人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶的可溶性表达及抗血清反应模式

目的克隆表达重组人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)蛋白及制备抗血清，探讨建立ALT1特异性检测方法思路。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人ALT1 cDNA，插入pGEX-2T，构建原核表达载体pGEX-2T—ALT1，并转人大肠杆菌进行表达。SDS-PAGE，活力测定和活性染色鉴定表达产物。表达产物免疫小鼠所得抗血清对天然ALT1，重组ALT1及重组ALT2进行Western blot分析。结果重组质粒测序和酶切结果显示ALT1基因已经成功克隆到pGEX-2T载体。SDS-PAGE和活性染色表明所表达蛋白具有天然活性。抗ALT1血清除识别重组ALT1外，还可识别天然蛋白和重组ALT2。结论重组人ALT1得到高效可溶性表达。用目前方法制备的抗血清特异性不高，如建立ALT1的免疫学检测方法需要采用特异性识别ALT1的抗体，以避免交叉反应引起的假性升高。     

人Ⅱ型丙氨酸氨基转移酶表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的　构建基因工程菌株 ,以获得重组人II型丙氨酸氨基转移酶 (ALT2 )蛋白。方法　逆转录PCR法从人肌肉组织总RNA中扩增ALT2基因片段 ,插入原核表达载体pET - 2 8a ,构建成融合表达质粒pET2 8 ALT2 ,将其转化大肠杆菌BL2 1DE3,IPTG诱导表达。SDS PAGE、活力测定、活性染色及westernblot鉴定表达产物。结果　重组质粒pET2 8 ALT2测序和酶切结果与预期完全符合。IPTG诱导后 ,阳性菌体裂解物上清ALT2活性很高 ,PAGE出现一分子量 5 80 0 0蛋白条带 ,可被抗ALT1抗血清识别 ,酶活性染色显示有ALT活性。结论　已成功将ALT2基因克隆到pET 2 8a载体 ,ALT2蛋白得到可溶性高效表达。     

自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶的基因克隆和原核表达研究

目的研究建立用克隆、表达和鉴定人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶（HARS，亦称Jo-1抗原）检测多发性肌炎／皮肌炎（PM／DM）自身免疫抗体的方法。方法用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Jo-1全长基因，将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序，再定向克隆至pGEX-5T载体中，并转入大肠杆菌BL-21；阳性克隆鉴定后在异丙基．β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，然后对其产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（IBT）检测。结果PCR产物约1500bp，与预期1526bp接近，测序结果与基因库核酸完全一致。pGEX-5T-Jo-1重组阳性克隆酶切鉴定正确，SDS-PAGE和IBT结果显示，融合蛋白分子量75000，具有天然人自身抗原Jo-1的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Jo-1，为建立PM／DM自身免疫抗体检测方法奠定了基础。     

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备

目的构建登革病毒1型（DENV-1）E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta（DE3）感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。     

人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达的初步研究

目的 获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法 采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白。包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析。结果 重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性。结论 作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。     

NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的原核表达载体,制备兔抗人NGAL多克隆抗体。方法利用DNA重组技术构建原核表达载体pET28a-NGAL,诱导表达NGAL融合蛋白,分离该融合蛋白后,注射入免疫家兔制备多克隆抗体。结果成功获得NGAL,免疫动物所得抗血清效价为1∶4000,该抗体能够识别原核表达的NGAL。结论成功克隆NGAL基因并制备了特异性的兔抗人NGAL多克隆抗体。     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化

目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。     

人自身抗原Sm B′的基因克隆和原核表达

目的克隆并表达人自身抗原Sm B′。方法应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Sm B′全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-ST载体中,转入大肠杆菌BL-21。阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果PCR产物约为0.7kb,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank报道的完全一致。pGEX-5T—Sm B′重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为53KD,具有天然人自身抗原Sm B′的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Sm B′,为下一步工作奠定了基础     

幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性

目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性.方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中.0.5 mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠.ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性.结果:SDS-PAGE示在约87 kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51 200.Western blotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别.结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性.     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.     

