应用重组信号蛋白14-3-3间接ELISA诊断日本血吸虫病

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3与成虫抗原(SjAWA)间接ELISA法分别检测51份急性和49份慢性日本血吸虫病患者和50份正常人血清,以上血清标本同时用SEA致敏的间接血凝试验(SEA-IHA)检测。再以3种方法检测30份华支睾吸虫感染者、24份卫氏并殖吸虫感染者和31份钩虫感染者血清,分析其交叉反应性。结果51份急性和49份慢性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3抗体阳性率分别为98.0%和91.8%;SjAWA的检出率分别为96.1%和90.0%;IHA的阳性率分别为98.0%和93.9%。经统计学分析,以上结果无显著性差异(P>0.05)。Sj14-3-3间接ELISA、SjAWA间接ELISA和SEA-IHA对于30份华支睾吸虫感染者的交叉反应性分别为13.3%、20.0%和16.7%,24份卫氏并殖吸虫感染者分别为8.3%、12.5%和12.5%,31份钩虫感染者分别为12.9%、16.1%和12.9%。经统计学分析结果也无显著性差异(P>0.05)。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法诊断日本血吸虫病,具有高度的敏感性和特异性,可用于血吸虫病的免疫诊断。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其单克隆抗体用于诊断的价值

目的探讨纯化的日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其相应单克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。方法利用纯化的rSj14-3-3抗原和可溶性虫卵抗原(SEA)间接ELISA方法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清中特异性抗体;以纯化的抗rSj14-3-3单克隆抗体包板,以兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶标夹心法检测患者血清中的循环抗原。结果用rSj14-3-3检测急、慢性血吸虫病患者血清中特异性抗体的阳性率分别为100%和933%,用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原的阳性率分别为100%和956%,两者联合检测的总阳性率分别为100%和978%;经治疗后2、4、6、12个月,抗体转阴率分别为387%、548%、75%、90%,血清循环抗原转阴率分别为177%、419%、55%、85%,两者联合检测的总转阴率分别为452%、63%、85%、90%;对正常人血清的检测未见假阳性反应,与华支睾吸虫病和钩虫病患者血清出现轻微的交叉反应;用SEA检测抗体的阳性率分别为978%和956%,与正常人及华支睾吸虫病和钩虫病患者血清均有不同程度的交叉反应,治疗后2、4、6、12个月阴转率分别为32%、65%、125%、15%。结论rSj14-3-3检测急慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体和利用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原具有高度的特异性和敏感性,抗原和单抗可规模化     

日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3的制备及其特性分析

目的制备可溶性重组日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3（rSj14-3-3）,并研究其免疫学特性。方法采用反转录聚合酶链反应方法从日本血吸虫成虫mRNA中制备Sj14-3-3基因cDNA片段,将此cDNA片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-3的谷胱甘肽还原酶的基因下游,构建重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3。重组质粒转化大肠埃希菌BL21,转化子细菌采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导,表达产物经SDS-PAGE以观察重组GST-Sj14-3-3表达情况。GST-rSj14-3-3经凝血酶消化后,经过Glutathione Sepharose-4B胶亲和层析制备纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3免疫家兔制备免疫兔血清,经免疫印迹试验分析rSj14-3-3免疫原性和反应性。结果日本血吸虫江苏株Sj14-3-3蛋白基因编码序列被成功克隆,开放阅读框的DNA序列与基因库中的登录序列同源性为99.08%。构建的含Sj14-3-3蛋白基因的重组表达质粒经IPTG诱导能表达分子量约为55 kDa的融合蛋白,融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析获得纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3能诱导家兔产生高效价的特异性抗体,该抗体可识别重组和天然的14-3-3蛋白。结论本研究成功制备了可溶性rSj14-3-3,其具有良好的免疫原性与反应性。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 - 3- 3(rSj14 - 3- 3)DNA作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能。方法　碱裂解法大量制备rSj14 - 3- 3和rSjGSTDNA ,将两种DNA分别免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验。 结果　在尾蚴攻击感染 6w后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率 ,rSj14 - 3- 3DNA组为 34 2 0 % ,rSj14 - 3- 3+rSjGSTDNA组为32 4 0 % ;减卵率为 (按以上组序 ) 5 0 74 %和 5 5 2 3%。结论　重组Sj14 - 3- 3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能 ,有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗 ,但未见Sj14 - 3- 3、SjGST两种重组DNA的协同作用。     

RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因诊断急性日本血吸虫病的初步研究

目的探讨RT PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14 3 3抗原编码基因用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值。方法从急性日本血吸虫病患者血清中提取总RNA,利用RT PCR方法扩增Sj26、Sj32和Sj14 3 3抗原编码基因,用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以华支睾吸虫病患者血清、卫氏并殖吸虫病患者血清和正常人血清总RNA作为对照。结果50份急性日本血吸虫病血清均通过RT PCR扩增出了400bp的Sj14 3 3抗原编码基因片段,但未扩增出676bp的Sj26和1 270bp的Sj32抗原编码基因片段;对照组呈阴性反应。RT PCR扩增Sj14 3 3抗原编码基因片段敏感性和特异性均为100%,与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清未见交叉反应。结论RT PCR扩增Sj14 3 3抗原编码基因可用于急性日本血吸虫病的基因诊断。     

RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于慢性日本血吸虫病诊断的研究

目的探讨RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于慢性日本血吸虫病诊断的价值。方法从慢性日本血吸虫病患者血清中提取总RNA,用RT-PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因,以1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、泡型包虫病、囊型包虫病、乙型肝炎、肺结核患者血清和健康人血清作为对照。结果 RT-PCR扩增出约400 bp的Sj14-3-3抗原编码基因片段,但未扩增出676 bp的Sj26和1 270bp的Sj32抗原编码基因片段。对照组呈阴性反应。结论 RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因可用于慢性日本血吸虫病的基因诊断。     

PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于急性日本血吸虫病诊断的研究

目的探讨PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因用于急性日本血吸虫病诊断的价值。方法从急性日本血吸虫病患者血清中提取DNA,PCR扩增Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因,用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时以华支睾吸虫病患者、卫氏并殖吸虫病患者和正常人血清DNA作为对照。结果用急性日本血吸虫病患者血清DNA做PCR,扩增出1条约400 bp的Sj14-3-3抗原编码基因片段,但未扩增出676 bp的Sj26和1 270 bp的Sj32抗原编码基因片段,对照血清DNA PCR扩增均阴性。结论 PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因可用于急性日本血吸虫病的基因诊断。     

日本血吸虫复合B细胞表位抗原的制备和鉴定

目的 制备日本血吸虫复合B细胞表位抗原，并对其抗原性进行鉴定。 方法 用生物信息学软件（BioSun）预测已报告的日本血吸虫Sj22.6、Sj14?鄄3?鄄3、Sj26等3个B细胞表位片段的基因序列（P2、P6、P7），用随机顺序法连接3个片段，克隆入高效融合表达载体pET-32c（+）中，转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，经酶切及基因测序鉴定重组子。阳性克隆经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱纯化，用蛋白质印迹（Western blotting）分析该表达产物的抗原性。 结果 3个目的表位基因片段按P2-P6-P7和P6-P2-P7的顺序连接为2条复合表位片段（表位间由6个氨基酸组成的柔性接头连接），成功克隆入pET-32c（+）。其重组子均可表达相对分子质量（Mr）约20 400的融合蛋白。亲和层析纯化的融合蛋白经十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示为单一条带（Mr 20 400），Western blotting分析显示，这2条重组复合表位蛋白均可被日本血吸虫病患者血清识别，而不与健康者血清反应。 结论 获得2个具有日本血吸虫病诊断潜在价值的复合B细胞表位抗原。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的初步探讨重组信号蛋白14-3-3及14-3-3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。方法用rSj14-3-3和rSj14-3-3／SjGST免疫BALB／c小鼠，日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染，收集实验组与对照组成虫和虫卵，计算减虫率和减卵率；间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化；显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小，观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。结果上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为31．93％和34．39％；每克肝组织减卵率分别为53．24％和60．06％，每对成虫减卵率分别为33．39％和40．48％；免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性，免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组；实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降35．23％和46．13％。结论信号蛋白14-3-3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用，复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

