2018-2020年山东省甲型H1N1流感病毒NA基因变异和耐药分析北大核心CSCD

目的监测山东省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变化及其对神经氨酸酶抑制剂(NAIs)的耐药情况。方法从山东省2018-2020流感监测年度中选取20株甲型H1N1流感病毒,提取病毒核酸后对NA基因进行测序,利用生物信息学软件分析NA基因上与耐药有关的氨基酸位点及其基因变异情况。利用荧光法对选取的流感病毒进行生物学耐药试验,检测病毒对奥司他韦和扎那米韦的敏感性。结果选取的20株甲型H1N1流感病毒中有1株奥司他韦耐药(IC50值为233.8nmol/L),其余19株流感病毒对奥司他韦均敏感,IC50平均数为0.34nmol/L(0.14~0.81 nmol/L)。20株甲型H1N1流感病毒均对扎那米韦敏感,对扎那米韦IC50平均数为0.31nmol/L(0.13~0.69nmol/L)。NA基因测序显示奥司他韦耐药株存在H275Y基因变异。山东省近两个监测年度甲型H1N1流感病毒同源性较高,在进化树上交叉分布,与疫苗株亲缘关系较近,且未出现处于NA蛋白抗原决定簇区域内的变异。结论山东地区甲型H1N1流感病毒对NAIs耐药比例较低,临床上可继续使用此类药物,并需加强耐药性监测。     

福建省甲型H1N1流感病毒分离及首例分离株全基因组序列分析

目的分离甲型HIN1流感病毒,分析福建省首例病毒分离株全基因组序列和遗传特征,为研究病毒进化、致病性、流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞和Real—time PCR法进行病毒分离、鉴定;提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其8个基因片段,测定核苷酸序列,利用生物信息软件拼接全基因组序列;分析重要基因位点,利用GENBANK中相关序列对首例病毒分离株A／Fujian／01／2009（H1N1）进行基因进化树分析。结果从82例甲型H1N1流感确诊病例标本中分离出50株甲型H1N1流感病毒,第一代分离阳性率60．98％。在福建省首次获得甲型H1N1流感病毒株及全基因组序列。基因组序列分析证明：该毒株与2009年大流行株高度同源,其基因组存在四源重组现象;氨基酸位点分析其对达菲药物敏感,对金刚烷胺类药物耐药;相对于猪流感代表株A／Swine／Iowa／15／1930（HIN1）存在6个HA抗原决定簇位点变异。结论MD—CK细胞对甲型H1N1流感病毒具有较高敏感性;福建省首例甲型H1N1流感病例分离病毒株与北美流行株高度同源;相对于以往古典型猪流感代表株出现了HA蛋白抗原性漂移;为今后进一步开展甲型H1N1流感病毒分子生物学研究奠定基础。     

2019年广州市甲型H1N1流感病毒全基因组序列的遗传特征分析

目的 对甲型H1N1流感病毒进行基因组全序列遗传特征分析,为流感的科学防控提供新数据。方法 选取7株2019年广州市甲型H1N1流感病毒进行全基因组序列测定,分析其遗传特征。结果 7株病毒的核苷酸同源性最高为PB2基因(98.8%~99.9%),最低为NA基因(97.3%~99.2%)。总体上,不同月份的H1N1流感分离株在遗传进化上以时间分布为聚类特征,特别是2019年6月份以后的H1N1分离株与我国使用的2020-2021年疫苗推荐株A/Guangdong-Maonan/1536/2019 (H1N1)亲缘关系最近,位于同一进化分支。疫苗株所在分支的分离株除PA和M1蛋白外,其余蛋白均有不同数量的相同特异性氨基酸突变。分离自监测哨点医院流感样病例的毒株与社区流感暴发疫情的毒株属于同一进化分支。全基因组8片段的遗传进化树显示,未发现不同基因来源的基因重配现象。结论 广州市甲型H1N1流感疫情流行株与门诊监测流行株高度同源,进化起源相同。全基因组序列上推荐疫苗株与流行株匹配性较好,未发现基因重配现象。     

