等位基因特异性PCR检测人线粒体DNA11778突变位点及其临床意义

人线粒体ＤＮＡ(ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ ,ｍｔ ＤＮＡ)的第11778位点突变与Ｌｅｂｅｒ氏遗传性视神经萎缩疾病(Ｌｅｂｅｒ’ｓｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｏｐｔｉｃｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ,ＬＨＯＮ)的发生密切相关[1] 。本文报道应用等位基因特异性ＰＣＲ方法检测该突变位点的结果并探讨其临床意义。1　材料与方法1 1　研究对象　 5份已知第 11778位核苷酸从Ｇ突变为Ａ的ｍｔ ＤＮＡ ,为阳性对照 ;2 0份临床诊断为视神经萎缩疾病患者 (男 13人 ,女 7人 )和 2 1份来自被检出存在 11778突变位点的患者亲属 (男 12人 ,女 9人 )抗凝血为待…     

双向等位基因特异性PCR快速区分纯合子和杂合子SNP分型的新方法

目的 建立一种基于单碱基改变基因分型的快速检测等位基因特异性双向PCR原理的改良SNP分型新方法:双向等位基因特异性PCR(Bi-PASA)在一次PCR反应中区分纯合子和杂合子的方法.方法 以SNP位点rs11293201和rs57148397为例,设计两个外部引物(F与R)和两个内部等位基因特异性引物(P与Q).同时与测序方法对比检测突变.结果 两个内部引物(P和Q)包含一个相对短的完全匹配区域和一个富含Gc的10核苷酸5'尾.当基因组DNA被先期扩增出的模板DNA取代时内引物完成从低效扩增到高效扩增的转变,其结果与直接测序完全一致.利用Bi-PASA参数的优化在人类SIP1基因常见突变的外显子中详细研究先天性巨结肠病,3种额外的Bi-PASA分析被快速优化.结论 Bi-PASA是一种简单快速而有效的SNP分型新方法,是在一个PCR反应中检测已知突变的方法.     

等位基因特异性PCR法对血液和肿瘤组织EGFR基因突变的比较

目的采用等位基因特异性PCR法检测肺癌患者循环肿瘤DNA(ctDNA)和肿瘤组织样本中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变,分析两者关系及检测ctDNA EGFR突变的临床应用价值。方法收集22例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的血液样本和肿瘤组织样本,提取相应血浆游离DNA(cfDNA)和肿瘤组织DNA(tDNA),通过等位基因特异性PCR法分别检测EGFR第18~21号外显子突变,并将两种样本结果进行比较分析。结果 22例NSCLC中,8例血液样本存在EGFR突变,突变率36.4%(8/22);13例肿瘤组织样本有EGFR突变,突变率59.1%(13/22);16例血液样本和肿瘤组织样本EGFR检测结果完全一致。以tDNA检出结果为标准,ctDNA诊断EGFR基因突变敏感度为61.5%,特异度为100%;与tDNA结果的一致率为72.7%。结论等位基因特异性PCR法检测ctDNA的EGFR基因突变,为无法获取肿瘤组织标本患者提供新的检测机会。     

片段长度差异等位基因特异性PCR研究贵州汉族群体EsD多态性

目的探讨建立检测EsD点突变rs9778的片段长度差异等位基因特异性PCR技术(Fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR),并调查贵州汉族群体遗传学参数。方法针对EsD基因点突变(NCBI Reference SNP ID:rs9778),设计片段长度差异等位基因特异性PCR引物进行扩增,经丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显带后分型,并调查175例贵州省汉族无关群体等位基因数。结果片段长度差异等位基因特异性PCR技术对EsD-rs9778亚型的3种基因型分型明确。贵州省汉族人群EsD-rs9778 A/G基因频率分别为0.651和0.349,基因型频率分别为1/1 0.434、1/2 0.434和2/2 0.132,Ho 0.434、He 0.457、PIC 0.351、DP 0.599、PEt 0.176 PEd 0.103,基因型分布符合HardyWeinberg平衡。结论片段长度差异等位基因特异性PCR技术对EsD-rs9778亚型的3种基因型分型明确,该位点多态性有实际应用价值。     

