS3的单链抗体,可与不同来源的NS3抗原结合。结论大肠杆菌XL1-Blue表达的NS3-ScFv具有结合不同来源的HCVNS3的活性和特异性。     

Inhibition of hepatitis B virus replication by pokeweed antiviral protein in vitro

AIM： To explore the inhibitory effects of pokeweed antiviral protein seed （PAP-S） and PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid on hepatitis B virus （HBV） replication in vitro. METHODS： HepG2 2.2.15 cells in cultured medium were treated with different concentrations of PAP-S. HBsAg, HBeAg and HBV DNA in supernatants were determined by ELISA and fluorescent quantitative PCR respectively. MTT method was used to assay for cytotoxicity. HepG2 were cotransfected with various amounts of PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid and replication competent wild-type HBV 1.3 fold overlength plasmid. On d 3 after transfection, HBsAg and HBeAg were determined by using ELISA. Levels of HBV core-associated DNA and RNA were detected by using Southern and Northern blot, respectively. RESULTS： The inhibitory effects of PAP-S on HBsAg, HBeAg and HBV DNA were gradually enhanced with the increase of PAP concentration. When the concentration of PAP-S was 10 μg/mL, the inhibition rates of HBsAg, HBeAg and HBV DNA were 20.9%, 30.2% and 50%, respectively. After transfection of 1.0 μg and 2.0 μg plasmid pXF3H-PAP, the levels of HBV nucleocapside- associated DNA were reduced by 38.0% and 74.0% respectively, the levels of HBsAg in the media by 76.8% and 99.7% respectively, and the levels of HBeAg by 72.7% and 99.3% respectively as compared with controls. Transfection with 2 μg plasmid pXF3H-PAP reduced the levels of HBV nucleocapside-associated RNA by 69.0%.CONCLUSION： Both PAP-S and PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid could effectively inhibit HBV replication and antigen expression in vitro, and the inhibitory effects were dose-dependent.     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)核心区为靶位，构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro，体外观察siRNA抗HBV的效果。方法 以HepG2 2．2．15细胞为靶细胞，利用脂质体Metafectene与表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro共转染，用定量聚合酶链反应检测细胞上清液中DNA，用逆转录聚合酶链反应检测HBV C-mRNA。结果 成功构建了表达siRNA的转录质粒载体，两条siRNA均可抑制HBV的复制，而且与siRNA浓度成正相关。结论 靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV的复制。     

High expression level of soluble SARS spike protein mediated by adenovirus in HEK293 cells

AIM: To develop a highly efficacious method for preparation of soluble SARS S-protein using adenovirus vector to meet the requirement for S-protein investigation. METHODS: The human adenovirus vector was used to express the soluble S-protein (corresponding to 1-1190 amino acids) fused with Myc/His tag using codon-optimized gene construct in HEK239 cells. The recombinant adenovirus bearing S-protein gene was generated by ligation method. The expressed S-protein with Myc/His tag was purified from culture medium with Ni-NTA agarose beads followed by dialysis. The S-protein was detected by Western blot and its biologic activity was analyzed by binding to Vero cells. RESULTS: Under the conditions of infection dose (MOI of 50) and expression time (48 h), the high-level expression of S-protein was obtained. The expression level was determined to be approximately 75μg/106 cells after purification. Purified soluble S-protein was readily detected by Western blot with anti-Myc antibody and showed the ability to bind to surface of Vero cells, demonstrating that the soluble S-protein could remain the biologic activity in the native molecule. CONCLUSION: The high-level expression of S-protein in HEK293 cells mediated by adenovirus can be achieved under the optimized expression conditions. The proteins possess the biologic activity, which lays a foundation for further investigation of S-protein biological function.     

乙型肝炎病毒全基因重组腺病毒感染免疫研究

目的 用腺病毒载体将乙型肝炎病毒(HBV)基因组导入小鼠体内,研究HBV表达产物诱发的机体免疫反应.方法 用AdEasy系统构建含HBV基因组的重组腺病毒AdHBV-WT,感染HepG2细胞后,分别用ELISA和western blot检测细胞培养上清液和细胞裂解物中的HBsAg、HBeAg和HBcAg.AdHBV-WT经在293细胞中扩增、纯化和浓缩后,经滴鼻途径感染BALB/C小鼠,检测体液和细胞免疫反应.结果 重组腺病毒AdHBV-WT感染HepG2细胞后,有效地表达出HBV的各种抗原.重组腺病毒感染小鼠可诱导抗-HBc的产生.3H-TdR摄入实验表明,AdHBV-WT可诱发小鼠产生HBcAg特异性的T细胞应答.结论 HBV全基因重组腺病毒在体外可表达HBV的各种抗原,并可诱发小鼠产生HBcAg特异性的体液免疫和细胞免疫.     

腺相关病毒Rep78蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的体外研究

目的 研究腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)Rep78蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用及机制.方法 将土拨鼠肝炎病毒(WHV)全基因组DNA从质粒中酶切回收,线状DNA重新连接呈环状.用脂质体Fugene 6体外转染至HepG2细胞,同时共同转染含有Rep78的质粒AAVdl52-91.5 d后收获细胞DNA,Southern blot检测WHV DNA复制.以含有HBV全长的质粒为模板,PCR法分别扩增出HBV-S、C和X基因全长.以凝胶电泳阻滞实验(EMSA)检测Rep78与HBV-S、C和X的结合.结果 Southern blot结果表明,AAV-Rep78可以明显抑制WHV病毒在HepG2细胞中的复制,并呈剂量依赖关系.EMSA结果显示,Rep78蛋白在体外能够与HBV-S、C和X的DNA结合,其中与HBV-C的结合最强而且有剂量依赖关系.此外,这种Rep78蛋白与HBV-C DNA结合可以被特异性的Rep78抗体阻滞,形成超结合带.结论 AAV-Rep78可以抑制HBV DNA的复制,其机制可能在于Rep78蛋白结合并抑制了HBV-C基因.     

X蛋白调节乙型肝炎病毒复制的研究进展

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)由一段154aa的多肽组成,由HBV的X基因编码,在肝癌的形成中起重要作用,并且广泛参与宿主细胞的基因表达、反式激活和细胞信号传导等 [1].HBx不能直接与DNA结合,但是能活化多种DNA顺式作用元件,如核因子κ B、激活蛋白1、激活蛋白2、CCAAT增强子结合蛋白、活化转录因子/cAMP反应元件结合蛋白等.