伯氏疟原虫pbmag-1基因片段克隆及原核表达优化

目的 克隆并表达伯氏疟原虫pbmag-1基因cDNA片段。 方法 在GenBank中检索伯氏疟原虫编码基因pbmag-1部分cDNA序列, 设计特异引物， 经RT-PCR从伯氏疟原虫ANKA株扩增出该基因的部分cDNA片段。 以锚定Oligo dT引物反转录mRNA获得的cDNA为模板， 利用已知序列设计特异引物， 通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术延伸pbmag-1 3′端未知的编码序列， 并将其克隆于原核表达载体后转入大肠埃希菌（E. coli）BL21-(DE3)-RIL 株, 经优化诱导条件， 表达了重组蛋白PbMAg-1并用其免疫小鼠。 结果 获得1 341 bp具有完整3′末端序列的pbmag-1基因片段, 其A/T含量为73%。以包涵体形式表达的重组蛋白免疫小鼠， 其血清抗体经蛋白质印迹（Western blotting）分析, 能特异性地识别伯氏疟原虫感染红细胞相对分子质量约为Mr 64 000的蛋白。 结论 获得重组蛋白PbMAg-1的3′端完整的pbmag-1基因cDNA片段, 为研究伯氏疟原虫PbMAg-1蛋白在鼠疟免疫反应中的作用奠定了实验基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号转导蛋白epsilon亚型基因[Parasitol1]真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK一Sj14—3—3，为进一步对重组蛋白的融合表达及保护性免疫的研究提供条件。方法 根据日本血吸虫14—3—3蛋白的核苷酸序列。设计合成一对引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板，用RT-PCR法合成日本血吸虫中国大陆株14-3—3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM—T载体，经双酶切及PCR鉴定后，再亚克隆入pBK—CMV真核表达质粒，构建重组质粒pBK-Sj14—3—3，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果 RT-PCR产物、pGEM—T-Sj14—3—3及pBK-Sj14—3—3分别经双酶切均获得一特异性基因片段．经测序分析后该片段具有一个753bp完整开放阅读框(open reading frame，ORF)，由此推导的氨基酸序列具有多种蛋白激酶的磷酸化位点。结论 成功地构建了日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒。并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

日本血吸虫rSj14-3-3疫苗和rSj26 GST疫苗联合免疫保护作用研究

目的观察日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)疫苗和重组M r2600谷胱甘肽S转移酶(rSj26GST)疫苗联合免疫对小鼠的保护作用。方法将含有Sj14-3-3和Sj26GST编码基因的菌株E.coliBL21/p ET28a涂布LB/Kana/IPTG/X-gal平板,培养、收集细菌、超声碎菌、分离、纯化,分别取5μL进行SDS-PAGE,观察纯化结果,采用BCA法测定重组蛋白的浓度。联合免疫组BALB/c小鼠分别在第0、2、4周用rSj14-3-3疫苗rSj26GST疫苗联合免疫;而单独免疫的rSj14-3-3组及rSj26GST组,与上组同步各自免疫3次。末次免疫后2周进行感染攻击,45d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵。同时设PBS对照组。计算各组间的减虫率和减卵率,以及虫卵肉芽肿的大小。结果联合免疫组的减虫率为38.38%,显著高于rSj14-3-3(16.98%)和rSj26GST组(26.80%)(P0.01)。联合免疫组以及rSj14-3-3、rSj26GST组减卵率分别为48.81%、25.27%、41.41%;联合免疫组rSj14-3-3和rSj26GST组,肝组织中每条雌虫平均产卵数显著低于PBS对照组(P0.01)。联合组小鼠虫卵肉芽肿的直径为(173.9±35.0μm),显著小于对照组(267.7±28.6μm)(P0.01),联合组亦明显低于rSj14-3-3和rSj26GST组(P0.01)。结论联合免疫组的保护作用优于rSj14-3-3和rSj26GST单独免疫组。且联合免疫疫苗具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用。     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的　构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法　用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果　获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论　日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 ,为进一步研究其免疫保护作用和信号转导奠定了基础     

重组Sj14-3-3,SjGST及mIL-12/聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)缓释微球对小鼠免疫保护性的研究

目的研究聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球给药系统在血吸虫病分子疫苗中的应用,并探讨rSj14-3-3,rSjGST及mIL-12作为疫苗的协同作用,及mIL-12刺激机体产生CTL和辅助性T细胞(Th)在抗血吸虫病中的作用。方法从pET28a/Sj14-3-3和GST重组质粒中诱导表达rSj14-3-3及rSjGST,过柱纯化。构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)mIL-12,并共同包入PLGA缓释微球。对制备的微球进行体外释放,观察其释放速度。分组免疫BALB/c小鼠,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6w后,剖杀小鼠,计算各组的减虫率。结果各组的减虫率:单独rSj14-3-3组为27.6%,rSj14-3-3+PcDNA3.1(+)mIL-12组34.9%,rSj14-3-3+PcDNA3.1(+)mIL-12PLGA微球组37.5%,rSj14-3-3与rSjGST混合后+PcDNA3.1(+)mIL-12PLGA微球组38.8%;各组减卵率分别为(按以上组序)35.3%,49.1%,50.5%,和43.1%。结论PLGA微球给药系统可诱导并调节体液与细胞免疫从而增强了疫苗的抗感染,抗生殖作用。但rSj14-3-3和rSjGST抗原之间未表现出协同作用。mIL-12刺激机体产生CTL和辅助性T细胞(Th),在BALB/c鼠抗血吸虫攻击感染发挥作用,增强了疫苗保护作用。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。