C57BL/6小鼠内耳形态学和年龄相关性听力损失的研究

目的探讨不同周龄C57BL/6小鼠内耳形态学及其ABR阈值变化。方法取C57BL/6小鼠3周、4周、12周、26周各10只,听性脑干反应(ABR)测试双侧2、4、8、16、20 kHz ABR阈值。采用基底膜铺片MyosinⅥ、Neurofilament免疫组化染色,观察耳蜗毛细胞和神经丝的变化。扫描电镜观察耳蜗毛细胞及其静纤毛随年龄的变化。结果随着年龄增长,C57BL/6小鼠各频率ABR阈值明显提高,顶转和底转内毛细胞缺失逐渐增多,神经丝染色渐淡,毛细胞静纤毛逐渐发生数量减少、增粗融合、倒伏等变化。到26周龄时已达到重度聋,各频率较3周组有显著统计学差异。顶转和底转内毛细胞有连续缺失,外毛细胞完全缺失,内毛细胞只有残存的少量静纤毛,粗细不均,倒伏明显。结论本研究对国产C57BL/6小鼠的内耳形态进行观察,明确了其ABR阈值和内耳毛细胞的变化规律,为用国产C57BL/6小鼠进行老年性聋研究提供了依据。     

不同日龄小鼠听性脑干反应和静纤毛形态的发育特性

目的：探讨不同日龄小鼠昆明种小鼠听功能和内耳毛细胞发育状况。方法；（1）测试不同日龄小鼠听性脑干反应（ABR)，比较阈值、I波潜伏期；（2）对不同日龄小鼠的耳蜗Corti器内外毛细胞静纤毛束的发育进行扫描电镜观察。结果：稳定的ABR波型出现于生后17d龄之小鼠，随着小鼠日龄增加，反应阈越来越低，I波潜伏期越来越短；17d左右，小鼠内外毛细胞静纤发育成熟。结论：小鼠内耳毛细胞静纤毛的发育与ABR发育具有同步性，显示了功能成熟和结构成熟的一致性。     

溶酶体保护蛋白/组织蛋白酶A基因敲除小鼠听力和耳形态学初步研究

目的研究溶酶体保护蛋白/组织蛋白酶A(protective protein/cathepsin A,PPCA)基因敲除小鼠听功能和耳形态学改变,探讨半乳糖唾液酸沉积症听力损害的病理生理机制。方法应用听性脑干反应(ABR)测试和颞骨连续切片,观察1月和2月龄的PPCA基因敲除纯合子(PPCA-/-)小鼠ABR反应阈和光镜下外耳、中耳及内耳形态改变,并以野生型(PPCA / )小鼠作对照。结果1月龄PPCA-/-小鼠ABR反应阈和耳形态无明显改变;2月龄时,短声和短音8、163、2 kHz反应阈较PPCA / 提高40~45 dB SPL,中耳黏膜增厚、听骨细胞囊泡化、变形和关节腔融合,血管纹增厚、螺旋神经节细胞、螺旋缘纤维细胞、前庭膜、基底膜及沿前庭阶外淋巴隙的间皮细胞囊泡化,但Corti器毛细胞及支持细胞正常。结论溶酶体保护蛋白/组织蛋白酶A缺乏可导致听力损害、中耳及耳蜗形态改变、中耳炎、听骨改变以及耳蜗螺旋神经节、血管纹、螺旋缘、前庭膜和基底膜等细胞的溶酶体储积,可能分别是传导性聋和感觉神经性聋的形成机制。     