2018-2020年山东省甲型H1N1流感病毒NA基因变异和耐药分析

目的监测山东省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变化及其对神经氨酸酶抑制剂(NAIs)的耐药情况。方法从山东省2018-2020流感监测年度中选取20株甲型H1N1流感病毒,提取病毒核酸后对NA基因进行测序,利用生物信息学软件分析NA基因上与耐药有关的氨基酸位点及其基因变异情况。利用荧光法对选取的流感病毒进行生物学耐药试验,检测病毒对奥司他韦和扎那米韦的敏感性。结果选取的20株甲型H1N1流感病毒中有1株奥司他韦耐药(IC_(50)值为233.8 nmol/L),其余19株流感病毒对奥司他韦均敏感,IC_(50)平均数为0.34 nmol/L(0.14～0.81 nmol/L)。20株甲型H1N1流感病毒均对扎那米韦敏感,对扎那米韦IC_(50)平均数为0.31 nmol/L(0.13～0.69 nmol/L)。NA基因测序显示奥司他韦耐药株存在H275Y基因变异。山东省近两个监测年度甲型H1N1流感病毒同源性较高,在进化树上交叉分布,与疫苗株亲缘关系较近,且未出现处于NA蛋白抗原决定簇区域内的变异。结论山东地区甲型H1N1流感病毒对NAIs耐药比例较低,临床上可继续使用此类药物,并需加强耐药性监测。     

2018-2019年克拉玛依市新甲型H1N1流感病毒NA基因分析

目的 分析新疆克拉玛依市新甲型H1N1流感病毒NA基因特征及变异情况.方法 采集2018年1月-2019年12月哨点医院流感样病例咽拭子,经MDCK细胞完成流感病毒分离后,随机抽取26株分离株测定其NA基因序列,并与疫苗株进行序列比对和分析.结果 与疫苗株A/Michigan/45/2015 NA基因核苷酸相比,2018年分离株与其同源性为98.56％～99.28％,2019年分离株与其同源性为98.35％～98.71％;26株分离株与同期国内其他地区代表株和疫苗株A/Michigan/45/2015在同一进化分支;分离株T180699较疫苗株A/Michigan/45/2015少1个糖基化位点(42～44位),分离株T190041发生了I223V位点变异.结论 相对于疫苗株A/Michigan/45/2015,2018-2019年克拉玛依市新甲型H1N1流感病毒NA基因抗原决定簇、糖基化位点和耐药相关位点已有改变;应继续加强流感监测,密切关注其基因变异情况.     

2009年广东省新型甲型H1N1流行性感冒病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的 探讨2009年广东省新型甲型H1N1流行性感冒(流感)病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况.方法 从2009年广东省新型甲型H1N1流感患者中分离到病毒毒株共69株,提取病毒总RNA,RT-PCR扩增NA基因,并测序分析;同时从美国国立生物技术信息中心基因库检索获得 52株不同年代、不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用MEGA 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析.结果 2009年广东省新型甲型H1N1流感病毒NA基因与禽H5N1流感病毒同源性较高,为87.1%,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守;具有8个糖基化位点,其中5个位点有不同程度的氨基酸替换,但与2001年禽H5N1毒株的糖基化位点的氨基酸相同.结论 2009年广东省新型甲型H1N1流感病毒NA基因与禽H5N1流感病毒高度同源,与NA抑制剂的特异性结合位点未发生变化.     