CD26多克隆抗体的制备与鉴定

目的针对CD26酶催化结构域制备多克隆抗体。方法应用RT-PCR技术以人白细胞mRNA为模板,扩增获取编码CD26催化结构域的基因序列,克隆入原核表达载体PET32a后,转化BL21感受态细菌,经IPTG诱导表达得到his-CD26融合蛋白;亲和层析柱纯化并经Western-blot鉴定后,用此重组蛋白免疫2只新西兰纯种大白兔,获取免疫血清共180 ml,经蛋白A柱纯化及抗原抗体亲和纯化后,采用间接ELISA法检测抗体效价,Western-blot及免疫细胞化学染色进行抗体效价及特异性鉴定。结果构建出PET32a/CD26原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达,经his亲合层析纯化后蛋白量达2.3 mg/ml;制备的多抗血清纯化后效价达256 000,经Western-blot证明能特异性的识别CD26重组蛋白,免疫细胞化学染色显示能特异的结合于H9细胞。结论成功制备了能特异性识别CD26的多克隆抗体。     

EB病毒BMRF1基因原核表达载体的构建

目的克隆EB病毒早期蛋白P54的编码基因BMRF1，构建原核表达载体，为相应蛋白的表达和应用奠定基础。方法以含EB病毒的B95-8细胞培养上清为模板，PER扩增出BMRF1基因。PER产物经BamH I和Xho I双酶切后克隆至原核表达载体pGEX-5T，用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PER扩增的特异性片段长度为1233bp，以此构建的重组质粒pGEX-5T-BMRF1双酶切的片段大小与预期符合，重组克隆外源基因的测序结果与GenBank中的EB病毒BMRF1基因eDNA序列一致。结论成功构建了pGEX-5T-BMRF1原核表达载体。     

人KIAA1199蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的 KIAA1199是一种功能未知的胞浆蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础。方法采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pMAL-C2X和pGEX-5X-1原核表达载体中。经IPTG诱导后,重组质粒pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199,分别表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的MBP-KIAA1199融合蛋白和含重组谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白GST-KIAA1199。其中,MBP-KIAA1199融合蛋白经纯化后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;GST-KIAA1199融合蛋白用于检测抗体特异性。此后应用ELISA及Westernblot方法鉴定该抗体。结果 pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KI-AA1199两个重组质粒构建成功,并获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论成功制备了KIAA1199抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础。     

人血浆蛋白S成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的 构建人血浆蛋白S的原核表达载体并诱导其表达。方法 自行设计引物，采用PCR法，以现有人血浆蛋白S真核表达载体为模板，扩增人血浆蛋白S成熟肽的编码序列。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，克隆至GST融合表达载体pGEX-2T中，在E．coli BL21中诱导GST-人血浆蛋白S融合蛋白的表达。结果 对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Gen Bank登录的人血浆蛋白S基因编码序列完全一致。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达分子量约为96kD的产物．并可通过GST亲和层析柱纯化。结论 人血浆蛋白S编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达。     

Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备鼠抗重组半乳糖凝集素7(Galectin-7)多克隆抗体及其在膀胱癌组织中特异性鉴定。方法 PCR法从人包皮组织中扩增Galectin-7基因,并构建到pET28a表达载体中,使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得Galectin-7蛋白。以纯化的Galectin-7蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠制备抗体,并用ELISA,Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果 成功表达、纯化了Galectin-7重组蛋白,ELISA检测Galectin-7蛋白免疫的小鼠血清效价为1:32 000,Western blot显示该抗体能与天然的Galectin-7特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人膀胱肿瘤组织的天然Galectin-7。结论 通过制备重组Galectin-7蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗Galectin-7多克隆抗体。     

人B型钠尿肽原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人B型钠尿肽(Human B-type Natriurtic Peptide,BNP)原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定。方法根据已报道的人BNP基因序列,采用RT-PCR技术从人心肌组织中获得B型钠尿肽cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-T-easy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pGEX-6P-1中并转化大肠杆菌E.coliBL21,通过IPTG诱导表达出带有GST-BNP的融合蛋白。经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化融合蛋白。结果序列分析表明,人B型钠尿肽基因活性肽编码区含有96bp,编码32个氨基酸,与GenBank(NM002521)中已报道的BNP核苷酸序列一致。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的30%,相对分子质量约为29KD,并与商品化的人BNP单抗呈特异性反应。经Glu-tathione Sepharose4B纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论获得了人GST-BNP蛋白,为制备BNP检测试剂奠定了基础。     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体（LYVE-1）具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒（pPICZα-LYVE-1）;经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞（GS115）中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析及免疫印迹试验（Western blot）鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体(LYVE-1)具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒(pPICZα-LYVE-1);经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞(GS115)中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及免疫印迹试验(Western blot)鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70 000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的克隆、表达及鉴定

[目的]构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的重组质粒,进行原核表达.[方法]以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增sTNFRl全编码区基因片段,构建舍有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质拉菌表达sTNFR1,以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blotting对重组蛋白进行分析鉴定.[结果]经核苷酸序列测序和Western-blot鉴定,成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌,表达了具有sTNFR1免疫活性的融合蛋白.[结论]构建了人sTNFR1重组质粒克隆,获得了具有sTNFR1的免疫活性的融合蛋白,为今后的研究打下了基础.