TLR4基因敲除小鼠对噪声性耳蜗损伤的反应

目的揭示Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)基因缺失对噪声性耳蜗感觉细胞损伤,听觉功能障碍和耳蜗免疫活力的影响作用,探讨噪声性耳蜗损伤的免疫炎性机制。方法将TLR4基因敲除(TLR4 KO)小鼠接触持续噪声暴露(1-7kHz,120dB SPL)1小时,以噪声暴露的野生型(WT)小鼠为对照,检测噪声暴露前和噪声暴露后25天四个频率短纯音(4 kHz、8 kHz、16 kHz和32 kHz)诱发的小鼠双耳ABR阈值。噪声暴露后1天,25天处死动物,解剖取双侧耳蜗。采用白细胞共同抗原(CD45)荧光免疫抗体标记噪声暴露前和噪声暴露后1天耳蜗基底膜免疫细胞,鬼笔环肽(phalloidin)染色噪声暴露前和噪声暴露后25天耳蜗基底膜毛细胞纤毛、表皮板的丝状肌动蛋白。荧光显微镜下观察噪声暴露后TLR4 KO小鼠和WT小鼠耳蜗基底膜组织的巨噬细胞、单核细胞和毛细胞形态变化,计数耳蜗基底膜外毛细胞的缺失数目。结果噪声暴露后1天,WT和TLR4 KO小鼠耳蜗基底膜均呈现单核细胞渗入。噪声暴露后25天,不同频率短纯音诱发的TLR4 KO小鼠ABR阈移和耳蜗基底膜外毛细胞缺失数目均低于WT小鼠(F=71.590, df=1,90, P<0.001; Tukey test, P<0.001),(F=8.996, df=1,17, P=0.008; Tukey test, P=0.008)。结论噪声暴露后TLR4基因缺失没有阻止单核细胞渗入耳蜗基底膜,但减轻噪声暴露后耳蜗感觉细胞和听功能损伤的程度。     

年龄相关听力损失BALB／c小鼠耳蜗形态学观察

目的 探讨年龄相关听力损失小鼠耳蜗毛细胞形态学变化,建立年龄相关听力损失动物模型.方法 分别取3、6、12、18月龄BALB/c小鼠测定其听性脑干反应(ABR)阈值,应用耳蜗铺片和扫描电镜技术,观察不同月龄鼠耳蜗毛细胞计数和形态的变化.结果 3、6、12月龄鼠8 kHz ABR反应阈分别为(24.8±5.1)、(51.5±6.7)和(92.5±7.5)dB SPL.18月龄组120 dB SPL刺激声无诱发反应.耳蜗铺片毛细胞计数自6月龄组外毛细胞出现显著缺失,随月龄增加而加重,由底回逐渐向顶回发展,至12月龄时耳蜗底回和中回外毛细胞几乎完全丧失,内毛细胞显著缺失.扫描电镜显示6月龄组小鼠耳蜗毛细胞静纤毛可见不同程度的缺失、转位、散乱、倒伏、融合、变短现象,随月龄增加而逐渐加重.结论 BALB/c小鼠听力损失、耳蜗毛细胞缺失和纤毛损害随年龄增加而逐渐加重,可作为年龄相关听力损失研究的合适动物模型     

Smad4 基因缺陷小鼠耳形态学改变的初步研究

目的研究Smad4基因缺陷小鼠中耳及内耳的病理形态学改变，探讨Smad4基因对中耳及内耳发育的影响。方法利用建立的Smad4基因敲除嵌合体小鼠模型，通过火棉胶包埋HE染色观察Smad4（＋/＋）与Smad4（＋／-）小鼠的情况；通过耳蜗基底膜铺片琥珀酸脱氢酶染色观察Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的耳蜗内、外毛细胞数量；应用扫描电镜观察Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的内耳超微结构。结果火棉胶包埋HE染色显示：Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠耳蜗大小、耳蜗转数均未见异常，中耳鼓膜正常，听小骨锤骨、砧骨、镫骨及关节结构正常，骨细胞排列紧密，Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）之间没有差异。Smad4（＋／＋）小鼠耳蜗Corti器结构完整，未圯异常，血管纹厚薄均匀，血管腔腔径大小均匀。内、外毛细胞及内外柱细胞、支持细胞无异常，螺旋神经节细胞未见缺失；Smad4（＋／-）小鼠耳蜗钩端至-回外毛细胞轮廓不清，呈均质化，细胞核消失。Deiter细胞核下沉或消失，相应的螺旋神经节细胞大量缺失。耳蜗基底膜铺片琥珀酸脱氢酶染色显示：Smad4（＋／-）和Smad4（＋／＋）小鼠均有明显的局限于Corti’S器底同的外毛细胞缺失，其中Smad4（＋／-）小鼠外毛细胞的缺失，比Smad4（＋／＋）小鼠更明显（P〈0．01），两个基因型小鼠的内毛细胞均未见缺失。扫描电镜显示：Smad4（＋／＋）小鼠未见明显病理变化，Smad4（＋／-）小鼠耳蜗钩端外毛细胞静纤毛广泛散在性缺失，外毛细胞的表皮板穿孔、自溶，其周边与指状突小皮板断离。两个基因型小鼠耳蜗内毛细胞纤毛均未见明显改变。结论Smad4基因敲除后内耳形态发生明显改变，表明Smad4基因缺陷导致小鼠内耳细胞损害。     