2009年上海地区甲型流行性感冒流行及甲型H1N1病毒分离株变异分析

目的 了解2009年上海地区人群流行性感冒(流感)的流行特征和流行期间甲型H1N1分离株基因和抗原的变异.方法 采集2009年上海地区哨点医院和学校聚集性流感样患者咽拭子标本,接种犬肾细胞(MDCK细胞)分离流感病毒,直接荧光免疫法鉴定流感病毒型,RT-PCR法鉴定亚型,对部分甲型H1N1流感病毒进行血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等片段全基因测序,分析甲型H1N1流感病毒HA、NA等基因变异.结果 2009年上海地区冬春季人群流感中,季节性H1N1和H3N2流感同时存在,进入第32周时,甲型H1N1和季节性H3N2流感同时流行,第40周后主要是甲型H1N1流行.甲型H1N1流行株HA进化分析显示,不同区域、不同月份分离株互有穿插,上海地区分离株聚集成簇形成一个分枝,与西班牙、俄罗斯、丹麦等国的流行株接近.HA演绎推导氨基酸位点虽有变异,但都不位于抗原决定区域;NA基因演绎推导氨基酸位点未观察到274位点及与耐奥司他韦药物相关其他位点的变异;PB2蛋白氨基酸序列分析显示,第627位和第701位氨基酸分别是谷氨酸和天冬氨酸,为禽源流感病毒PB2蛋白氨基酸位点.结论 2009年上海地区冬春季人群流感,季节性H1N1和H3N2同时流行,夏秋季开始甲型H1N1、季节性H3N2在人群中同时流行,之后以甲型H1N1为主.甲型H1N1与早期分离株比较有一定变异,但尚未出现流行病学意义的抗原漂移株,仍表现为对人的高亲和力和低致病性特征.     

2009年上海地区甲型流行性感冒流行及甲型H1N1病毒分离株变异分析

目的 了解2009年上海地区人群流行性感冒(流感)的流行特征和流行期间甲型H1N1分离株基因和抗原的变异.方法 采集2009年上海地区哨点医院和学校聚集性流感样患者咽拭子标本,接种犬肾细胞(MDCK细胞)分离流感病毒,直接荧光免疫法鉴定流感病毒型,RT-PCR法鉴定亚型,对部分甲型H1N1流感病毒进行血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等片段全基因测序,分析甲型H1N1流感病毒HA、NA等基因变异.结果 2009年上海地区冬春季人群流感中,季节性H1N1和H3N2流感同时存在,进入第32周时,甲型H1N1和季节性H3N2流感同时流行,第40周后主要是甲型H1N1流行.甲型H1N1流行株HA进化分析显示,不同区域、不同月份分离株互有穿插,上海地区分离株聚集成簇形成一个分枝,与西班牙、俄罗斯、丹麦等国的流行株接近.HA演绎推导氨基酸位点虽有变异,但都不位于抗原决定区域;NA基因演绎推导氨基酸位点未观察到274位点及与耐奥司他韦药物相关其他位点的变异;PB2蛋白氨基酸序列分析显示,第627位和第701位氨基酸分别是谷氨酸和天冬氨酸,为禽源流感病毒PB2蛋白氨基酸位点.结论 2009年上海地区冬春季人群流感,季节性H1N1和H3N2同时流行,夏秋季开始甲型H1N1、季节性H3N2在人群中同时流行,之后以甲型H1N1为主.甲型H1N1与早期分离株比较有一定变异,但尚未出现流行病学意义的抗原漂移株,仍表现为对人的高亲和力和低致病性特征.     