等位基因特异性和不对称PCR结合：一种快速诊断家族性apoB－100缺陷的一步PCR法

等位基因特异性和不对称ＰＣＲ结合：一种快速诊断家族性ａｐｏＢ－１００缺陷的一步ＰＣＲ法［英］／Ｓｃｈｕｓｔｅｒ．．．／／ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．－１９９２，２０４（１）．－２２～２５家族性ａｐｏＢ－１００缺陷（ＰＤＢ）是一种共显性遗传性疾病，导致血清...     

即时定量PCR法和等位基因特异性寡核苷酸PCR法检测肺腺癌EGFR基因第21号外显子L858R突变的对比性研究

自从Lynch等[1]和Paez等[2]发现肺癌细胞中上皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶编码区基因突变以来,研究证明具有EGFR基因第19号外显子(de1746-A750)缺失突变或第21号外显子L858R错义突变的肺癌患者使用酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼进行分子靶向治疗的有效率高达80%以上,而对于缺乏EGFR突变的患者采用上述治疗则基本无效[3].     

即时定量PCR法和等位基因特异性寡核苷酸PCR法检测肺腺癌EGFR基因第21号外显子L858R突变的对比性研究

自从Lynch等[1]和Paez等[2]发现肺癌细胞中上皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶编码区基因突变以来,研究证明具有EGFR基因第19号外显子(de1746-A750)缺失突变或第21号外显子L858R错义突变的肺癌患者使用酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼进行分子靶向治疗的有效率高达80%以上,而对于缺乏EGFR突变的患者采用上述治疗则基本无效[3].     

等位基因特异多重PCR快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究

了解北京地区异烟肼（INI-I）耐药结核分枝杆菌（MTB）的分子特点,评价等位基因特异多重PCR在INH耐药性快速检测中的应用价值。选取102株北京地区MTB临床分离株,首先分别采用PCR—RFLP和反向线性杂交技术（RLB）检测耐药相关基因katG和inhA突变,然后运用等位基因特异多重PCR方法同时检测katG和inhA基因突变,并与PCR—RFLP和RLB分别检测的结果进行比较。采用等位基因特异多重PCR检测发现,INH耐药株中60．3％（35／58）存在katG315突变,13．8％（8／58）发生了inhA突变,两者同时突变率为6．9％（4／58）,INH敏感株中没有发现katG315突变,而inhA突变率为18．2％（8／44）。上述检测结果与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果完全一致,且等于两种方法结果之和,提示等位基因特异多重PCR可完全取代PCR—RFLP和RLB。北京地区INH耐药菌株以katG315 AGC→ACC突变为主;联合检测katG315和inhA基因可提高INH耐药株的检出率。等位基因特异多重PCR操作简便,结果易于判断,可作为临床MTB菌株中INH耐药性快速检测的辅助手段。     

多重等位基因特异性PCR-熔解曲线分析快速定型β珠蛋白基因突变

目的建立自动化、高通量、准确快速检测β珠蛋白基因突变的技术。方法在反应体系中加入新型荧光染料LC Green进行实时荧光聚合酶链反应,反应结束后,以0.1℃/s变化速度从60℃至95℃每隔3 s记录一次荧光值,获得熔解曲线,根据得到的熔解曲线和Tm值分析定型β地中海贫血的CD41-42、IVS 2nt654、CD17、CD71-72四种等位基因突变。结果根据Tm值能准确判断基因型,检测CD41-42、IVS 2nt654、CD17、CD71-72四种等位基因的Tm值分别为78±1℃、80±1℃、76±1℃、79±1℃。结论该技术具有自动化程度高、不需荧光标记探针、成本低、易质控、防污染、高通量等优点,适于临床推广应用。     