出生后大鼠听毛细胞纤毛发育过程

目的观察新生大鼠（P1、P7、P14、P21）耳蜗Corti器的形态结构及排列方式,以便了解听毛细胞纤毛发育的过程。方法取新乍SD大鼠四个阶段的耳蜗,采刖扫描电镜对出生后大鼠耳蜗Corti器形态结构进行系统观察。结果发现这四个阶段在体犬鼠耳蜗毛细胞从出生至毛细胞完全发育成熟,绝大部分都是以一排内毛细胞和三排外毛细胞的方式排列的,只有少部分在局部发现多出几个外毛细胞形成第四排。毛细胞的形态结构及排列方式随着时间的改变逐渐发育成熟。P14这个阶段是个重要的时期,Corti器表面柱细胞头板增宽,表面的微绒毛减少,Deiter细胞表面微绒毛也减少,动纤毛从底圄至顶圈逐渐退化已经基本结束,P14这个阶段Corti器各个部分发育已经完全成熟：结论出生后14天之内。大鼠听毛细胞静纤毛和动纤毛与听器其他细胞形态结构仍不同程度地处于由不成熟到成熟的逐渐发育过程,为研究大鼠出生后Corti器的发育、听觉功能的建立和完善提供了比较可靠的形态学证据。     

Smad5 基因敲除小鼠耳蜗扫描电镜观察

目的观察Smad5基因敲除杂合（3月组2只小鼠4只耳蜗）子小鼠内耳形态学超微结构变化。方法野生型动物组：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组及3个月组各有2只小鼠4只耳蜗：杂合子动物组1个月组3只小鼠3只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗，3个月组3只小鼠6只耳蜗。按常规方法制成标本作扫描电镜观察。结果Smad5基因敲除杂合子小鼠扫描电镜观察：1月组耳蜗中均观察到耳蜗第一和第二圈外毛细胞有不同程度的静纤毛融合，未见外毛细胞缺失，内毛细胞未见明显地病理变化。2月组耳蜗中观察到第一和第二圈均可见内外毛细胞静纤毛不同程度缺失，有的部位以内毛细胞静纤毛缺失为主，而有的部位以外毛细胞静纤毛缺失为主，有的以片状缺失为主，有的则以散在性缺失为主。3个月组3只小鼠6只耳蜗中均观察到不同程度第一和第二圈内外毛细胞静纤毛广泛性缺失，有外毛细胞缺失的部位多，以第一排外毛细胞的静纤毛缺失为主．第二和第三排外毛细胞静纤毛多以散在性缺失为主，有内毛细胞缺失的部位多伴有外毛细胞静纤毛的大片状缺失。野生型动物组扫描电镜观察：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗均未观察到内外毛细胞缺失和静纤毛的变化，3月组有少量的外毛细胞缺失。结论野生型小鼠2个月以内耳蜗毛细胞无明显变化．杂合子小鼠随着月龄的增加内外毛细胞缺失的程度逐渐加重。     

Cu／ZnSOD基因敲除小鼠—研究耳蜗氧化损伤的理想模型

目的 确定一个理想的耳蜗氧化损伤模型。方法 对5只Cu/ZnSOD基因敲除纯合突变（Cu/ZnSOD无活性,Sod1-/-)小鼠和10只Cu/ZnSOD杂合突变（50％Cu/ZnSOD失活,Sold /-)小鼠及5只野生小鼠（Cu/ZnSOD活性正常,Sodl / )进行ABR检测及内、外毛细胞计数。应用PCR技术检测Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA缺失情况。结果 Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗内外毛细胞大量缺失（P＜0.001),ABR检测,Sodl-/-小鼠ABR阈值在8,16,32kHz及Sodl /-小鼠ABR阈值在16,32kHz明显增大（P＜0．001）。Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mDNA有三种缺失,分别为mtDNA 3867bp、mtDNA3726bp及mtDNA 4326bp缺失。结论 Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗在细胞及分子水平上的表现出受到ROS损伤的改变,是一个理想的耳蜗氧化损伤模型。     

大鼠内耳Corti氏器扫描电镜样品的制备与观察

本文首次报告非脱钙的大鼠耳蜗Corti氏器扫描电镜样品制备方法,观察和测量了听毛细胞静纤毛及其表面结构。结果表明,经本方法制备的样品,Corti器表面超微结构保存良好,显示清晰。大鼠耳蜗可根据外毛细胞静纤毛特点分为顶、中、底三个区域。本文认为,以Corti氏器表面超微结构特征为标志的耳蜗分区法对于研究和分析听毛细胞的生理功能及其病理改变具有重要意义。