2009年上海地区甲型流行性感冒流行及甲型H1N1病毒分离株变异分析

目的 了解2009年上海地区人群流行性感冒(流感)的流行特征和流行期间甲型H1N1分离株基因和抗原的变异.方法 采集2009年上海地区哨点医院和学校聚集性流感样患者咽拭子标本,接种犬肾细胞(MDCK细胞)分离流感病毒,直接荧光免疫法鉴定流感病毒型,RT-PCR法鉴定亚型,对部分甲型H1N1流感病毒进行血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等片段全基因测序,分析甲型H1N1流感病毒HA、NA等基因变异.结果 2009年上海地区冬春季人群流感中,季节性H1N1和H3N2流感同时存在,进入第32周时,甲型H1N1和季节性H3N2流感同时流行,第40周后主要是甲型H1N1流行.甲型H1N1流行株HA进化分析显示,不同区域、不同月份分离株互有穿插,上海地区分离株聚集成簇形成一个分枝,与西班牙、俄罗斯、丹麦等国的流行株接近.HA演绎推导氨基酸位点虽有变异,但都不位于抗原决定区域;NA基因演绎推导氨基酸位点未观察到274位点及与耐奥司他韦药物相关其他位点的变异;PB2蛋白氨基酸序列分析显示,第627位和第701位氨基酸分别是谷氨酸和天冬氨酸,为禽源流感病毒PB2蛋白氨基酸位点.结论 2009年上海地区冬春季人群流感,季节性H1N1和H3N2同时流行,夏秋季开始甲型H1N1、季节性H3N2在人群中同时流行,之后以甲型H1N1为主.甲型H1N1与早期分离株比较有一定变异,但尚未出现流行病学意义的抗原漂移株,仍表现为对人的高亲和力和低致病性特征.     

双碱基延伸法结合荧光偏振法快速检测新甲型HINl耐药位点方法的建立

目的建立一种利用双碱基延伸法与荧光偏振技术（Fluorescence polarization,FP）快速检测甲型H1N1流感病毒NA基因耐药突变位点的新方法。方法从GenBank随机下载30条甲型HINl的NA（neuraminidase）基因序列,通过MEGA分析,利用Primer Premier软件设计3条特异引物,其中一对引物通过RT—PCR用于扩增含有耐药位点H275Y的NA基因,第3条引物是应用双碱基延伸终止法与荧光偏振技术检测NA基因对达菲类药物耐药位点H275Y的突变情况,再随机选取50株甲型HINl流感病毒进行检测,与测序结果进行比对,验证检测结果的准确性。结果50株甲型H1N1流感病毒的NA蛋白第275位氨基酸均为组氨酸,未发生HY的替换,在灵敏度与特异性方面,与传统的基因测序结果一致性均达100％。结论本方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,能实现对耐药位点突变的快速、准确检测,可应用于与SNP相关疾病的快速分型和突变位点的实时监测和临床检测。     

2009-2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒基因变异分析

目的了解2009～2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的基因变异情况。方法选取2009～2013年哨点医院分离的新甲型H1N1流感病毒，进行HA和NA核苷酸序列测定，用Bioedit和MEGA version4．0分析软件进行基因种系进化特性分析。结果无锡地区2009～2013年种型H1N1流感病毒HA基因序列的同源性为98．9％～99．5％；氨基酸序列分析显示，无锡地区分离株第203位与国内、国际代表株比较发生氨基酸替换：S→T；第83位和321位与国内代表株相同，而与国际代表株不同，分别为S→P、V→I。NA基因序列与国内、国际代表株同源性为99．2％～99．8％；第87位和349位与国内代表株相同，而与国际代表株不同，分别为R→Q、D→G。结论通过对HA和NA基因序列的比对分析，2009-2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒流行株基因序列与国内、国际代表株高度同源。表明该地区近期不会发生新甲型H1N1流感大流行。     

Evolution of human influenza A viruses in nature: recombination contributes to genetic variation of H1N1 strains.

In June of 1977, a new influenza A pandemic was started by strains of the H1N1 serotype. Oligonucleotide fingerprint analysis of the RNA from viruses isolated during the early stage of this pandemic demonstrated that genetic variation among these 1977 strains could be attributed to sequential mutation [Young, J.F., Desselberger, U. & Palese, P. (1979) Cell, 18, 73-83]. Examination of more recent strains revealed that the H1N1 variants that were isolated in the winter of 1978-1979 differed considerably from the H1N1 viruses isolated the previous year. Oligonucleotide and peptide map analysis of the new prototype strain (A/Cal/10/78) suggested that it arose by recombination. It appears that only the HA, NA, M, and NS genes of this virus are derived from the earlier H1N1 viruses and that the P1, P2, P3, and NP genes most likely originate from an H3N2 parent. These data suggest that genetic variation in influenza virus strains of the same serotype is not restricted to mutation alone, but can also involve recombination (reassortment).     