二种CMV─PCR检测法

本文根据国内外已公开发表的ＣＭＶＡＤ１６９株、Ｔｏｗｎｅ株早期即刻抗原基因序列和引物序列以及ＰＣＲ热循环参数，在引物长度和热循环参数上稍作改进，推出双温和三温ＰＣＲ的二种不同的方法。这二种方法均能检出ＡＤ１６９株和Ｔｏｗｎｅ株。经初步应用效果较为满意。其中双温ＣＭＶ－ＰＣＲ检测能在８０分钟内发放报告。     

二种CMV—PCR检测法

本文根据国内外已公开发表的CMV AD169株、Towne株早期即刻抗原基因序列和引物序列以及PCR热循环参数，在引物长度和热循环参数上稍作改进，推出双温和三温PCR的二种不同的方法。这二种方法均能检出AD169株和Towne株。经初步应用效果较为满意。其中双温CMV—PCR检测能在80分钟内发放报告。     

提高PCR特异性的策略

PCR研究最初用大肠杆菌DNA聚合酶I的klenow片段来扩增人基因组DNA的特异性片段,但使用klenow片段进行的PCR其特异性程度不高。尽管一些独特DNA片段可由基因组DNA扩增约20万倍,但只有约1%的PCR产物是靶序列,因此还需     

用等位基因特异PCR筛查海南汉族人β-珠蛋白基因41-42缺失突变

用等位基因特异ＰＣＲ筛查海南汉族人β－珠蛋白基因４１－４２缺失突变周代锋韩建勋蔡望伟＊周玉英蔡兰洁马玉珠黄元华徐湘民β－地中海贫血是我国南方常见的遗传性疾病，其分子基础主要是β－珠蛋白基因点突变导致β－珠蛋白的合成减少或缺如。目前全世界已发现约１７０...     

PCR结合银染法检测载脂蛋白E等位基因

目的介绍一种高效、灵敏、安全的载脂蛋白Ｅ等位基因检测法。方法采用非酚法快速提取人全血基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增包含两个等位基因决定位点的ＤＮＡ片段，扩增产物经限制性酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，用简易银染法显示酶切片段。结果银染显示出清晰易辨的ＤＮＡ酶切小片段，整个检测过程２４小时完成。将此法初步用于１９例散发性阿尔茨海默病患者和４１名无精神神经疾患老年人载脂蛋白Ｅ等位基因的检测，测得ε４等位基因频率分别为０．２９和０．０２，两者之间差异非常显著（Ｐ＜０．００１）。结论ＰＣＲ结合银染法检测载脂蛋白Ｅ等位基因，在尽量避免使用有害试剂的同时，提高了检测灵敏度和效率，因此适用于临床及流行病学调查时对大批标本的检测     

用限制性位点特异性PCR(RSS-PCR)对登革病毒进行快速亚型分型

登革热是危害全世界大众健康的一个主要问题。它是由四种登革病毒血清型引起的,而每种血清型又可为不同的基因亚型,毒株分型对了解其流行病学以及与疾病传播有关的病毒因子是非常重要的。然而,对发展中国家来说,大多数现有的亚型分型方法是比较昂贵的,而且从技术上也...     

人卵巢癌P53等位基因丧失与突变

P53基因位于染色体17p13.1,是一种肿瘤抑制基因。已经发现,P53在多种人肿瘤中表现频繁的等位基因丧失与突变。卵巢癌是女性生殖系统中致死性最强的一种肿瘤。其发生的分子机理还不清楚。作者采用聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)和RFLP分析,研究了31例手术的原     

PCR—SSP快速检测胰腺癌Ki—ras基因点突变

为判定有Ｋｉ－ｒａｓ基因突变及突变方式，我们采用针对Ｋｉ－ｒａｓ基因点突变方式 顺序特异性引物，对冰冻胰腺癌组织进行聚合酶链反应。产物借助常规电泳即可判定有无Ｋｉ－ｒａｓ基因突变及突变方式，无需酶切，杂交，放射性及非放射性显影。