Pandemic influenza 1918 H1N1 and 1968 H3N2 DNA vaccines induce cross-reactive immunity in ferrets against infection with viruses drifted for decades

Please cite this paper as: Bragstad et al. (2010) Pandemic influenza 1918 H1N1 and 1968 H3N2 DNA vaccines induce cross‐reactive immunity in ferrets against infection with viruses drifted for decades. Influenza and Other Respiratory Viruses 5(1), 13–23. Background Alternative influenza vaccines and vaccine production forms are needed as the conventional protein vaccines do not induce broad cross‐reactivity against drifted strains. Furthermore, fast vaccine production is especially important in a pandemic situation, and broader vaccine reactivity would diminish the need for frequent change in the vaccine formulations. Objective In this study, we compared the ability of pandemic influenza DNA vaccines to induce immunity against distantly related strains within a subtype with the immunity induced by conventional trivalent protein vaccines against homologous virus challenge. Methods Ferrets were immunised by particle‐mediated epidermal delivery (gene gun) with DNA vaccines based on the haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) and/or the matrix (M) and nucleoprotein genes of the 1918 H1N1 Spanish influenza pandemic virus or the 1968 H3N2 Hong Kong influenza pandemic virus. The animals were challenged with contemporary H1N1 or H3N2 viruses. Results We demonstrated that DNA vaccines encoding proteins of the original 1918 H1N1 pandemic virus induced protective cross‐reactive immune responses in ferrets against infection with a 1947 H1N1 virus and a recent 1999 H1N1 virus. Similarly, a DNA vaccine, based on the HA and NA of the 1968 H3N2 pandemic virus, induced cross‐reactive immune responses against a recent 2005 H3N2 virus challenge. Conclusions DNA vaccines based on pandemic or recent seasonal influenza genes induced cross‐reactive immunity against contemporary virus challenge as good as or superior to contemporary conventional trivalent protein vaccines. This suggests a unique ability of influenza DNA to induce cross‐protective immunity against both contemporary and long‐time drifted viruses.     

Rapid Detection and Differentiation of Swine-Origin Influenza A Virus (H1N1/2009) from Other Seasonal Influenza A Viruses

We previously developed a rapid and simple gold nanoparticle(NP)-based genomic microarray assay for identification of the avian H5N1 virus and its discrimination from other influenza A virus strains (H1N1, H3N2). In this study, we expanded the platform to detect the 2009 swine-origin influenza A virus (H1N1/2009). Multiple specific capture and intermediate oligonucleotides were designed for the matrix (M), hemagglutinin (HA), and neuraminidase (NA) genes of the H1N1/2009 virus. The H1N1/2009 microarrays were printed in the same format as those of the seasonal influenza H1N1 and H3N2 for the HA, NA, and M genes. Viral RNA was tested using capture-target-intermediate oligonucleotide hybridization and gold NP-mediated silver staining. The signal from the 4 capture-target-intermediates of the HA and NA genes was specific for H1N1/2009 virus and showed no cross hybridization with viral RNA from other influenza strains H1N1, H3N2, and H5N1. All of the 3 M gene captures showed strong affinity with H1N1/2009 viral RNA, with 2 out of the 3 M gene captures showing cross hybridization with the H1N1, H3N2, and H5N1 samples tested. The current assay was able to detect H1N1/2009 and distinguish it from other influenza A viruses. This new method may be useful for simultaneous detection and subtyping of influenza A viruses and can be rapidly modified to detect other emerging influenza strains in public health settings.